단일 DNA 분자에서 대규모 병렬 단백질 합성을 위한 펨토리터 물방울 배열

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Chemistry

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Summary

프로토콜의 전반적인 목표는 세포 없는 단백질 합성에 사용될 수 있는 1cm2 평면 기판에 1백만 개 이상의 주문, 균일, 안정 및 생체 호환 펨토리터 물방울을 준비하는 것입니다.

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Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

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Abstract

과학 계측의 공간 해상도 및 검출 감도의 발전으로 생물학적 및 화학 연구에 작은 원자로를 적용할 수 있습니다. 고성능 마이크로반응기의 수요를 충족하기 위해 펨토리터 액적 어레이(FemDA) 장치를 개발하고 대규모 병렬 세포 없는 단백질 합성(CFPS) 반응에서 적용을 예시했습니다. 2단계 오일 밀봉 프로토콜을 사용하여 손가락 크기의 영역 내에서 100만 개 이상의 균일한 물방울이 쉽게 생성되었습니다. 모든 액적은 친수성 바닥과 소수성 측벽으로 구성된 펨토리터 마이크로 챔버에 고정되었습니다. 하이브리드 소수성 소수성 구조와 전용 밀봉 오일 및 계면 활성제는 증발 손실없이 펨토리터 공간에서 펨토리터 수성 용액을 안정적으로 유지하는 데 매우 중요합니다. 펨토리터 구성과 FemDA 장치의 간단한 구조는 최소한의 시약 소비를 허용했습니다. 액적 반응기의 균일한 치수는 대규모 정량적 및 시간 과정 측정을 설득력 있고 신뢰할 수 있게 만들었습니다. FemDA 기술은 각 물방울에 있는 DNA 분자의 수와 CFPS 반응의 단백질 수율을 상관시합니다. 우리는 장치의 미세 제조, 펨토리터 방울의 형성, 현미경 이미지 데이터의 수집 및 분석에 대한 절차를 간소화했습니다. 최적화된 낮은 운영 비용을 갖춘 상세한 프로토콜은 표준 클린룸 시설과 기존의 형광 현미경을 갖춘 모든 사람이 FemDA 기술을 이용할 수 있게 합니다.

Introduction

연구원은 바이오/화학 반응을 수행하기 위해 반응기를 사용합니다. 원자로의 크기를 줄이고 시약 소비를 낮추면서 작업 효율을 높이기 위해 실험 처리량을 늘리기 위한 상당한 노력이 이루어지고 있습니다. 두 측면 모두 연구원들을 무거운 작업부하에서 해방시키고 비용을 절감하며 연구 개발 속도를 높이는 것을 목표로 합니다. 우리는 반응 량과 처리량의 관점에서 원자로 기술의 개발에 대한 명확한 역사적 로드맵을 가지고 : 단일 비커 / 플라스크 / 테스트 튜브, 밀리리터 튜브, 마이크로리터 튜브, 마이크로리터 8튜브 스트립, 마이크로리터 96/384/1536웰 플레이트, 미세유체 나노리터/피콜리터/펨톨리터 반응기1,,2,,3,,4,,5,6,7.,7 지난 수십 년 동안 반도체 산업의 집적 회로 칩에 트랜지스터의 특징 크기를 축소하는 유사, 바이오 / 화학 마이크로 반응기는 볼륨 감소 및 시스템 통합을 겪고있다. 이러한 소규모 도구는 세포 기반 또는 세포가 없는 합성 생물학, 바이오 제조 및 고처리량 프로토타이핑 및 스크리닝8,9,9,10,,11,,12에지대한 영향을 미쳤다. 이 논문은 독특한 물방울 어레이 기술 개발에 대한 최근의 노력을 설명하고 합성 생물학 및 분자 선별 커뮤니티14의기본 기술인 CFPS13에서의 적용을 보여줍니다. 특히, 우리는 의도적으로 모든 사람이 FemDA 장치에 액세스 할 수 있도록 최적화된 저비용 프로토콜을 제공합니다. 소형 화된 장치에 대한 저렴한 비용과 취급하기 쉬운 프로토콜은 대학의 교육 목적에 기여하고 기술을 전파하는 데 도움이 될 것입니다.

FemDA는 평면 유리 기판에 1cm2 당 106의 초고밀도에서 펨토리터 방울을 준비합니다. 우리는 기판상에 마이크로 챔버 어레이를 생성하기 위해 미리 정의된 위치에서 유리 기판에 소수성 폴리머, CYTOP15를코팅하고 선택적으로 에칭 (제거) CYTOP. 따라서, 생성된 마이크로챔버는 소수성 측벽(CYTOP) 및 친성 바닥(glass)으로 구성된다. 패턴 표면 위로 물과 기름이 순차적으로 흐르면 물을 밀고 마이크로 챔버로 밀봉 할 수 있습니다. 소수성 소수성 구조는 마이크로 챔버 외부의 물을 격퇴하고, 개별 미세 반응기를 격리하고, 펨톨리터 공간 내부에 작은 수성 용액을 유지하는 데 필수적입니다. 독특한 성질은 수유 물방울과 지질 이중층 마이크로컴파트먼트16,,17의제조를 성공적으로 위해 적용되었다. 프로토타입장치(16)에비해, 먼저 CYTOP 폴리머의 완전한 제거뿐만 아니라 유리 바닥의 완전한 노출을 실현하기 위해 미세 제조 공정을 최적화했습니다. CYTOP은 유리, 플라스틱 및 실리콘과 같은 기존 미세 반응기 재료보다 표면 장력 (19 mN /m)보다 낮은 특수 불소 폴리머입니다. 그것의 좋은 광학, 전기 및 화학 적 성능은 이미 미세 유체 장치(18,19,,20,,21,22, 22,,,,23,,24)의표면 처리에 활용되었다. FemDA 시스템에서는 CYTOP 표면에서 오일의 좋은 습윤을 달성하기 위해 오일의 표면 장력은 고체표면(25)보다낮아야 한다. 그렇지 않으면, 고체 표면과 접촉하는 액체 오일은 표면 위로 퍼지기보다는 구형이 되는 경향이 있다. 게다가, 우리는 몇몇 대중적인 퍼플루오로카본 오일 (예를 들면, 3M FC-40)16 및 하이드로 플루오로에테르 오일 (예를 들면, 3M Novec 시리즈)는 정량측정에 치명적이고 방울 중 교차 오염의 관점에서 의심할 것이다 CYTOP의 비정질 형태결과로 CYTOP를 용해할 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 다행히도, 우리는 낮은 (&19 mN/m) 표면 장력13을전시하는 생체 적합성 및 환경 친화적 인 오일을 확인했습니다. 또한 선택된 오일및 기능에 용해할 수 있는 새로운 계면활성제를 보다 낮은 농도(0.1%, 적어도 10배 이상 낮은 것으로 보고된 인기 대상자26,,27)13을발견했다. 그 결과 물/오일 인터페이스는 계면활성제에 의해 안정화될 수 있다. 오일의 높은 증발 속도 때문에, 오일플러시에 이어, 우리는 마이크로 챔버를 밀봉하는 첫 번째 오일을 대체하기 위해 또 다른 생체 적합성 및 환경 친화적 인 오일을 적용했다. 우리는 첫 번째 오일 (ASAHIKLIN AE-3000 와 0.1 wt % SURFLON S-386) "플러시 오일"과 두 번째 오일 (Fomblin Y25)을 각각 "밀봉 오일"이라고 부릅니다.

2단계 오일 밀봉 전략은 정교한 계측 없이 몇 분 안에 펨토리터 액적 배열의 견고한 형성을 실현할 수 있습니다. 증발 문제로 인해 피콜리터부피(28)보다작은 미세 반응기를 생성하는 것이 어려운 것으로 간주되고 있다. FemDA는 미세 반응기/물방울 의 제조에 사용되는 재료와 공정을 체계적으로 최적화하여 이 문제를 해결했습니다. 결과 물방울의 몇 가지 주목할 만한 특징은 높은 균일성 (또는 단백성), 안정성 및 펨토리터 척도에서 생체 적합성을 포함한다. 액적 볼륨의 변형 계수(CV)는 3%에 불과하며(미세한 이미지에 대한 비네팅 보정 없이), 세계에서 가장 작은 CV로, 이는 매우 병렬 및 정량적 측정을 보장합니다. 펨토리터 액적은 실온의 방울 중 교차 오염 없이 최소 24시간 동안 안정적이며, 이는 신뢰할 수 있는 타임코스 측정에 유용합니다. 생체 적합성에 관해서는, 이전에 어렵거나비효율적인,것으로 여겨졌던 펨토리터 액적물에서 단일 복사 템플릿 DNA로부터 다양한 단백질을 합성하는 데성공했다. 왜 FemDA에서 합성 될 수 있는 몇몇 단백질이 그밖 물방울 시스템에서 합성될 수 없는지 해명할 가치가 있을 것입니다. FemDA는 단순히 기술적 진보가 아니라 단백질 수율(액적의 형광 강도에 의해 반영되는)을 각 액적의 템플릿 DNA 분자 수와 연관시킬 수 있는 전례 없는 정량적 측정을 실현했습니다. 그 결과, FemDA 기반 CFPS의 형벌 강도의 히스토그램은 동일한 피크-투-피크 간격의 가우시안 분포의 합계에 의해 멋지게 장착될 수 있는 이산 분포를 보였다. 더욱이, DNA 분자의 상이한 수를 포함하는 물방울의 발생 확률은 푸아송분포(31)에딱 맞다. 따라서, 각 액적에서 상이한 단백질 수율은 이산 분포에 기초하여 정규화될 수 있다. 이 중요한 기능을 사용하면 효소 활동 정보를 다른 미세 반응기 플랫폼과 함께 사용할 수 없었던 명백한 강도와 분리할 수 있습니다. 기존 미세 유체 세포/물방울 선별 시스템은 완전 자동 정렬에 능숙하며 시료 집중에 능숙하지만 때로는 분석 양면32,,33에서비교적 광범위하거나 긴 꼬리 히스토그램만 출력할 수 있습니다. 당사의 고정정성 및 생체 적합성 FemDA 시스템은 미세 반응기 개발 분야에서 새로운 벤치마크와 높은 분석 표준을 설정합니다.

물방울의 제조에 사용할 수있는 오일과 계면 활성제는 여전히 매우 제한되어있습니다 34. FemDA에 설립된 ASAHIKLIN AE-3000과 SURFLON S-386의 조합은 수성 상과 오일 상13단계사이의 물리화학 적 인터페이스의 성장 무기고의 새로운 멤버이다. FemDA의 새로운 인터페이스는 물리적으로 안정적이고 화학적으로 불활성이며, 많은 종류의 단백질을 위한 복잡한 전사, 번역 및 번역 후 수정 기계와 생물학적으로 호환된다13. 대신 액적 설정에서 합성 할 수없는 단백질을 찾는 것이 오히려 매력적일 것입니다. 게다가, 시약의 비용 절감은 나노 리터 및 피콜리터 원자로 시스템35,,36보다펨톨리터 액적 시스템에서 더 분명하다. 특히, 주로 튜브 또는 외부 공급에 의해 발생 되는 큰 죽은 볼륨이 있을 것 이다, 미세 유체 방울 생성 시스템에 하지만 우리의 FemDA에. 어레이 형식은 빠르게 움직이는 오브젝트에 대한 단일 스냅숏이 아니라 모든 단일반응기(37)에대해 반복적이고 상세한 현미경 특성화(소위 고함량 분석과 유사)에 의해 선호됩니다. 펨토리터 스케일은 손가락 크기의 영역에 100만 개 이상의 원자로를 통합할 수 있었으며, 동일한 수의 나노리터 원자로(존재하는 경우)는 평방 미터 면적에 필요하며, 이는 의심할 여지 없이 이러한 시스템을 제조하거나 사용하는 것이 비실용적일 것입니다.

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Protocol

1. 펨토리터 마이크로 챔버 어레이 기판의 미세 제조

참고: 클린룸에서 다음과 같은 미세 제조 실험을 수행합니다. 클린룸에 들어가기 전에 장갑과 클린룸 슈트를 착용하십시오.

  1. 커버 유리 기판 청소
    1. 커버 글래스 스테인닝 랙에 커버 글래스를 놓습니다. 커버 글래스를 8M 수산화나트륨(NaOH)에서 실온(RT)에서 15분 동안 초음파 처리합니다.
      주의: 고농도의 NaOH는 피부와 눈에 매우 위험합니다. 스플래시 없이 부드럽게 처리하십시오.
    2. NaOH 용액에서 랙을 꺼내 물을 사용하여 커버 유리를 10 번 헹구십시오. 커버 글래스를 순수한 물에 보관하십시오.
      참고: 알칼리성 폐기물을 지정된 탱크에 폐기합니다. NaOH 용액은 원래 병으로 재활용할 수 있으며 최대 5회까지 사용할 수 있습니다.
    3. 에어 블로우 건으로 커버 글래스의 각 조각을 건조시.
    4. 말린 커버 유리를 200°C에서 5분간 굽습니다.
  2. 유리 표면의 실란화
    1. 드라이 스테닝 랙에 청소 된 커버 유리를 재설정합니다.
    2. PTFE 비커에 150mL의 에탄올을 넣습니다. 바늘(22G x 70mm)을 장착한 1mL 주사기를 사용하여 0.075mL(3-아미노프로필)의 트리에톡시실레인을 즉시 에탄올(즉, 0.05vol%)에 주입한다. 주사기를 여러 번 당기고 밀어 주사기 내부를 헹구세요. 바늘로 용액을 저어 균일하게 만듭니다.
      참고: (3-aminopropyl)triethoxysilane은 단단한 밀봉으로 2 년 동안 실온 및 1 atm 압력에서 보관 할 수 있습니다. 절대 에탄올은 사용 후 단단히 밀봉되어야합니다. 만료된 시약을 사용하지 않는 것이 좋습니다.
    3. RT에서 1h에 대한 0.05 vol % 아미노 알란 용액에 커버 유리를 배양.
    4. 순수한 물을 사용하여 커버 유리를 5번 헹구습니다. 커버 글래스를 순수한 물에 보관하십시오.
      참고: 지정된 탱크에 폐기물을 폐기합니다.
    5. 공기 타격 총으로 커버 유리의 각 조각을 건조.
    6. 말린 커버 유리를 알루미늄 호일에 놓습니다. 핫 플레이트에 커버 글래스를 80°C에서 5분간 굽습니다.
  3. 스핀 코팅 CYTOP 퍼플루오로폴리머
    1. 스핀 코터(그림 1A)의사용자 정의 진공 척에 커버 글래스를 놓습니다. 진공 스위치를 켜서 유리 기판을 고정합니다.
      참고: 진공 척의 설계는 직사각형(24mm × 32mm) 및 얇은(0.13-0.17 mm) 기판(도1A)에점성 폴리머의 균일한 코팅에 매우 중요합니다. 우리는 진공 채널에 연결하는 여러 구멍 (48 구멍, 각각 1mm 직경)이있는 직사각형 샘플 스테이지가 하나의 중앙 구멍으로 둥근 스테이지보다 더 잘 작동하는 것을 발견했습니다.
    2. 유리 기판의 중앙에 타입-A CYTOP 폴리머의 70-90 μL을 떨어 뜨립니다. 즉시 폴리머(도 1B)를스핀 코팅합니다.
      참고: 스핀 코팅 조건(3,400rpm, 30s)은 3 μm 두께를 제공합니다. 점성 액체용으로 설계된 마이크로파이펫을 사용하십시오. 마이크로파이프를 똑바로 세워 폴리머 드롭을 기판에 거의 완벽하게 동그라미로 만듭니다. 플런저가 아래로 이동함에 따라 파이펫 팁 내부에서 기포가 발생하는 경우가 많습니다. 거품으로 CYTOP의 마지막 한 방울을 떨어 뜨리지 마십시오.
    3. 유리 기판의 모서리를 잡고 손가락으로 코팅 된 유리를 집어 알루미늄 호일에 놓습니다.
    4. 커버 글래스의 나머지 모든 조각을 스핀 코팅하기 위해 1.3.1-1.3.3 단계를 반복합니다.
    5. 코팅된 유리를 80°C에서 30분간 굽은 다음 200°C에서 1시간 동안 굽습니다.
      참고: 이 처리는 CYTOP을 완전히 치료하고 CYTOP을 유리 표면에 공유결합합니다. 필요한 경우 장시간 베이킹 과정에서 잠재적인 먼지를 피하기 위해 알루미늄 호일로 만든 뚜껑으로 베이킹 영역을 덮습니다.
    6. 핫플레이트에서 CYTOP 코팅 커버 글래스를 제거하고 RT로 냉각하십시오. 불균일 코팅을 나타내는 기판을 폐기하십시오.
      참고 : 멋지게 코팅 된 CYTOP의 표면은 불규칙한 무지개 모양의 패턴(그림 1C)없이평평하게 보일 것입니다. 적절한 각도에서 육안 검사는 코팅 품질뿐만 아니라 평탄도를 신속하게 판단 할 수 있습니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
  4. 스핀 코팅 포토레지스트
    1. CYTOP 코팅 커버 글래스를 스핀 코터의 진공 척(1.3.1 단계 참조)에 놓습니다. 진공 스위치를 켜서 커버 글래스를 고정합니다.
    2. 기판의 중앙에 있는 포토레지스트의 0.2-0.3 mL를 떨어뜨립니다. 즉시 60 s에 대한 6,000 rpm에서 포토 레지스트를 스핀 코트.
      참고 : 거품으로 포토 레지스트의 마지막 한 방울을 떨어 뜨리지 마십시오. 스핀 코터가 더 높은 스핀 속도를 지원하는 경우 스핀 속도는 최대 7,500 rpm이 될 수 있으며 더 얇은 코팅을 달성할 수 있습니다. CYTOP의 낮은 표면 에너지는 대부분의 포토레지스트가 표면에 부착되는 것을 방지합니다. AZ P4903 포토레지스트를 사용할 수 없는 경우 AZ P4620 포토레지스트는 좋은 대안입니다.
    3. 두 손가락으로 기판의 모서리를 잡고 코팅 된 기판을 집어 들수 있습니다. 에탄올에 담근 깨끗한 와이퍼(도1D)를사용하여 기판 가장자리(종종 가장자리 비드 제거 또는 EBR라고도 함)에 가까운 과잉 포토레지스트를 닦아냅니다. 알루미늄 호일에 기판을 놓습니다.
      참고: EBR에는 아세톤이 권장되지 않습니다.
    4. CYTOP 코팅 커버 글래스의 나머지 조각에 대한 포토 레지스트를 스핀 코팅1.4.1-1.4.3 단계를 반복합니다. 코팅 된 유리의 모든 조각을 집어 들고 제대로 코팅되었는지 확인하기 위해 검사합니다.
      참고 : 멋지게 코팅 된 포토 레지스트의 표면은 불규칙한 패턴(그림 1D)없이평평하게 보입니다. 적절한 각도에서 육안 검사는 코팅 품질뿐만 아니라 평탄도를 신속하게 판단 할 수 있습니다. 비균일 코팅을 나타내는 기판은 아세톤, 2프로판올 및H2O를 순차적으로 세척하여 재활용하고 재사용할 수 있다.
    5. 코팅된 기판을 110°C에서 5분간 굽습니다.
    6. 핫플레이트에서 코팅된 기판을 제거하고 RT로 식힙니다. 포토 레지스트의 재수화를 위해 40%-60%의 상대 습도에서 30분 동안 방치하십시오.
      참고: H2O는 다음과 같은 광화학 반응에 필요합니다. 구운 포토레지스트는 포토레지스트 내부의 H2O 콘텐츠를 잃어버렸습니다. 재수화 공정을 통해 H2O가 공중에서 흡수될 수 있습니다. 상대 습도가 20% 이상 또는 80% 이상이면 재수화 공정에 적합하지 않습니다.
  5. 포토리스소그래피
    1. 재수화 대기 시간(1.4.6단계 참조) 마스크 정렬기를 시작합니다. 광원을 따뜻하게 합니다. 크롬 포토마스크를 로드합니다.
      참고: 사용 설명서를 따라 마스크 정렬기를 작동합니다. 상기 포토마스크는 EB 시설을 이용할 수 있는 경우 EB(EB) 리소그래피를 통해 제작될 수 있다. 또는 포토마스크를 현지 회사에 아웃소싱할 수 있습니다.
    2. 척(그림 1E)에재수화 기판(1.4.6단계를 완료한 후)을 적재한다.
    3. 노출 매개 변수를 설정합니다. 진공 접촉 모드에서 13mW/cm 2(h-line)의2 UV 강도로 25s의 기판을 노출한다. 그런 다음 기판을 내리고 커버 글래스 스테닝 랙(1.1.1 단계에서 사용된 랙과 동일한 랙)에 설정합니다.
    4. 1.5.2-1.5.3 단계를 반복하여 재수화 기판의 나머지 조각을 노출합니다.
  6. 개발
    1. 노출된 포토레지스트(도1F)를용해시키기 위해 5분 동안 기판을 개발한다. 이 기간 동안 4분의 시점에서 개발자의 랙을 한 번 부드럽게 흔들어 줍니다.
      참고 : 개발자는 AZ 300 MIF이었다. 대체 알칼리성 개발자(예: AZ 400 K)는 일반적으로 개발에 적용할 수 있지만 개발 조건(예: 시간, 온도, 동요)의 최적화가 필요합니다. 유리 비커를 개발자 컨테이너로 사용하지 마십시오.
    2. 10회 순수를 사용하여 기판을 헹구는다. 커버 글래스를 순수한 물에 보관하십시오.
      참고: 개발자를 지정된 탱크에 버리십시오.
    3. 공기 블로우 건으로 모든 기판을 철저히 건조시다.
  7. 반응성 이온 에칭
    1. 반응성 이온 에칭(RIE) 기계의 반응 챔버에 건조기판(1.6.3단계)을 놓는다.
      참고: 시설의 유지 관리 규칙에 따라 RIE 기계는 항상 켜져 있거나 매번 종료될 수 있습니다. 스위치가 꺼져 있으면 설명서에 따라 스위치를 켭니다.
    2. O2 플라즈마(도 1G)와포토 저항 발하 된 CYTOP에 식히기.
      참고: RIE 상태는 다음과 같습니다. O2 가스 유량: 50 cm; 챔버 압력: 10.0 Pa; RF 전원: 50 W; 에칭 시간: 27분 에칭 시간은 CYTOP의 3 μm 두께를 완전히 에칭하는 데 최적화되었습니다.
    3. 트위저를 사용하여 반응 챔버에서 기판의 모든 조각을 선택하고 커버 유리 스테닝 랙에 배치합니다.
      참고: 시설의 유지 보수 규칙에 따르면, 반응 챔버는 짧은O2 플라즈마 세척 공정(예를 들어, 에칭 시간: 5분)이 필요할 수 있으며, 매 번 실행 후 반응 챔버를 깨끗하게 유지하도록 할 수 있다.
  8. 포토레지스트 제거 및 청소
    1. 나머지 포토레지스트를 용해하기 위해 RT에서 5분 동안 아세톤으로 기판을 초음파 처리합니다.
    2. RT에서 5 분 동안 2 프로판올에서 기판을 초음파 처리합니다.
    3. 순수한 물을 사용하여 기판을 5회 헹구는 다. RT에서 5 분 동안 기판을 초음파 처리하십시오. 기판을 순수한 물에 보관하십시오.
    4. 공기 블로우 건(그림 1H)으로기판의 모든 조각을 건조.
      참고 : 기판은 플라스틱 페트리 접시에 보관 할 수 있습니다. 가공 된 기판은 적어도 1 년 동안 RT에서 구조적으로 안정적입니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
    5. 3차원(3D) 레이저 스캐닝 공초점 현미경검사, 백색광 간섭법(또는 응경스스캐닝 간섭법) 또는 스캐닝 전자 현미경검사에 의해 준비된 기판의 표면 프로파일을 특성화한다. 각 소프트웨어를 사용하여 생성된 마이크로 챔버의 직경과 깊이를 측정합니다.
      참고: 비접촉식 및 비파괴 3D 레이저 스캐닝 공초점 현미경 또는 백색광 간섭계와 특성화 후 샘플은 다른 실험을 위해 재사용할 수 있다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

2. 폴리디메틸실록산(PDMS) 마이크로채널 준비

참고: PDMS를 처리하기 위해 라텍스 장갑을 착용하지 마십시오. 대신 폴리에틸렌(PE) 장갑을 착용하십시오.

  1. 마이크로 채널 마스터 만들기
    1. 이중 코팅 된 점착성 Kapton 필름 테이프를 데스크탑 커터를 사용하여 정의된 (3mm x 19mm) 마이크로 채널 모양으로 잘라냅니다.
      참고: 카프톤 테이프는 7602번 #25(테라오카 세이사쿠쇼)로, 채널 높이가 135μm이다. STIKA 데스크탑 커터는 어도비 일러스트레이터파일의 드로잉에 따라 절단을 실행하기 위해 어도비 일러스트레이터의 플러그인(롤랜드 웹 사이트: https://www.rolanddga.com)을 사용합니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
    2. 페트리 접시의 평평한 바닥에 모든 컷 Kapton 테이프를 붙입니다. 표준 90mm 페트리 디쉬에는 12개의 테이프가 제공됩니다.
      참고: 릴리프 구조는 PDMS의 복제 성형을 위한 마스터 역할을 합니다. 테이프와 페트리 접시 기판 사이에 끼워진 기포가 있는 경우 트위저로 테이프 표면을 부드럽게 누릅니다. 또는, 고전적인 소프트 리소그래피는 실리콘 웨이퍼(38)에마스터를 준비하기 위해 적용 할 수있다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
  2. 테이프 패턴 페트리 접시에 PDMS 수지 경화
    1. 새로운 PE 장갑을 착용하고 일회용 플라스틱 파이펫을 사용하여 SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머의 경화제 2.5 g을 지정된 플라스틱 비커(그림2A)로옮긴다.
    2. 새로운 장갑으로 변경하고 일회용 50mL 주사기를 위의 플라스틱 비커로 사용하여 SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머의 전폴리머 베이스 25 g을 전송합니다.
      참고: 본 원에서 장갑을 변경하여 경화제의 잠재적 교차 오염을 방지하기 위해 베이스로 전환합니다.
    3. 분해 믹서를 사용하여 혼합물을 혼합하고 분해하십시오 (프로그램 : 3 분 혼합 다음 2 분 디에레이션).
      참고: 디액션 믹서를 사용할 수 없는 경우 수동으로 교반된 혼합물(약 15분)은 진공 챔버에서 탈가스를 방출할 수 있습니다.
    4. 테이프 패턴 페트리 접시(도 2B)에PDMS 혼합물을 붓습니다. 페트리 접시를 미니 진공 챔버에 넣고 PDMS 혼합물을 1-3h(도2C)에분해합니다.
      참고: 1시간 후에 PDMS 혼합물에 공기가 남아 있으면 페트리 접시를 진공 챔버에서 꺼내 공기 송풍기를 사용하여 기포를 부수고 페트리 접시를 진공 챔버에 다시 넣고 디션 프로세스를 계속하십시오.
    5. 페트리 접시를 오븐에 넣고 하룻밤 사이에 60°C에 놓아 PDMS(도2D)를치료한다.
      참고: 온도를 높이면 경화 시간이 단축될 수 있지만, 물리적 변형 없이 폴리스티렌 페트리 접시에 의해 견딜 수 있는 최대 온도는 약 60°C이다.
  3. PDMS 채널의 복제 성형
    1. 페트리접시(그림 2E)에서경화 된 PDMS 엘라스토머를 벗깁니다.
    2. 평면 케이블커터(그림 2F)를사용하여 PDMS 채널 블록의 모든 부분을 차단합니다.
    3. PDMS 엘라스토머를 커팅 매트 에 올려 놓습니다. 생검펀치(도 2G)를사용하여 채널의 각 끝에 구멍을 뚫는다.
    4. 스카치 테이프로 PDMS 채널의 표면을 청소합니다. 그런 다음 PDMS 수지를 다른 스카치 테이프에 싸서 사용하기 전에 깨끗하게 유지합니다. 준비된 PDMS 채널을 깨끗한 페트리 접시에 보관하십시오.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

3. 펨토리터 마이크로 챔버 어레이 장치의 조립

  1. 페트리 접시의 내부 벽을 따라 물에 흠뻑 젖은 깨끗한 와이퍼를 몇 개 놓아 간편한 가습 챔버를 만듭니다. 가습 챔버에 스카치 테이프로 덮인 PDMS 수지와 파라핀 필름을 사용하여 챔버를 밀봉하십시오. 적어도 3 시간 동안 배양하지만 하루 이상.
    참고: PDMS는 가스가수지(39)를가로질러 통과할 수 있는 다공성 물질이다. PDMS의 다공성 구조는 평형에 도달할 때까지 주변에서 물 분자의 흡수로 이어집니다. 이 전처리는 PDMS의 기공을 수증기로 채우고 PDMS 채널의 가장자리에 인접한 수성 액적의 증발을 크게 억제할 수 있습니다.
  2. PDMS 수지에서 스카치 테이프를 가져 가라. 기판의 마이크로 챔버 어레이 영역에 PDMS 채널을 배치(도 2H).
    참고: PDMS 수지는 CYTOP 표면에 가역적으로 부착됩니다. Pweezer로 PDMS 블록을 부드럽게 눌러 PDMS 수지와 기판 사이에 기포를 제거하십시오.
  3. PDMS 채널의 구멍의 하나(콘센트로서)에 200 μL 비 필터링 파이펫 팁을 삽입합니다.
    참고: PDMS와 CYTOP 간의 접착 강도는 제한적입니다. PDMS 수지의 물리적 변형뿐만 아니라 표면에서 PDMS 채널의 분리를 방지하기 위해 파이펫 팁을 너무 깊게 삽입하지 마십시오.

4. 조립된 장치에 반응 솔루션 로드

  1. 얼음 위에 알루미늄 마이크로튜브 스탠드를 놓습니다. 알루미늄 스탠드의 1.5mL 마이크로튜브에서 플러시 오일(ASAHIKLIN AE-3000 오일이 0.1wt % SURFLON S-386 계면활성제와 혼합)을 미리 냉각시하십시오.
  2. 얼음에 또 다른 알루미늄 블록을 넣습니다.
  3. CFPS 반응 솔루션 의 준비
    1. PCR 튜브에서 CFPS 반응 솔루션을 준비합니다. CFPS 키트의 모든 알리쿼트 성분, 희석된 템플릿 DNA(형광 단백질 mNeonGreen40에체리치아 대장균 알칼리 알칼리인 인산염41)에의해 본명상으로 예시된 바와 같이) 용액 및 특정 요구에 따른 기타 필요한 성분(예를 들어, RNase 억제제, 플루오겐성 기산염)
      참고: CFPS에 사용되는 템플릿 DNA는 해당 CFPS 키트의 지시에 따라 준비되어야 합니다. 이 데모는 T7 기반 식시스템(42)을 적용했다. FemDA 장치의 시약 소비는 매우 작기 때문에 10 μL은 전체 PDMS 채널을 채울 만큼 충분히 큽니다.
    2. mNeonGreen 형광 단백질 합성의 경우, 다음 순서로 성분을 혼합 : 용액 A의 6 μL 알리쿼트에 뉴클레아제 없는 H2O의2.7 μL을 추가하십시오(CFPS 키트에서); RNase 억제제의 0.3 μL을 추가; 희석 된 템플릿 DNA 용액의 1.5 μL을 추가하십시오. 혼합물을 용액 B의 4.5 μL 알리쿼트(CFPS 키트에서)로 짧게 혼합하고 전달합니다.
      참고: 총 부피는 15μL입니다. 모든 aliquot의 양이 최종 혼합물의 총 부피에 비례하기 때문에, 총 부피가 10 μL 미만이기 때문에 일부 성분 의 너무 작은 부피(&0.2 μL)가 발생할 수 있습니다.
    3. 알칼리성 인산염 합성의 경우, 다음 순서로 성분을 혼합하십시오: 용액 A의 H2O ~ 6 μL의 1.2 μL을 추가하십시오. RNase 억제제의 0.3 μL을 추가; 이황화물 결합 증강제 1 과 2 (키트에서) 0.6 μL을 추가하십시오. 5mM 6,8-디플루오로-4-메틸럼벨리페릴 인산염의 0.3 μL을 추가합니다(DiFMUP); DNA 용액의 1.5 μL을 추가; 혼합물을 용액 B의 4.5 μL로 짧게 혼합하고 전달합니다.
      참고: 알칼리성 인산염의 분석에서, 형광기 디FMUP는 말단 인산염 군의 효소 분열시 6,8-디플루오로-7-하이드록시-4-메틸루마린(DiFMU)을 높게 발할 수 있다.
  4. 200 μL 비 여과 파이펫 팁을 사용하여 혼합물의 10 μL을 그립니다. 피펫 팁을 PDMS 채널의 입구 구멍(3.3 단계를 참조)에 삽입합니다. 플런저를 아래로 밀어 콘센트에서 오버플로될 때까지 채널에 솔루션을 주입합니다(다른 파이펫 팁이 이미 3.3단계에서 삽입된 경우).
  5. 파이펫 끝에서 파이펫을 분리하고 이 두 파이펫 팁을 입구와 콘센트에 계속 삽입합니다.
    참고: 파이펫팅 중에 기포가 생성되지 않도록 하십시오. 피펫 끝에서 파이펫을 분리하여 PDMS 채널 내부의 솔루션의 역류를 방지할 때까지 엄지 손가락을 플런저에서 두지 마십시오.

5. CFPS에 대한 펨토리터 액적 배열 (펨DA) 생성

  1. 조립된 장치의 전체 세트를 미리 냉각된 알루미늄 블록으로 전송합니다(4.2단계 참조). 마이크로 챔버 어레이 영역이 반투명(도 2I)에서투명(도 2J)로빠르게 회전하는지 신중하게 확인합니다.
    참고: CFPS 반응 솔루션은 마이크로 챔버에 직접 입력할 수 없습니다. 물에서 공기의 용해도는 온도에 역비례합니다. 장치가 RT에서 저온으로 이동한 후 갇힌 공기가 용액으로 녹아 들어갑니다. 투명성 변화는 솔루션이 마이크로 챔버에 들어가는지 여부를 판단하는 편리한 시각적 지표입니다.
  2. 미리 냉각된 플러시 오일의 30μL을 그리고(단계 4.1 참조), 오일을 상부 개구부에서 입구 삽입 파이펫 팁으로 즉시 옮춥니다. 플러시 오일은 채널로 이동하고 마이크로 챔버 외부에있는 과도한 반응 솔루션을 압출한다. 모든 마이크로 챔버는 플러시 오일에 의해 격리됩니다.
    참고: 반응 용액과 플러시 오일 사이의 이동 인터페이스가 표시되어 사람들이 채널 내부의 유체의 움직임을 관찰하는 데 도움이됩니다. 압출 된 용액은 이전 튜브로 수집하여 4 °C에 저장되고 다른 FemDA 장치 또는 병렬 벌크 반응 (마이크로 튜브 또는 마이크로 티터 플레이트에서)을 재사용할 수 있습니다.
  3. 밀봉 오일(Fomblin Y25)을 200 μL 여과 파이펫 팁으로 미리 그립니다. 파이펫을 어딘가에 똑바로 놓습니다.
  4. 동시에 장치에서 삽입된 두 파이펫 팁(3.3단계 및 4.4단계 참조)을 제거합니다. 즉시 장치를 알루미늄 블록에서 파라필름으로 이동합니다.
    참고: 파이펫 팁을 제거하는 기간 동안 알루미늄 블록의 장치를 수정(채널 영역에서 멀리 유지)하려면 트위저를 사용합니다.
  5. 즉시 밀봉 오일 (단계 5.3 참조)을 포함하는 준비 파이펫 팁을 PDMS 채널의 입구에 삽입하고 콘센트에서 오버플로 될 때까지 채널에 오일을 주입합니다.
    참고: 장치를 RT로 이동하는 즉시 이 단계를 수행합니다. 채널 내부의 역류를 방지하려면 밀봉 오일이 콘센트에서 흘러 나갈 때까지 엄지 손가락을 플런저에서 두지 마십시오. 플러시 오일은 채널의 출구에서 이동 한 직후 증발하고, 다음 밀봉 오일은 매우 낮은 증발 손실로 인해 콘센트에 축적됩니다.
  6. 파이펫 끝에서 파이펫을 분리한 다음 장치에서 파이펫 팁을 제거합니다. 깨끗한 와이퍼를 사용하여 PDMS 표면을 청소한 다음 각각 입구와 콘센트에 새로운 밀봉 오일 한 방울을 적용합니다. 펨토리터 물방울은 오일에 의해 개별 마이크로 챔버에 밀봉됩니다.
    참고: 트위처를 사용하여 마이크로파이펫 팁을 제거하는 기간 동안 기판의 PDMS 채널을 수정(채널 영역에서 멀리 유지)합니다.
  7. 커버 글래스의 하부 표면에 축적된 수분을 닦아줍니다. 준비된 FemDA 장치는 이제 잠복 및 현미경 이미징을 위한 준비가 되었습니다.

6. 현미경 이미징

  1. 반전형 형광 현미경을 시작합니다. 카메라의 안정화(냉각)를 기다립니다. 60x 또는 100x 오일 침지 목표 렌즈를 사용하십시오. 전동 스테이지에서 펨DA 장치를 설정합니다. 이미징 매개 변수를 설정합니다.
    참고: 이미징 매개 변수에는 파일 경로, 이미징 채널, 필터, 노출 시간(일반적으로 100ms는 충분합니다. 카메라의 사양에 따라 짧거나 긴 시간도 가능함) 및 광 강도가 포함됩니다.
  2. 초점 평면을 찾습니다. 객관적인 렌즈의 z축 위치를 조정하고 내부 자동 초점 시스템을 사용하여 초점 평면을 수정합니다. 관심 영역(ROI, 즉 x, y축)을 이미지로 설정합니다.
    참고: 주요 현미경 제조업체(니콘, 올림푸스, 자이스, 라이카)는 모두 자동 초점 시스템을 현미경과 통합할 수 있는 옵션을 제공합니다. 이 자동 초점 시스템은 자동 다중 영역 이미징 중에 초점 평면을 일정하게 유지하는 데 필요합니다. ROI는 PDMS 채널의 펨다 영역을 다룹니다.
  3. 형광 이미지를 캡처합니다. 모든 ROI에 대해 초점이 맞지 않는 밝은 필드(BF) 이미지의 단일 프레임을 캡처합니다. 다른 채널을 이미징할 때 ROI의 순서와 좌표를 변경하지 마십시오.

7. 이미지 데이터 분석

참고: 피지(http://fiji.sc)를 기반으로 홈메이드 플러그인("FemDA")을 사용하여 이미지 데이터를 분석하여 각액적(43)의형광 강도를 추출한다. 운영 체제에 따라 피지의 올바른 버전을 설치합니다. 피지는 빌드 인 플러그인 "바이오 포맷"을 사용하여 대부분의 이미지 파일 형식 (예 : 니콘 현미경의 nd2 파일, 자이스 현미경의 czi 파일)을 지원합니다.

  1. 플러그인 설치
    1. 피지의 "플러그인"폴더에 플러그인 파일을 복사하고 붙여 넣습니다 (해당 저자또는 다음 기관 링크를 통해 문의 할 때 또는 다음 기관 링크를 통해 사용할 수 있습니다: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ).
    2. 피지 소프트웨어를 시작; 플러그인 "FemDA" 피지의 드롭 다운 메뉴 "플러그인"에서 찾을 수 있습니다.
  2. 이미지 데이터 전처리
    1. 비집중BF 이미지를 엽니다(6.3단계 참조). 클릭 프로세스 | 배경을 뺍니다... 이미지 데이터의 모든 프레임의 매끄러운 연속 배경을 제거합니다(도4B). 클릭 프로세스 | 필터 | 이미지 데이터의 모든 프레임의 노이즈를 줄이기 위해 중앙값(도4C).
    2. 이미지 클릭 | 조정 | 이미지 데이터의 모든 프레임(도 4A-C의확대 삽입)의 배경(마이크로 챔버 외부 영역을 나타내는)에서 전경(마이크로 챔버 표시)을 확인하고 분리하는 임계값.
      참고: 임계값 창의 드롭다운 목록에서 적절한 알고리즘을 선택하여 모든 마이크로 챔버의 가장자리뿐만 아니라 마이크로 챔버 영역만 식별하고 전경으로 강조 표시할 수 있습니다. 특히 강조 표시된 가장자리의 대부분은 간격 없이 연속되어야 합니다.
  3. 물방울 좌표 결정
    1. 플러그인을 클릭 | 펨다 | FemDA 분석은 사용자 정의 플러그인의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 엽니 다 (그림 4D의상부 절반).
    2. 단일 마이크로 챔버의 대략적인 최소 픽셀 및 최대 픽셀 수를 입력합니다. 마이크로 챔버의 예상 최소 및 최대 순환(0: 임의 형상, 1: 완벽한 원)을 입력합니다. 시작 프레임과 끝 프레임의 프레임 번호를 입력합니다.
    3. GUI에서 ROI 생성을 클릭하여 모든 마이크로챔버를 감지하고 성공적으로 감지된 ROI가 팝업 창 ROITable에표시됩니다.
    4. FemDA Analysis로 돌아가서 ROI 마스크 적용 버튼을 클릭하여 프레임 위에 있는 마이크로챔버가 제대로 감지되었는지 확인합니다(그림 4D왼쪽아래). 아니요, 그 중 일부를 수정하고 ROI 생성ROI 마스크 적용을 클릭하여 반복합니다. 그렇다면 다음 단계로 이동합니다.
      참고: 전경과 배경 사이의 대비가 부족하기 때문에 임계값의 알고리즘에 의해 ROI(도 4D의하반부 참조)로 잘 식별할 수 없는 마이크로챔버가 거의 없을 수 있습니다. 통계적 관점에서는 문제가 되지 않습니다.
  4. 형광 강도 추출
    1. 형광 이미지를 열고 전면에 가져온다. ROI 마스크를 다시 적용하여 형광 이미지(그림 4D의오른쪽 아래)에 결정된 ROI를 적용합니다.
    2. 엔드포인트 이미지(mNeonGreen 데이터로 예시)를 분석하거나 시간 과정 데이터를 분석하기 위한 타임랩스를 분석하기 위해 원샷(Alkaline 인스파타아제 데이터로 예시)을 선택합니다.
    3. 입력 100 상단 픽셀의 번호는 각 ROI의 상위 100 픽셀만 해당 액적의 평균 강도를 계산하는 데 사용된다는 것을 의미합니다. 상위 픽셀 수에입력 0이 있는 경우 각 ROI의 모든 픽셀을 사용하여 해당 액적의 평균 강도를 계산합니다.
      참고: BF와 형광 이미지 사이에 는 여러 픽셀의 드리프트가 있을 수 있으며, 이는 ROI 내의 일부 픽셀이 형광 이미지의 배경에 속할 수 있음을 의미합니다. 따라서 플러그인은 모든 액적의 평균 강도 계산을 위해 최고 강도 등급픽셀 수를 지정하는 옵션을 제공합니다.
    4. 엔드포인트 이미지(예: 7.4.2단계에서 원샷 선택)를 분석하려면 버튼을 클릭하면 강도를 측정하여 감지된 모든 물방울의 평균 강도를 계산합니다. ROITable은 형광 이미지의 새 데이터로 업데이트됩니다. 한편, 히스토그램은 새로운 팝업 창히스토그램(그림 4E)에표시됩니다.
      참고: 상자 빈 번호의 빈 크기를 변경하면 히스토그램의 표시를 최적화할 수 있습니다. 개발된 GUI에서 가우시안 분포의 합계에 맞는 작업을 수행할 수 있습니다. 피지의 팝업 로그 창 피팅 결과 표시 합니다. 또는, 텍스트로 저장 버튼을 클릭하여 데이터를 내보내고 다른 소프트웨어(그림 4F, G)와다양한 통계 분석을 수행한다.
    5. 타임코스 이미지(즉, 7.4.2 단계에서 시간 경과 선택)의 분석을 위해 팝업 창은 히스토그램대신 강도 시간 코스이며, 이는 특정 시간점 및 시간 강도 플롯(그림5)에해당하는 히스토그램을 포함한다. 팝업 창의 파일 메뉴를 사용하여 텍스트 데이터를 내보낼 수도 있습니다.

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Representative Results

미세 제조 공정은 기판 세척, 표면 기능화, CYTOP 코팅, 포토리소그래피, 드라이 에칭, 포토레지스트 스트리핑 및 최종 세척으로 구성됩니다. 중요한 것은, 제시된 프로토콜은 마이크로챔버 내부의소수성 CYTOP 폴리머를 완전히 제거할 수 있도록 허용하고, 표준 커버 유리 기판상에서 매우 병렬 성소수성 구조를 생성한다. 오일 밀봉 프로토콜의 도움으로, 생성된 액물의 균일한 치수는 마이크로챔버(도3B)에서형광용액을 캡슐화하여 검증하였다. 개발된 소프트웨어를 사용하여 추출된 형광 강도는 액적 크기의 좋은 지표입니다. 형광 강도의 CV, 3%, 전체 어레이(도3C)에걸쳐 액적 크기의 좁은 분포를 반영하였다. 공초점 현미경검사에서 재구성된 3D 영상도 시간이 지남에 따라 일관된 액적 부피를보였다(그림 3D,보충 영화 1)44. 이에 비해, 널리 사용되는 FC-40 오일은 형광강도(45)에서여러 가지 차이를 나타내는 액적을 생성한다. 펨DA에서 형성된 액적은 RT에서 적어도 24시간 동안 안정적이었다(그림3E). 방울의 높은 품질은 결국 정량적 측정의 기초를 형성했다.

높은 처리량 데이터는 높은 처리량 데이터 분석 도구46,,47이필요합니다. 개발 된 플러그인은 크게 단순화하고 이미지 데이터 분석을 가속화. 디지털 이미지처리(48)의이론에 기초하여, 디포커스 BF 이미지는 비나게하고 배경 보정 및 노이즈 감소 후 모든 액적물의 좌표 정보를 제공하는 데 사용될 수있다(도 4A-C). 이 아이디어는 어두운 방울의 정확한 현지화를 가능하게했다.

형광 단백질 mNeonGreen은 FemDA에서 합성되었습니다. 물방울 당 0.05 분자의 농도를 가진 템플릿 DNA는 결합된 세포 없는 전사 및 번역 반응과 단백질 합성을 시작하기 위하여 각 물방울에 무작위로 분포되었다. 물방울 당 DNA 분자의 평균 수는 1 보다 작기 때문에, 몇몇 물방울은 0 템플릿 DNA를 포함했습니다, 그 외는 하나 이상의 DNA 분자를 포함하는 동안. RT에서 6시간 동안 잠복한 후, 엔드포인트 이미지는 현미경을 사용하여 포착되었다. 스택 이미지 데이터는 동시 디포커스 BF이미지(도 4A-E)의도움으로 개발된 소프트웨어에 의해 분석되었다. 각 액적의 형광 강도는 해당 액적에서 단백질 수율의 척도이다. 형광 강도의 히스토그램은 이산 분포를 보였으며, 방울당 다양한 DNA 분자의 점유율을 강력하게 제안한 동일한 피크-투-피크간격(도 4F)의가우시안 분포의 합계에 의해 잘 장착되었다. 반복되는 동전 뒤집기 게임과 마찬가지로, 발생하는 독립적 인 임의 이벤트의 수는 푸아송 분포에 의해 수학적으로 설명됩니다. DNA 분자의 상이한 숫자(본 예에서 최대 3개)를 포함하는 물방울의 발생 확률은 푸아송 분포(P =e-λ 31• λk/k!)에 딱 맞는 것으로, 여기서 λ는 물방울당 DNA 분자의 평균 수와 k가 방울당 평균 0.05 DNA 분자인 경우(4G의 무작위분포)를가진 실제 DNA 분자 수이다. 템플릿 DNA 용액의 적재 농도는 최종 장착 λ(즉, 0.05)와 같았기 때문에, 우리의 FemDA의 CFPS 반응 효율은 100% (또는 거의 100%)이었다. 즉, 단일 DNA 분자는 펨토리터 액적에서 CFPS 반응을 효율적으로 유발하기에 충분합니다.

알칼리성 인산염의 CFPS 반응은 5분마다 기록되었다. 개발된 소프트웨어는 또한 시간 과정 데이터분석(그림 5)을지원합니다. 결합된 형광 반응은 이전 시간 지점에서 물방울의 형광 강도의 유사한 이산 분포를 보였다. 히스토그램 결과는 또한 물방울에 있는 DNA 분자의 다른 수의 점유를 확인했습니다. 형광 강도는 결국 형광기 디FMUP의 점진적 고갈과 함께 값으로 수렴.

Figure 1
도 1: 초고밀도 마이크로 챔버 어레이 기판의 미세 제조 공정. (A)맞춤형 진공 척의 기술 도면. 단위 : mm.(B)CYTOP 필름 두께 대 스핀 속도 데이터. (C)가사화된 유리 기판에 대한 퍼플루오로폴리머 CYTOP의 스핀 코팅. 사진은 각각 균일코팅의 좋은 예와 불균일코팅의 나쁜 예를 보여주었다. 검은 색 화살표는 불균일 한 CYTOP 필름의 특정 위치를 나타냈다. (D)CYTOP 코팅 기판에 포토 레지스트의 스핀 코팅. 스핀 코팅 후, 기판 가장자리 근처의 포토레지스트는 에탄올에 담근 깨끗한 와이퍼(가운데 사진)를 사용하여 제거해야 합니다. 사진은 각각 균일코팅의 좋은 예와 불균일코팅의 나쁜 예를 보여주었다. 흰색 화살표는 불동성 광저항 필름의 특정 위치를 나타냈다. (E)마스크 정렬기를 사용하여 코팅 된 포토 레지스트의 노출. (F)개발자의 노출 된 포토 레지스트의 개발. 포토레지스트의 노출된 부분은 개발자 솔루션에서 용해됩니다. (G)CYTOP의 반응성 이온 에칭. 발견된 CYTOP은O2 플라즈마에 의해 제거되었습니다. (H)포토레지스트 마스크의 제거. 아세톤에 의해 포토레지스트가 제거되었습니다. 기판은 2-프로판올과 H2O.를 사용하여 청소하였으시면 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 마이크로 챔버 어레이 장치의 준비 및 사용. (A)PDMS의 경화제 및 사전 중합체를 계량한다. (B)혼합 및 분해 혼합물을 테이프 패턴 페트리 접시에 붓습니다. 중합체 혼합물에는 새로 생성된 기포가 있었다. (C)진공 챔버에서 혼합물을 다시 증액. 기포가 상승하고 상단 표면에 파열되었다. (D)PDMS 수지 의 분해 및 경화. (E)페트리 접시에서 경화 PDMS 엘라스토머를 벗겨냅니다. (F)평면 케이블 커터를 사용하여 PDMS 채널 블록의 모든 조각을 차단합니다. (G)생검 펀치를 사용하여 PDMS 채널의 각 끝에 구멍을 펀칭. (H)조립된 장치. PDMS 수지는 CYTOP 표면을 부착할 수 있습니다. (I)냉각하기 전에 수성 용액으로 채워진 PDMS 채널 내부의 반투명 마이크로 챔버 어레이 영역. (J)냉각 후 PDMS 채널 내부의 투명 마이크로 챔버 어레이 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 매우 균일하고 매우 안정적인 펨토리터 방울. (A)제조된 기판에 대한 3D 레이저 스캐닝 공초점 현미경 이미징. 예시 영상의 원통형 마이크로챔버는 3 μm의 높이와 직경 4μm을 나타냈다. (B)평면 배열의 넓은 영역에 균일 한 펨토리터 방울. 본 원에 전체 배열의 부분 영역만 표시되었다. 형광용액(10μM ATTO-514)은 각 액적에 밀봉되었다. (C)전체 단일 배열에 대한 액적의 크기 분포입니다. 형광 강도는 액적 크기의 지표로 사용되었다. 이력서는 3%에 불과했습니다. (D)공초점 z 스택 타임 코스 데이터를 사용하여 체적 측정. 어레이를 통해 방울의 볼륨은 현미경 소프트웨어 (NIS-요소, 니콘)에 의해 주어졌다. (E)광표백 후 형광 회복. 첫 번째 프레임 후, 공초점 현미경의 제한된 레이저 빔을 사용하여 여러 방울이 완전히 표백되었습니다. 이들의 형광 강도는 24시간 동안 기록되었고, 형광 회복이 관찰되지 않았다(적선). 동일한 시야에서 다른 비광표백 된 물방울의 형광 강도는 검은 선에 기록되었다. 오류 막대(반투명 색상)는 매 시간 포인트마다 1SD였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 엔드포인트 현미경 이미지 데이터의 분석 절차. 디포커스 된 밝은 필드 이미지는 모든 마이크로 챔버 / 물방울의 좌표를 추출하는 데 사용되었습니다. 마이크로 챔버의 가장자리 (전경)와 다른 영역 (배경으로)의 강도 차이를 기반으로, 연속 및 거의 원형 가장자리는 배경에서 추출 할 수 있습니다. 시야(A)에걸쳐 고르지 않은 배경 분포로 인해 일부 이미지 사전 처리는 일반적으로 바이아라이징 출력의 품질을 향상시켜야 합니다. 배경(B)을빼낸 후, 모든 프레임의 배경이 균일화되었습니다. 경험적으로, "롤링 볼 반경"(1단계)의 입력 값은 2048 픽셀 × 2048 픽셀 이미지에 대해 20-50, 512 픽셀 × 512 픽셀 이미지에 대해 10-20이었다.Rolling ball radius 값이 클수록 처리 시간이 짧아지입니다. 배경 빼기 이미지의 노이즈를 줄이려면이미지(C)에중앙값 필터를 적용합니다. 일반적으로 반지름(3단계)의 입력 값은 1-2픽셀이었습니다. Radius 확대된 인서트에 도시된 바와 같이, 배경 빼기 및 여과된 이미지는 기초에 대응하는 전경뿐만 아니라 관심사 영역(ROI)을 정확하게 인식할 수 있도록 빌드인 임계값 플러그인을 사용하여 멋지게 비나화될 수 있다. 이미지의 모든 프레임에 대한 ROI 검출은 설치된 수제 플러그인 펨DA 분석(D)을 사용하여 수행하였다.D ROI의 픽셀 크기(5단계 및 6단계) 및 원형(7단계 및 8단계)은 실제 데이터에 따라 계산(9단계 및 10단계)에 넣으려는 프레임을 수동으로 정의하였다. ROI 생성(11단계)을 클릭하고 대기한 후 입력 프레임에 걸쳐 모든 ROI의 좌표가 결정되었습니다. ROI 적용 마스크(12단계)를 클릭한 후 감지된 모든 ROI는 노란색 선으로 동봉되고 강조 표시되었습니다. 형광 영상을 열고 ROI 적용 마스크를 다시 클릭한 후, 결정된 ROI 마스크가 형광 영상에 적용되었다. 위쪽 픽셀 수(14)는 각 방울의 평균 강도를 계산하기 위해 각 ROI의 최상위 강도 등급 픽셀 수를 지정했습니다. 측정 강도(15단계)를 클릭하고 기다린 후, 히스토그램이생성되었다(E). 히스토그램에는 히스토그램 창에서 사용할 수 있는 매개 변수를 사용하여 가우시안 분포의 합계를 장착할 수 있습니다. 또는 평균 강도 데이터를 텍스트 파일(16단계)으로 내보내고 다른소프트웨어(F)에의해 분석될 수 있다. (G)주어진 배열에서 DNA 분자의 상이한 숫자를 포함하는 물방울의 발생 확률. 히스토그램(회색 색)은 DNA 분자의 무작위 분포에 예상대로 방울당 평균 0.05 DNA 분자를 가진 푸아송 분포(빨간 파선)에 의해 멋지게 장착되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 시간 과정 현미경 이미지 데이터의 분석. 검출된 ROI(도 4의1-12단계 다음)는 타임코스 데이터에 직접 적용하였다. 도 4의13단계에서 시간 경과를 선택하고 시간 간격 [min]에서인접한 프레임 사이의 실제 시간 간격(분)을 입력합니다. 측정 강도(도 4의15단계)를 클릭하고 대기한 후 시간 강도 플롯 및 히스토그램(도 4E와동일)이 생성되었다. 히스트 위치는 히스토그램의 시간점을 지정했는데, 이는 수직 적색선으로 나타났다. 플러그인은 또한 모든 추적 라인에 대 한 색상을 지정 지원. 노란색: 0 DNA; 파란색은 1 DNA였다; 빨간색: 2 DNA; 블랙: DNA 3개. 시간 코스 데이터를 텍스트 파일로 내보낼 수도 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

FemDA의 매우 균일하고 안정적이며 생체 적합성을 기반으로 한 고정량 측정은 다른 연구와 는 다른 독특한 특징인 이산 분포를 가능하게 했습니다. 우리는 체계적으로 최적화하고이 논문에서 미세 제조 및 액적 형성 과정을 자세히 설명했다. 설정된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.

첫째, 직사각형 얇은 유리 기판상의 고점성 CYTOP 폴리머의 균일한 코팅은 크게 결과 기판의 품질을 결정한다. 배율이 높은 객관적렌즈의 일반적으로 짧은 작동 거리를 감안할 때(단계 6.1 참조), 얇은 커버 유리를 사용해야 합니다. 얇고 유연한 기판에 고품질의 스핀 코팅은 일반적으로 까다롭습니다. 우리는 아직 가능한 모든 설계를 테스트하지 않았지만 동일한 직사각형 치수를 가진 다중 구멍 진공 척이 스핀 코팅에 잘 작동한다는 것을 발견했습니다. 커버 유리 기판의 중앙에 CYTOP 폴리머를 떨어뜨리고 즉시 스핀 코팅을 시작하는 것이 중요합니다(1.3.2 단계 참조). 난이도의 정도는 기판의 형상과 덜 관련이 있지만 중합체의 점도. CYTOP 제품 라인은 시판되는 패키지의 여러 가지 농도를 제공합니다. 패키지에 동반된 희석제는 필요한 경우 원래 제품을 더 낮은 점도로 희석하는 데 사용할 수도 있습니다. 실험에 사용된 CYTOP 816은 용매에서 중합체를 안정적으로 용해시킬 수 있는 가장 높은 농도를 가진 상용 제품이다. 두꺼운 코팅은 낮은 스핀 속도 또는 코팅 및 경화의 여러 라운드를 필요로한다. 새로운 환경에서 새로운 스핀 코터를 사용할 때 특성 두께 대 스핀 속도 곡선의 플롯을 적극 권장합니다.

둘째, 클린룸의 적절한 습도는 이상적인 포토리소그래피뿐만 아니라 지정된 위치에서 포토레지스트의 완전한 제거에 매우 중요합니다. 포토리소그래피의 광화학 반응은H2O를 반응제 중 하나로 사용합니다. 그러나,H2O의끓는 온도보다 높은 온도에서 소프트베이크는 코팅된 포토레지스트로부터H2O 함량을 제거한다. "건조"포토 레지스트는 공기에서 H2O를 다시 흡수하는 데 시간이 걸릴 해야합니다 (1.4.6 단계 참조). 이 점은 종종 간과됩니다. 많은 실험실이 습도 제어없이 일부 단순화 된 클린 룸 시설을 가질 수 있다는 점을 감안할 때, 습도는 계절에 걸쳐 극적으로 변동하거나 날씨의 영향을받을 것입니다. 저렴한 솔루션은 클린룸에서 가정용 가습기 또는 제습기를 사용하는 것입니다. 개발 후 완전히 노출된 CYTOP 층은 RIE에 의해 선택적으로 완전히 제거되어 유리 바닥을 완전히 노출시킬 수 있습니다. 결국, 친성 유리 바닥과 소수성 CYTOP 측벽의 하이브리드 구조는 펨토리터 공간에 수성 용액을 안정적으로 포획하는 데 중요합니다.

셋째, 새로 발견된 오일(ASAHIKLIN AE-3000, 포블린 Y25) 및 계면활성제(SURFLON S-386)는 불소 중합체 원자로13에대한 전례 없는 밀봉 성능을 보였다. 플러시 오일의 주입은 냉장 된 플랫 금속 블록에서 수행되어야한다 (단계 5.2 참조); 그렇지 않으면 채널 입구 근처의 액적을 형성할 수 없습니다. 제2 밀봉 오일의 분사는 RT에서 수행 될 수있다 (단계 5.5 참조). 이러한 오일과 계면 활성제는 이전에 생물학적 연구에 사용된 적이 없습니다. 더 나은 대안은 지금 발견되지 않았습니다. 액적 준비를 위한 오일과 계면활성제의 유용한 조합의 무기고를 확장하기 위해, 오일의 새로운 부재(또는 동일한 제품 라인의 유사한 것들)와 계면활성제(또는 동일한 제품 라인의 유사한 것들)는 미세유체 적물물 시스템에 적용하려고 노력할 가치가 있다.

다음은 두 가지 추가 사항입니다. 하나는 현미경 화상 진찰 도중 ROIs 중 시간 지연이 있다는 사실입니다. 한 사이클의 총 이미징 시간은 주로 목표 렌즈의 어레이 크기와 배율에 의존한다. 노출 시간, 셔터 속도 및 전동 단계의 이동 속도도 사소한 요소입니다. 엄지 손가락의 규칙으로, 60 × 배율에서 106 방울을 이미징하는 것은 적어도 10-20 분이 필요합니다. 이 불가피한 시간 지연은 데이터 분석에서 몇 가지 오류를 도입하며, 이는 항상 신중하게 고려해야 합니다. 다른 하나는 단일 기판에 있는 물방울의 총 수가 108-109를초과하지 않을 것이라는 사실입니다, 심지어 물방울의 밀도를 증가시키거나 물방울의 개별 크기를 감소시키는 사실입니다. 마스크 정렬기(4인치 웨이퍼의 경우)에 의해 처리될 수 있는 유리 기판의 크기가 제한되어 있기 때문이다. 커버 글래스의 크기를 더욱 늘리는 것은 크고 얇고 깨지기 쉬운 유리 기판을 다루기 어렵기 때문에 권장되지 않습니다.

FemDA는 슈퍼 소형 마이크로티터 플레이트로 간주될 수 있습니다. 96웰 마이크로티터 플레이트에서 수행된 모든 생화학 적 반응은 FemDA를 사용하여 수행하도록 시도 될 수 있습니다. 그것은 확실히 복잡 한 단백질 정제 없이 효소 활동 측정에 사용할 수 있습니다. 또한 디지털 폴리머라제 연쇄 반응(디지털 PCR) 및 디지털 효소 연계 면역조벤트 분석(디지털 ELISA)31,,49와호환될 수 있다. 작은 볼륨, 큰 배열 및 높은 안정성은 기존의 디지털 바이오 아세이 방법에 비해 몇 가지 이점을 가져올 것입니다. 펨토리터 방울에서 다양한 수의 템플릿 DNA 분자를 해결할 수 있는 FemDA 시스템은 이미 정확한 단백질스크리닝(13)에대한 힘을 보여주었다. FemDA는 다양한 효소를 빠르게 진화시킬 수 있는 새로운 체외 구획화 시스템입니다. 생물정보학 및 도서관 건설 기술의 발전과 함께 고성능 단백질의 신속한 온디맨드 생성 시대가 분명 해질 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 JSPS KAKENHI 교부금 번호 JP18K14260및 해양-지구 과학 기술에 대한 일본 기관의 예산에 의해 지원되었다. 특성화 시설을 제공해 주신 데구치 시게루(JAMSTEC)와 이쿠타 테츠로(JAMSTEC)에게 감사드립니다. 상용 소프트웨어 지원에 대한 다카이 켄(JAMSTEC)에 감사드립니다. 마이크로패브릭은 도쿄대학교 다케다 센탄치 슈퍼클린룸에서 실시되었으며, 일본 교육문화체육관과학부(MEXT)의 '나노기술 플랫폼 프로그램', 일본 보조금 번호 JPMXP09F19UT00087이 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

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