Ein Femtoliter Droplet Array für massive parallele Proteinsynthese aus einzelnen DNA-Molekülen

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Chemistry

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Summary

Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, über eine Million geordnete, einheitliche, stabile und biokompatible Femtolitertröpfchen auf einem 1 cm2 planaren Substrat herzustellen, das für die zellfreie Proteinsynthese verwendet werden kann.

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Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

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Abstract

Fortschritte bei der räumlichen Auflösung und Detektionsempfindlichkeit wissenschaftlicher Instrumente ermöglichen die Anwendung kleiner Reaktoren für die biologische und chemische Forschung. Um der Nachfrage nach Hochleistungs-Mikroreaktoren gerecht zu werden, haben wir ein Femtoliter-Tröpfchen-Array (FemDA)-Gerät entwickelt und seine Anwendung in massiv parallelen zellfreien Proteinsynthesereaktionen (CFPS) veranschaulicht. Über eine Million gleichmäßige Tröpfchen wurden mit einem zweistufigen Ölabdichtungsprotokoll problemlos in einem fingergroßen Bereich erzeugt. Jedes Tröpfchen wurde in einer Femtoliter-Mikrokammer verankert, die aus einem hydrophilen Boden und einer hydrophoben Seitenwand besteht. Die hybride hydrophil-in-hydrophobe Struktur und die speziellen Dichtöle und Tenside sind entscheidend, um die femtoliter wässrige Lösung im Femtoliter-Raum ohne Verdunstungsverlust stabil zu halten. Die Femtoliter-Konfiguration und die einfache Struktur des FemDA-Geräts ermöglichten einen minimalen Reagenzverbrauch. Die einheitliche Dimension der Tröpfchenreaktoren machte großflächige quantitative und Zeitverlaufsmessungen überzeugend und zuverlässig. Die FemDA-Technologie korrelierte den Proteinertrag der CFPS-Reaktion mit der Anzahl der DNA-Moleküle in jedem Tröpfchen. Wir rationalisierten die Verfahren über die Mikrofertigung des Geräts, die Bildung der Femtolitertröpfchen und die Erfassung und Analyse der mikroskopischen Bilddaten. Das detaillierte Protokoll mit den optimiertniedrigen Betriebskosten macht die FemDA-Technologie für jeden zugänglich, der über Standard-Reinraumeinrichtungen und ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop an seinem eigenen Platz verfügt.

Introduction

Die Forscher verwenden Reaktoren, um biochemische Reaktionen durchzuführen. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um die Größe des Reaktors zu verringern und den experimentellen Durchsatz zu erhöhen, um den Reagenzienverbrauch zu senken und gleichzeitig die Arbeitseffizienz zu verbessern. Beide Aspekte zielen darauf ab, Forscher von einer hohen Arbeitsbelastung zu befreien, die Kosten zu senken und Forschung und Entwicklung zu beschleunigen. Wir haben eine klare historische Roadmap über die Entwicklung der Reaktortechnologien aus der Sicht der Reaktionsvolumina und des Durchsatzes: Einzelbecher/Kolben/Teströhren, Milliliter-Röhren, Mikroliter-Röhren, Mikroliter 8-Röhren-Streifen, Mikroliter 96/384/1536-Well-Platte und mikrofluidische Nanoliter/Picoliter/Femtoliter-Reaktoren1,2,3,4,5,6,,7. Analog zur Verkleinerung der Funktionsgröße von Transistoren auf integrierten Schaltungschips in der Halbleiterindustrie in den letzten Jahrzehnten durchlaufen bio-chemische Mikroreaktoren Volumenreduktion und Systemintegration. Solche kleinen Werkzeuge haben einen tiefgreifenden Einfluss auf die zellbasierte oder zellfreie synthetische Biologie, Biomanufacturing und High-Throughput-Prototyping und Screening8,9,10,11,12. Dieses Papier beschreibt unsere jüngsten Bemühungen um die Entwicklung einer einzigartigen Tröpfchen-Array-Technologie und demonstriert ihre Anwendung in CFPS13, einer grundlegenden Technologie für synthetische Biologie und molekulare Screening-Gemeinschaften14. Insbesondere stellen wir bewusst ein optimiertes und kostengünstiges Protokoll bereit, um das FemDA-Gerät für jedermann zugänglich zu machen. Das kostengünstige und einfach zu handhabende Protokoll für das miniaturisierte Gerät würde zu den Bildungszwecken der Universitäten beitragen und zur Verbreitung der Technologie beitragen.

FemDA bereitet Femtolitertröpfchen mit einer ultrahohen Dichte von 106 pro 1 cm2 auf einem planaren Glassubstrat vor. Wir beschichteten ein hydrophobes Polymer, CYTOP15, auf dem Glassubstrat und selektiv geätzt (entfernt) CYTOP an vordefinierten Positionen, um ein Mikrokammer-Array auf dem Substrat zu erzeugen. So besteht die resultierende Mikrokammer aus einer hydrophoben Seitenwand (CYTOP) und einem hydrophilen Boden (Glas). Wenn wasser und öl nacheinander über die gemusterte Oberfläche fließen, kann das Wasser eingefangen und in die Mikrokammern versiegelt werden. Die hydrophil-in-hydrophobe Struktur ist entscheidend für die Abstoßung von Wasser außerhalb der Mikrokammern, die Isolierung einzelner Mikroreaktoren und die Beibehaltung einer winzigen wässrigen Lösung im Femtoliterraum. Die einzigartige Eigenschaft wurde erfolgreich für die Herstellung von Wasser-in-Öl-Tröpfchen und Lipid-Doppelschicht-Mikrokompartimenten16,17angewendet. Im Vergleich zum Prototypgerät16haben wir zunächst den Mikrofertigungsprozess optimiert, um eine vollständige Entfernung des CYTOP-Polymers sowie eine vollständige Belichtung des Glasbodens zu realisieren. CYTOP ist ein spezielles Fluorpolymer mit extrem niedriger Oberflächenspannung (19 mN/m) niedriger als herkömmliche Mikroreaktormaterialien wie Glas, Kunststoffe und Silikon. Seine gute optische, elektrische und chemische Leistung wurden bereits in der Oberflächenbehandlung von mikrofluidischen Geräten18,19,20,21,22,23,24eingesetzt. Im FemDA-System muss die Oberflächenspannung des Öls niedriger sein als die der festen Oberfläche25. Andernfalls neigt das flüssige Öl, das mit der festen Oberfläche in Berührung kommt, dazu, kugelförmig zu werden, anstatt sich über die Oberfläche auszubreiten. Außerdem fanden wir heraus, dass einige beliebte Perfluorkohlenstofföle (z. B. 3M FC-40)16 und Fluorentöle (z. B. 3M Novec-Serie) CYTOP als Folge der amorphen Morphologie von CYTOP auflösen können, was für die quantitative Messung tödlich ist und in Bezug auf die Kreuzkontamination unter Tröpfchen fragwürdig wäre. Glücklicherweise haben wir ein biokompatibles und umweltfreundliches Öl mit niedrigerer (< 19 mN/m) Oberflächenspannung13identifiziert. Wir fanden auch ein neues Tensid, das sich im ausgewählten Öl auflösen und in geringer Konzentration (0,1%, mindestens 10-mal niedriger als zuvor berichtetbeliebte 26,27)13funktionieren kann. Die resultierende Wasser-Öl-Schnittstelle kann durch das Tensid stabilisiert werden. Aufgrund der hohen Verdunstungsrate des Öls, nach dem Spülen mit dem Öl, haben wir ein weiteres biokompatibles und umweltfreundliches Öl eingesetzt, um das erste zu ersetzen, das die Mikrokammern versiegelt. Wir nennen das erste Öl (ASAHIKLIN AE-3000 mit 0,1 Gew.-SURFLON S-386) das "Flush Oil" und das zweite Öl (Fomblin Y25) das "Dichtungsöl".

Die zweistufige Ölabdichtungsstrategie kann innerhalb von Minuten und ohne ausgeklügelte Instrumentierung eine robuste Formation des Femtoliter-Tröpfchen-Arrays realisieren. Aufgrund des Verdampfungsproblems wurde es als schwierig angesehen, Mikroreaktoren zu erzeugen, die kleiner als Pikolitervolumen28sind. FemDA befasste sich mit diesem Problem, indem sie die Materialien und Verfahren zur Herstellung von Mikroreaktoren/Tröpfchen systematisch optimierte. Einige bemerkenswerte Merkmale der resultierenden Tröpfchen sind die hohe Gleichmäßigkeit (oder Monodispersität), Stabilität und Biokompatibilität auf der Femtoliter-Skala. Der Variationskoeffizient (CV) des Tröpfchenvolumens beträgt nur 3% (ohne Vignettierungskorrektur für die mikroskopischen Bilder), der kleinste CV unter den Tröpfchenplattformen der Welt, der eine hochparallele und quantitative Messung gewährleistet. Das Femtolitertröpfchen ist mindestens 24 Stunden stabil ohne Kreuzkontamination unter Tröpfchen bei Raumtemperatur, was für eine zuverlässige Zeitverlaufsmessung wertvoll ist. In Bezug auf die Biokompatibilität ist es uns gelungen, verschiedene Proteine aus einer Einzelkopie-Vorlagen-DNA im Femtoliter-Tröpfchen zu synthetisieren, die zuvor als schwierig oder ineffizient galt29,30. Es wäre wert, aufzuklären, warum einige Proteine, die in der FemDA synthetisiert werden können, nicht in anderen Tröpfchensystemen synthetisiert werden können. FemDA war nicht nur eine technische Weiterentwicklung, sondern realisierte auch eine beispiellose quantitative Messung, die den Proteinertrag (wie durch die Fluoreszenzintensität des Tröpfchens reflektiert) mit der Anzahl der Vorlagen-DNA-Moleküle in jedem Tröpfchen korrelieren kann. Infolgedessen zeigte das Histogramm der Fluoreszenzintensität von Tröpfchen aus FemDA-basiertem CFPS eine diskrete Verteilung, die durch eine Summe von Gaußschen Verteilungen gleicher Peak-to-Peak-Intervalle gut angepasst werden kann. Darüber hinaus passte die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Tröpfchen, die unterschiedliche Dna-Moleküle enthielten, perfekt zu einer Poisson-Verteilung31. So kann der unterschiedliche Proteinertrag in jedem Tröpfchen auf der Grundlage der diskreten Verteilung normalisiert werden. Diese kritische Funktion ermöglicht es uns, die enzymatischen Aktivitätsinformationen von der scheinbaren Intensität zu trennen, die bei anderen Mikroreaktorplattformen noch nicht verfügbar war. Bestehende mikrofluidische Zell-/Tröpfchensortiersysteme sind in der vollautomatischen Sortierung und gut in der Konzentration von Proben ausgebildet, können aber manchmal nur ein relativ breites oder langschwanzes Histogramm im analytischen Aspekt32,33ausgeben. Unser hochquantitatives und biokompatibles FemDA-System setzt neue Maßstäbe und einen hohen analytischen Standard im Bereich der Mikroreaktorentwicklung.

Die Öle und Tenside, die zur Herstellung von Tröpfchen verwendet werden könnten, sind noch sehr begrenzt34. Die Kombination von ASAHIKLIN AE-3000 und SURFLON S-386 mit Sitz in FemDA ist ein neues Mitglied des wachsenden Arsenals der physiochemischen Schnittstelle zwischen wässriger Phase und Ölphase13. Die neue Schnittstelle in FemDA ist physikalisch stabil, chemisch inert und biologisch kompatibel mit der komplexen Transkriptions-, Übersetzungs- und posttranslationalen Modifikationsmaschinerie für viele Arten von Proteinen13. Es wäre ziemlich attraktiv, ein Protein zu finden, das nicht stattdessen in den Tröpfcheneinstellungen synthetisiert werden kann. Außerdem ist die Kostenersparnis von Reagenzien im Femtoliter-Tröpfchensystem deutlicher als bei Nanoliter- und Picoliter-Reaktorsystemen35,36. Insbesondere würde es oft ein großes Totvolumen geben, das hauptsächlich durch Schläuche oder externe Vorräte in mikrofluidischen Tröpfchenerzeugungssystemen verursacht wird, aber nicht in unserer FemDA. Das Array-Format wird auch durch wiederholte und detaillierte mikroskopische Charakterisierung (ähnlich der sogenannten High-Content-Analyse) für jeden einzelnen Reaktor37begünstigt, anstatt nur durch einen einzigen Schnappschuss für ein schnell bewegliches Objekt. Die Femtoliter-Skala ermöglichte die Integration von über einer Million Reaktoren auf einer fingergroßen Fläche, während die gleiche Anzahl von Nanoliter-Reaktoren (falls vorhanden) eine Fläche von über einer Quadratmeterfläche erfordert, was zweifellos unpraktisch wäre, um ein solches System herzustellen oder zu nutzen.

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Protocol

1. Mikrofertigung des Femtoliter-Mikrokammer-Arraysubstrats

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Mikrofabrikationsexperimente in einem Reinraum durch. Tragen Sie Handschuhe und einen Reinraumanzug, bevor Sie den Reinraum betreten.

  1. Reinigung Abdeckung Glassubstrat
    1. Stellen Sie das Deckglas auf eine Abdeckung Glas-Färbung Rack. Beschallen Sie das Deckglas in 8 M Natriumhydroxid (NaOH) für 15 min bei Raumtemperatur (RT).
      VORSICHT: NaOH in hohen Konzentrationen ist sehr gefährlich für Haut und Auge. Behandeln Sie es vorsichtig ohne Spritzer.
    2. Nehmen Sie das Rack aus der NaOH-Lösung und spülen Sie das Deckglas zehnmal mit Wasser ab. Halten Sie das Deckglas im reinen Wasser.
      HINWEIS: Entsorgen Sie den alkalischen Abfall in den dafür vorgesehenen Tank. Die NaOH-Lösung kann bis zu fünf Mal in der Originalflasche recycelt und verwendet werden.
    3. Trocknen Sie jedes Stück Deckglas mit einer Luftblaspistole.
    4. Backen Sie das getrocknete Abdeckglas auf einer Kochplatte bei 200 °C für 5 min. Halten Sie die Ausrichtung der Oberseite des Glassubstrats während der folgenden Handhabungsprozesse konsistent.
  2. Silanisierung der Glasoberfläche
    1. Setzen Sie das gereinigte Deckglas auf einem trockenen Färbegestell zurück.
    2. 150 ml Ethanol in ein PTFE-Becherglas geben. Verwenden Sie eine Nadel (22 G x 70 mm) ausgestattet 1 ml Spritze, um 0,075 ml (3-Aminopropyl)triethoxysilan zu ziehen und sofort in das Ethanol injizieren (d. h. 0,05 Vol %). Ziehen und drücken Sie die Spritze mehrmals, um das Innere der Spritze zu spülen. Rühren Sie die Lösung mit der Nadel, um sie homogen zu machen.
      HINWEIS: (3-Aminopropyl)Triethoxysilan kann bei Raumtemperatur und 1 atm Druck für zwei Jahre mit einer dichten Abdichtung gelagert werden. Absolutes Ethanol sollte nach Gebrauch dicht verschlossen sein. Wir empfehlen nicht, abgelaufene Reagenzien zu verwenden.
    3. Inkubieren Sie das Deckglas in der 0,05 Vol % Aminosilanlösung für 1 h bei RT.
    4. Spülen Sie das Deckglas fünfmal mit reinem Wasser. Halten Sie das Deckglas im reinen Wasser.
      HINWEIS: Entsorgen Sie den Abfall in den dafür vorgesehenen Tank.
    5. Trocknen Sie jedes Stück Deckglas mit der Luftblaspistole.
    6. Legen Sie das gesamte getrocknete Abdeckglas auf Aluminiumfolie. Das Deckglas auf der Kochplatte bei 80 °C 5 min backen.
  3. Spin-Beschichtung CYTOP Perfluorpolymer
    1. Legen Sie das Deckglas auf ein kundenspezifisches Vakuumfutter eines Spincoaters (Abbildung 1A). Schalten Sie den Vakuumschalter ein, um das Glassubstrat zu fixieren.
      HINWEIS: Die Konstruktion des Vakuumfutters ist entscheidend für eine gleichmäßige Beschichtung von viskosem Polymer auf dem rechteckigen (24 mm x 32 mm) und dünnen (0,13-0,17 mm) Substrat (Abbildung 1A). Wir fanden heraus, dass eine rechteckige Probenstufe mit mehreren Löchern (48 Löcher mit jeweils 1 mm Durchmesser), die mit dem Vakuumkanal verbunden ist, besser funktionierte als die runde Stufe mit einem einzigen zentralen Loch.
    2. Lassen Sie 70-90 l CYTOP-Polymer vom Typ A in der Mitte des Glassubstrats fallen. Das Polymer sofort verschichten (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Der Spin-Coating-Zustand (3.400 U/min, 30 s) bietet eine Dicke von 3 m. Verwenden Sie die Mikropipette für viskose Flüssigkeit. Halten Sie die Mikropipette aufrecht, um den Polymerabfall nahezu perfekt auf dem Substrat kreisen zu lassen. Eine Luftblase wird oft innerhalb der Pipettenspitze erzeugt, wenn sich der Kolben nach unten bewegt. Lassen Sie nicht den letzten Tropfen CYTOP mit der Blase fallen.
    3. Nehmen Sie das beschichtete Glas mit Fingern, die Ecken des Glassubstrats halten, und legen Sie es auf Aluminiumfolie.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.3, um alle verbleibenden Teile des Bezugsglases zu verschichten.
    5. Das beschichtete Glas bei 80 °C 30 min und dann bei 200 °C für 1 h backen.
      HINWEIS: Diese Verarbeitung härtet den CYTOP vollständig aus und klebt den CYTOP kovalent an der Glasoberfläche. Bedecken Sie den Backbereich mit einem Deckel aus Aluminiumfolie, um bei Bedarf bei Bedarf staubendes Potenzial während des langjährigen Backprozesses zu vermeiden.
    6. Entfernen Sie das CYTOP-beschichtete Deckglas von der Kochplatte und kühlen Sie es auf RT ab. Nehmen Sie jedes Stück des beschichteten Glases vorsichtig auf und prüfen Sie es, um zu sehen, ob es richtig beschichtet ist. Entsorgen Sie das Substrat mit inhomogener Beschichtung.
      HINWEIS: Die Oberfläche eines schön beschichteten CYTOP sollte flach aussehen ohne unregelmäßige regenbogenähnliche Muster (Abbildung 1C). Die Sichtprüfung aus einem richtigen Winkel kann die Ebenheit sowie die Beschichtungsqualität schnell beurteilen. Das Protokoll kann hier angehalten werden.
  4. Spin-Beschichtung Photoresist
    1. Legen Sie das CYTOP-beschichtete Deckglas auf das Vakuumfutter (siehe Schritt 1.3.1) des Spincoaters. Schalten Sie den Vakuumschalter ein, um das Deckglas zu fixieren.
    2. Drop 0,2-0,3 ml Photoresist in der Mitte des Substrats. Sofort spin-coat die Fotowiderstehen bei 6.000 U/min für 60 s.
      HINWEIS: Lassen Sie nicht den letzten Tropfen des Photoresist sbumieren mit Blasen fallen. Wenn der Spincoater eine höhere Spin-Geschwindigkeit unterstützt, könnte die Spin-Geschwindigkeit bis zu 7.500 U/min betragen, um eine dünnere Beschichtung zu erreichen. Die geringe Oberflächenenergie von CYTOP verhindert, dass die meisten Photowiderstände an ihrer Oberfläche haften. Wenn AZ P4903 photoresist nicht verfügbar ist, ist AZ P4620 photoresist eine gute Alternative.
    3. Nehmen Sie das beschichtete Substrat mit zwei Fingern, die Ecken des Substrats halten. Wischen Sie den überschüssigen Photoresist in der Nähe der Substratkante ab (oft als Kantenperlenentfernung oder EBR bezeichnet) mit einem mit Ethanol getränkten sauberen Wischer (Abbildung 1D). Legen Sie das Substrat auf die Aluminiumfolie.
      HINWEIS: Aceton wird nicht für EBR empfohlen.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1-1.4.3, um den Photoresist für die restlichen Teile des CYTOP-beschichteten Deckglases zu verschichten. Nehmen Sie jedes Stück des beschichteten Glases auf und prüfen Sie es, um zu sehen, ob es richtig beschichtet ist.
      HINWEIS: Die Oberfläche eines schön beschichteten Photoresist sollte flach aussehen ohne unregelmäßige Muster (Abbildung 1D). Die Sichtprüfung aus einem richtigen Winkel kann die Ebenheit sowie die Beschichtungsqualität schnell beurteilen. Das Substrat mit inhomogener Beschichtung kann durch Waschen mit Aceton, 2-Propanol undH2O nacheinander recycelt und wiederverwendet werden.
    5. Backen Sie das beschichtete Substrat bei 110 °C für 5 min auf der Kochplatte.
    6. Entfernen Sie das beschichtete Substrat von der Kochplatte und kühlen Sie es auf RT ab. Lassen Sie für 30 min bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40%-60% für die Rehydratation des Photoresist stehen.
      HINWEIS: H2O ist für die folgende photochemische Reaktion erforderlich. Der gebackene Photoresist verlor den H2O Inhalt im Inneren des Photoresist. Durch den Rehydrierungsprozess kannH2O aus der Luft aufgenommen werden. Relative Luftfeuchtigkeit unter 20% oder höher als 80% ist nicht für den Rehydratationsprozess geeignet.
  5. Fotolithografie
    1. Starten Sie während der Wartezeit der Rehydrierung (siehe Schritt 1.4.6) den Maskenausrichter. Erwärmen Sie die Lichtquelle. Laden Sie die Chrom-Fotomaske.
      HINWEIS: Befolgen Sie die Bedienungsanleitung, um den Maskenausrichter zu bedienen. Die Fotomaske kann über Elektronenstrahl-Lithographie (EB) hergestellt werden, wenn die EB-Anlage verfügbar ist. Alternativ kann die Fotomaske an ein lokales Unternehmen ausgelagert werden.
    2. Laden Sie das rehydrierte Substrat (nach Abschluss schritt 1.4.6) auf das Futter (Abbildung 1E).
    3. Legen Sie Belichtungsparameter fest. Setzen Sie das Substrat für 25 s mit2 einer UV-Intensität von 13 mW/cm2 (h-linie) im Vakuumkontaktmodus aus. Dann entladen Sie das Substrat und legen Sie es auf die Abdeckung Glas-Färbung Rack (das gleiche Rack in Schritt 1.1.1 verwendet).
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.2-1.5.3, um die verbleibenden Teile des rehydrierten Substrats freizulegen.
  6. Entwicklung
    1. Entwickeln Sie das Substrat für 5 min, um den exponierten Photoresist aufzulösen (Abbildung 1F). Während dieser, schütteln Sie das Rack im Entwickler einmal zum Zeitpunkt von 4 Minuten.
      HINWEIS: Der Entwickler war AZ 300 MIF. Alternative alkalische Entwickler (z.B. AZ 400 K) sind allgemein für die Entwicklung geeignet, sollten aber eine Optimierung der Entwicklungsbedingungen (z.B. Zeit, Temperatur, Rührung) erfordern. Verwenden Sie NICHT Glasbecher als Entwicklercontainer.
    2. Spülen Sie das Substrat zehnmal mit reinem Wasser. Halten Sie das Deckglas im reinen Wasser.
      HINWEIS: Verwerfen Sie den Entwickler auf den dafür vorgesehenen Tank.
    3. Trocknen Sie jedes Stück Substrat gründlich mit der Luftblaspistole.
  7. Reaktiv-Ionen-Ätzung
    1. Legen Sie das getrocknete Substrat (ab Schritt 1.6.3) in die Reaktionskammer der Reaktiv-Ionen-Ätzmaschine (RIE).
      HINWEIS: Gemäß der Wartungsregel der Anlage kann die RIE-Maschine jedes Mal entweder immer eingeschaltet oder abgeschaltet werden. Wenn der Schalter ausgeschaltet war, schalten Sie den Schalter gemäß der Bedienungsanleitung ein.
    2. Ätzen Sie den photoresist-ungedeckten CYTOP mit dem O2 Plasma (Abbildung 1G).
      HINWEIS: Die RIE-Bedingung war wie folgt. O2 Gasdurchfluss: 50 sccm; Kammerdruck: 10,0 Pa; HF-Leistung: 50 W; Ätzzeit: 27 min. Die Ätzzeit wurde für die vollständige Ätzung von CYTOP-Dicke von 3 m optimiert.
    3. Nehmen Sie jedes Stück Substrat aus der Reaktionskammer mit der Pinzette auf und legen Sie es auf das Deckglas-Verlegeregal.
      HINWEIS: Gemäß der Wartungsregel der Anlage kann die Reaktionskammer einen kurzenO2-Plasmareinigungsprozess (z. B. Ätzzeit: 5 min) erfordern, um die Reaktionskammer nach jedem Lauf sauber zu halten.
  8. Entfernen von Photoresist und Reinigung
    1. Beschallen Sie das Substrat in Aceton für 5 min bei RT, um den verbleibenden Photowiderstand aufzulösen.
    2. Beschallen Sie das Substrat in 2-Propanol für 5 min bei RT.
    3. Spülen Sie das Substrat fünfmal mit reinem Wasser. Beschallen Sie das Substrat für 5 min bei RT. Spülen Sie die Probe mit reinem Wasser für weitere fünf Mal. Halten Sie das Substrat in reinem Wasser.
    4. Trocknen Sie jedes Stück Substrat mit der Luftblaspistole(Abbildung 1H).
      HINWEIS: Das Substrat kann in einer Petrischale aus Kunststoff gelagert werden. Das hergestellte Substrat ist bei RT für mindestens ein Jahr strukturstabil. Das Protokoll kann hier angehalten werden.
    5. Charakterisieren Sie das Oberflächenprofil des vorbereiteten Substrats durch dreidimensionale (3D) Laserscanning Konfokalmikroskopie, Weißlichtinterferometrie (oder Kohärenzscanning Interferometrie) oder Rasterelektronenmikroskopie. Verwenden Sie die entsprechende Software, um den Durchmesser und die Tiefe der resultierenden Mikrokammern zu messen.
      HINWEIS: Die Probe kann nach der Charakterisierung mit dem berührungslosen und zerstörungsfreien 3D-Laserscanning-Konfokalmikroskop oder dem Weißlicht-Interferometer für andere Experimente wiederverwendet werden. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

2. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrokanal

HINWEIS: Tragen Sie KEINE Latexhandschuhe, um PDMS zu handhaben. Tragen Sie stattdessen Polyethylen (PE) Handschuhe.

  1. Erstellen des Mikrokanal-Masters
    1. Schneiden Sie ein doppelbeschichtetes Klebeband Kapton-Filmband mit einem Desktop-Cutter in eine definierte (3 mm x 19 mm) Mikrokanalform.
      HINWEIS: Das Kapton-Band war nr. 7602 #25 (Teraoka Seisakusho), was zu einer Kanalhöhe von 135 m führte. Der STIKA-Desktop-Cutter verwendet ein Plugin (verfügbar auf der Roland-Website: https://www.rolanddga.com) von Adobe Illustrator, um das Schneiden entsprechend der Zeichnung in der Adobe Illustrator-Datei auszuführen. Das Protokoll kann hier angehalten werden.
    2. Kleben Sie jedes geschnittene Kapton-Band auf den flachen Boden einer Petrischale. Die standard 90 mm Petrischale bietet Platz für 12 Stück des Bandes.
      HINWEIS: Die Reliefstruktur dient als Master für die Nachbildung von PDMS. Drücken Sie die Bandoberfläche vorsichtig mit einer Pinzette, wenn zwischen dem Band und dem Petrischalensubstrat Luftblasen eingeklemmt sind. Alternativ kann die klassische Softlithographie angewendet werden, um den Master auf einem Siliziumwafer38vorzubereiten. Das Protokoll kann hier angehalten werden.
  2. Aushärten von PDMS-Harz in der bandgemusterten Petrischale
    1. Tragen Sie neue PE-Handschuhe und übertragen Sie 2,5 g Härtungsmittel von SYLGARD 184 Silikonelastomer mit einer Einweg-Kunststoffpipette in den angegebenen Kunststoffbecher (Abbildung 2A).
    2. Wechseln Sie in neue Handschuhe und übertragen Sie 25 g der Prepolymerbasis von SYLGARD 184 Silikonelastomer mit einer Einweg-50 ml Spritze in das obige Plastikbecherglas.
      HINWEIS: Ändern Sie die Handschuhe hierin, um eine mögliche Kreuzkontamination des Härtungsmittels an der Basis zu verhindern.
    3. Verwenden Sie einen Entlüftungsmischer, um die Mischung zu mischen und zu entschärfen (Programm: 3 min Mischen, gefolgt von 2 min Entlüftung).
      HINWEIS: Wenn der Entlüftungsmischer nicht verfügbar ist, kann eine manuell gerührte (für ca. 15 min) Mischung in einer Vakuumkammer entgast werden.
    4. Gießen Sie die PDMS-Mischung in die bandgemusterte Petrischale (Abbildung 2B). Stellen Sie die Petrischale in eine Mini-Vakuumkammer und dearate die PDMS-Mischung für 1-3 h(Abbildung 2C).
      HINWEIS: Wenn Luft nach 1 h in der PDMS-Mischung verbleibt, nehmen Sie die Petrischale aus der Vakuumkammer, brechen Sie die Luftblase mit einem Luftgebläse, und legen Sie dann die Petrischale wieder in die Vakuumkammer und setzen Sie den Entlüftungsprozess fort.
    5. Legen Sie die Petrischale über Nacht bei 60 °C in einen Ofen, um das PDMS auszuhärten (Abbildung 2D).
      HINWEIS: Obwohl eine Erhöhung der Temperatur die Aushärtungszeit verkürzen kann, beträgt die maximale Temperatur, die von der Polystyrol-Petrischale ohne physikalische Verformung toleriert werden kann, etwa 60 °C.
  3. Replikformung des PDMS-Kanals
    1. Das ausgehärtete PDMS-Elastomer von der Petrischale abziehen (Abbildung 2E).
    2. Schneiden Sie jedes Stück PDMS-Kanalblöcke mit einem Flachkabelschneider ab (Abbildung 2F).
    3. Legen Sie das PDMS-Elastomer auf eine Schneidmatte nach oben. Schlagen Sie ein Loch an jedem Ende des Kanals mit einem Biopsie-Punch (Abbildung 2G).
    4. Reinigen Sie die Oberfläche des PDMS-Kanals mit Scotch Tape. Wickeln Sie das PDMS-Harz dann in ein anderes Stück Scotch-Band, um es vor gebrauchen sauber zu halten. Bewahren Sie den vorbereiteten PDMS-Kanal in einer sauberen Petrischale auf.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

3. Montage von Femtoliter Mikrokammer-Array-Gerät

  1. Legen Sie einige Stücke von wassergetränkten sauberen Scheibenwischer entlang der Innenwand einer Petrischale, um eine vereinfachte Befeuchtungskammer zu machen. Legen Sie das pdMS-Harz, das mit dem Scotch-Band bedeckt ist, in die Befeuchtungskammer und versiegeln Sie die Kammer mit Paraffinfolie. Mindestens 3 h, aber nicht länger als einen Tag inkubieren.
    HINWEIS: PDMS ist ein poröses Material, das Gas über das Harz passieren lässt39. Die poröse Struktur von PDMS führt zu einer Absorption von Wassermolekülen aus der Umgebung bis zum Erreichen eines Gleichgewichts. Diese Vorbehandlung füllt die Poren von PDMS mit Wasserdampf und kann die Verdunstung wässriger Tröpfchen neben dem Rand des PDMS-Kanals deutlich unterdrücken.
  2. Nehmen Sie das Scotch-Band aus dem PDMS-Harz. Positionieren Sie den PDMS-Kanal auf dem Mikrokammer-Arraybereich des Substrats (Abbildung 2H).
    HINWEIS: Das PDMS-Harz haftet reversibel an der CYTOP-Oberfläche. Drücken Sie den PDMS-Block vorsichtig mit einer Pinzette, um Luftblasen zwischen dem PDMS-Harz und dem Substrat zu entfernen, falls vorhanden.
  3. Legen Sie eine 200-L-Nichtfilter-Pipettenspitze in eine (als Auslass) der Bohrungen des PDMS-Kanals ein.
    HINWEIS: Die Haftfestigkeit zwischen PDMS und CYTOP ist begrenzt. Um eine physikalische Verformung des PDMS-Harzes sowie das Ablösen des PDMS-Kanals von der Oberfläche zu vermeiden, setzen Sie die Pipettenspitze nicht zu tief ein.

4. Ladereaktionslösung auf das montierte Gerät

  1. Legen Sie einen Aluminium-Mikrorohrständer auf das Eis. Prechill das Spülöl (ASAHIKLIN AE-3000 Öl gemischt mit 0,1 Gew. SURFLON S-386 Tensid) in einem 1,5 ml Mikrorohr auf dem Aluminiumständer.
  2. Setzen Sie einen weiteren Aluminiumblock auf Eis.
  3. Vorbereitung der CFPS-Reaktionslösung
    1. Bereiten Sie die CFPS-Reaktionslösung in einem PCR-Rohr vor. Mischen Sie jede aliquote Komponente des CFPS-Kits, eine verdünnte Schablonen-DNA (wie hierdurch durch das fluoreszierende Protein mNeonGreen40 und Escherichia coli alkalische Phosphatase41)und andere notwendige Komponenten entsprechend den spezifischen Bedürfnissen (z. B. RNase-Inhibitor, fluorogenes Substrat, Chaperon) veranschaulicht.
      HINWEIS: Die für CFPS verwendete Vorlagen-DNA muss gemäß der Anleitung des entsprechenden CFPS-Kits erstellt werden. In dieser Demo wurde ein T7-basiertes Ausdruckssystem42angewendet. Da der Reagenzverbrauch im FemDA-Gerät recht gering ist, sind 10 l groß genug, um den gesamten PDMS-Kanal zu füllen.
    2. Mischen Sie für die mNeonGreen fluoreszierende Proteinsynthese die Komponenten in der folgenden Reihenfolge: Fügen Sie 2,7 l nukleasefreiH2O zu einem 6-L-Aliquot der Lösung A hinzu (aus dem CFPS-Kit); 0,3 l RNase-Inhibitor hinzufügen; 1,5 L verdünnte DNA-Lösung der Schablonen hinzufügen; mischen und übertragen Sie das Gemisch kurz auf ein 4,5-L-Aliquot der Lösung B (aus dem CFPS-Kit).
      HINWEIS: Das Gesamtvolumen beträgt 15 L. Da die Menge jedes Aliquots proportional zum Gesamtvolumen des Endgemisches ist, kann ein Gesamtvolumen von weniger als 10 l zu einem viel zu geringen Volumen (< 0,2 l) einiger Komponenten aliquot führen.
    3. Für die alkalische Phosphatase-Synthese die Komponenten in der folgenden Reihenfolge mischen: 1,2 l h2O bis 6 l der Lösung A hinzufügen; 0,3 l RNase-Inhibitor hinzufügen; 0,6 l Disulfid-Bindungsverstärker 1 und 2 hinzufügen (aus einem Kit); 0,3 l von 5 mM 6,8-Difluor-4-methylumbelliferylphosphat (DiFMUP) hinzufügen; 1,5 L DNA-Lösung hinzufügen; kurz mischen und die Mischung auf 4,5 l der Lösung B übertragen.
      HINWEIS: Beim Test der alkalischen Phosphatase kann das fluorogene Substrat DiFMUP bei enzymatischer Spaltung der terminalen Phosphatgruppe hochfluoreszierende 6,8-Difluor-7-Hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) erzeugen.
  4. Zeichnen Sie 10 l des Gemischs mit einer 200-L-Nichtfilter-Pipettenspitze. Legen Sie die Pipettenspitze in die Einlassbohrung (siehe Schritt 3.3) des PDMS-Kanals ein. Drücken Sie auf den Kolben, um die Lösung in den Kanal zu injizieren, bis sie aus dem Auslass überläuft (wo bereits eine andere Pipettenspitze in Schritt 3.3 eingesetzt wurde).
  5. Trennen Sie die Pipette von der Pipettenspitze und halten Sie diese beiden Pipettenspitzen noch am Ein- und Auslass.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Erzeugung von Luftblasen während der Pipettierung. Lassen Sie den Daumen nicht vom Kolben, bis Sie die Pipette von der Pipettenspitze trennen, um den Rückfluss der Lösung innerhalb des PDMS-Kanals zu verhindern.

5. Generierung von Femtoliter-Tröpfchen-Array (FemDA) für CFPS

  1. Übertragen Sie den gesamten Satz des montierten Geräts auf den vorgekühlten Aluminiumblock (siehe Schritt 4.2). Bestätigen Sie sorgfältig, dass sich der Bereich des Mikrokammer-Arrays schnell von transluzent (Abbildung 2I) zu transparent (Abbildung 2J) wandelt.
    HINWEIS: Die CFPS-Reaktionslösung kann nicht direkt in die Mikrokammern gelangen. Die Löslichkeit der Luft im Wasser ist im umgekehrten Verhältnis zur Temperatur. Die eingeschlossene Luft löst sich in die Lösung auf, nachdem das Gerät von RT auf die niedrige Temperatur bewegt wurde. Die Transparenzänderung ist ein bequemer visueller Indikator, um zu beurteilen, ob die Lösung in die Mikrokammern gelangt.
  2. Zeichnen Sie 30 l des vorgekühlten Spülöls (siehe Schritt 4.1) und übertragen Sie das Öl sofort von der oberen Öffnung in die eingelassene Pipettenspitze. Das Spülöl bewegt sich in den Kanal und extrudiert die überschüssige Reaktionslösung außerhalb der Mikrokammern. Jede Mikrokammer wird durch das Spülöl isoliert.
    HINWEIS: Die bewegliche Schnittstelle zwischen der Reaktionslösung und dem Spülöl ist sichtbar, was den Menschen hilft, die Bewegung der Flüssigkeit innerhalb des Kanals zu beobachten. Die extrudierte Lösung kann in das vorherige Rohr gesammelt, bei 4 °C gelagert und für eine andere FemDA-Vorrichtung oder eine parallele Massenreaktion (im Mikrorohr oder einer Mikrotiterplatte) wiederverwendet werden.
  3. Vorzeichnen von 30 l Dichtöl (Fomblin Y25) auf eine 200 l gefilterte Pipettenspitze. Hängen Sie die Pipette aufrecht irgendwo.
  4. Entfernen Sie gleichzeitig die beiden eingelegten Pipettenspitzen (siehe Schritte 3.3 und 4.4) aus dem Gerät. Bewegen Sie das Gerät sofort vom Aluminiumblock zum Parafilm.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gerät am Aluminiumblock während der Zeit des Entfernens der Pipettenspitzen zu fixieren (aber vom Kanalbereich fernzuhalten).
  5. Legen Sie sofort die fertige Pipettenspitze, die das Dichtöl enthält (siehe Schritt 5.3), in den Einlass des PDMS-Kanals ein und injizieren Sie das Öl in den Kanal, bis es aus dem Auslass überläuft.
    HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt aus, sobald Sie das Gerät auf RT verschieben. Um den Rückfluss innerhalb des Kanals zu verhindern, lassen Sie den Daumen nicht aus dem Kolben, bis das Dichtöl aus dem Auslass überläuft. Das Spülöl verdunstet unmittelbar nach dem Auszug aus dem Auslass des Kanals, während sich das folgende Dichtungsöl aufgrund seines extrem geringen Verdunstungsverlustes im Auslass ansammelt.
  6. Trennen Sie die Pipette von der Pipettenspitze und entfernen Sie dann die Pipettenspitze vom Gerät. Reinigen Sie die PDMS-Oberfläche mit einem Stück des sauberen Wischers und tragen Sie dann einen neuen Tropfen Dichtungsöl auf den Ein- bzw. Auslass auf. Die Femtolitertröpfchen werden in einzelnen Mikrokammern durch das Öl versiegelt.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Pinzette, um den PDMS-Kanal auf dem Substrat während der Zeit des Entfernens der Mikropipettespitze zu fixieren (aber vom Kanalbereich fernzuhalten).
  7. Wischen Sie die feuchtigkeitsspendende Feuchtigkeit auf der unteren Oberfläche des Deckglases. Das vorbereitete FemDA-Gerät ist nun für die Inkubations- und Mikroskopie-Bildgebung bereit.

6. Mikroskopische Bildgebung

  1. Starten Sie ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop. Warten Sie auf die Stabilisierung (Kühlung) der Kamera. Verwenden Sie eine 60x- oder 100x Öl-Tauchobjektivlinse. Stellen Sie das FemDA-Gerät auf die motorisierte Bühne ein. Legen Sie die Bildparameter fest.
    HINWEIS: Zu den bildgebenden Parametern gehören der Dateipfad, Bildkanäle, Filter, Belichtungszeiten (im Allgemeinen reichen 100 ms aus; kürzere oder längere Zeit ist auch je nach Spezifikation der Kamera möglich) und Lichtintensität.
  2. Finden Sie die Fokusebene. Passen Sie die Z-Achsenposition der Objektivlinse an und fixieren Sie die Brennebene mit einem internen Autofokussystem. Legen Sie den zu bebildernden Bereich (ROI; d. h. x, y-Achse) fest.
    HINWEIS: Die großen Mikroskophersteller (Nikon, Olympus, Zeiss, Leica) bieten alle die Möglichkeit, das Autofokus-System mit dem Mikroskop zu integrieren. Dieses Autofokussystem ist notwendig, um die Brennebene während der automatischen Multibereichs-Bildgebung konstant zu halten. Die ROIs decken den FemDA-Bereich im PDMS-Kanal ab.
  3. Erfassen Sie die Fluoreszenzbilder. Erfassen Sie einen einzelnen Frame eines defokussierten Bf-Images (Bright-Field) für jeden ROI. Ändern Sie NICHT die Reihenfolge und die Koordinaten der ROIs, wenn Sie die verschiedenen Kanäle abbilden.

7. Bilddatenanalyse

HINWEIS: Analysieren Sie die Bilddaten mit einem hausgemachten Plugin (genannt "FemDA") basierend auf Fidschi (http://fiji.sc), um die Fluoreszenzintensität jedes Tröpfchens zu extrahieren43. Installieren Sie die richtige Version von Fidschi nach dem Betriebssystem. Fidschi unterstützt die meisten Bilddateiformate (z.B. die nd2-Datei vom Nikon-Mikroskop, czi-Datei vom Zeiss-Mikroskop) mit dem eingebauten Plugin "Bio-Formats".

  1. Plugin-Installation
    1. Kopieren sie die Plugin-Datei (die dem entsprechenden Autor auf Anfrage oder über den folgenden institutionellen Link: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) zur Verfügung steht, in den "Plugins"-Ordner von Fidschi.
    2. Starten Sie die Fidschi-Software; das Plugin "FemDA" finden Sie im Dropdown-Menü "Plugins" von Fidschi.
  2. Bilddatenvorverarbeitung
    1. Öffnen Sie das defokussierte BF-Bild (siehe Schritt 6.3). Klicken Sie auf Prozess | Hintergrund subtrahieren... , um glatte, kontinuierliche Hintergründe jedes Frames der Bilddaten zu entfernen (Abbildung 4B). Klicken Sie auf Prozess | Filter | Median, um das Rauschen jedes Frames der Bilddaten zu reduzieren (Abbildung 4C).
    2. Klicken Sie auf Bild | Anpassen | Schwellenwert zum Überprüfen und Trennen des Vordergrunds (mit Angabe der Mikrokammern) vom Hintergrund (der den Bereich außerhalb der Mikrokammern angibt) jedes Rahmens der Bilddaten (vergrößerte Einfügungen in Abbildung 4A-C).
      HINWEIS: Wählen Sie einen geeigneten Algorithmus aus der Dropdown-Liste im Fenster Schwellenwert aus, damit nur die Mikrokammerbereiche sowie die Ränder jeder Mikrokammer als Vordergrund identifiziert und hervorgehoben werden können. Insbesondere müssen die meisten hervorgehobenen Kanten lückenlos sein.
  3. Tröpfchenkoordinatenbestimmung
    1. Klicken Sie auf Plugins | FemDA | FemDA-Analyse zum Öffnen der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) des angepassten Plugins (obere Hälfte von Abbildung 4D).
    2. Geben Sie die ungefähre minimale und maximale Anzahl von Pixeln einer einzelnen Mikrokammer ein. Geben Sie die erwartete minimale und maximale Zirkularität (0: beliebige Form; 1: perfekter Kreis) der Mikrokammern ein. Geben Sie die Rahmennummer des Startrahmens und des Endrahmens ein.
    3. Klicken Sie auf der GUI auf ROI generieren, um jede Mikrokammer zu erkennen, und die erfolgreich erkannten ROIs werden in einem Popupfenster ROITableangezeigt.
    4. Kehren Sie zum Fenster FemDA-Analyse zurück und klicken Sie auf die Schaltfläche ROI-Maske anwenden, um zu überprüfen, ob die Mikrokammern über den Rahmen richtig erkannt wurden (unten links in Abbildung 4D). Wenn nein, ändern Sie einige von ihnen, und wiederholen Sie die Maus auf ROI generieren und ROI-Maske anwenden. Wenn ja, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
      HINWEIS: Es kann sehr wenige Mikrokammern geben, die nicht gut als ROI identifiziert werden können (siehe die untere Hälfte von Abbildung 4D) durch einen Algorithmus des Schwellenwerts, da der Kontrast zwischen Vordergrund und Hintergrund nicht ausreicht. In statistischer Hinsicht ist dies nicht problematisch.
  4. Fluoreszenzintensitätsextraktion
    1. Öffnen Sie das Fluoreszenzbild und bringen Sie es nach vorne. Klicken Sie erneut auf ROI-Maske anwenden, um die ermittelten ROIs auf das Fluoreszenzbild anzuwenden (unten rechts in Abbildung 4D).
    2. Wählen Sie entweder One-Shot zur Analyse eines Endpunktbildes (wie exemplarisch mit den mNeonGreen-Daten) oder Time-Lapse zur Analyse von Zeitverlaufsdaten (wie am Beispiel der alkalischen Phosphatasedaten).
    3. Eingabe 100 in das Feld Anzahl der oberen Pixel bedeutet, dass nur die obersten 100 Pixel jedes ROI verwendet werden, um die mittlere Intensität des entsprechenden Tröpfchens zu berechnen. Wenn Die Eingabe 0 in der Anzahl der oberen Pixel erfolgt, werden alle Pixel jedes ROI verwendet, um die mittlere Intensität des entsprechenden Tröpfchens zu berechnen. Number of top pixels
      HINWEIS: Es kann zu einer Drift von mehreren Pixeln zwischen dem BF und den Fluoreszenzbildern, was bedeutet, dass einige Pixel innerhalb der ROIs zum Hintergrund des Fluoreszenzbildes gehören können. Daher bietet das Plugin eine Option, um die Anzahl der Pixel mit der obersten Intensität für die Berechnung der mittleren Intensität jedes Tröpfchens anzugeben.
    4. Für die Analyse des Endpunktbildes (d. h. One-Shot bei Schritt 7.4.2) klicken Sie auf die Schaltfläche Intensität messen, um die mittleren Intensitäten aller erkannten Tröpfchen zu berechnen. Die ROITable wird mit den neuen Daten aus dem Fluoreszenzbild aktualisiert. In der Zwischenzeit wird ein Histogramm in einem neuen Popup-Fenster Histogramm (Abbildung 4E) angezeigt.
      HINWEIS: Wenn Sie die Lagerplatzgröße im Feld Bin Number ändern, kann die Anzeige des Histogramms optimiert werden. Eine Anpassung an eine Summe von Gaußschen Verteilungen kann in der entwickelten GUI durchgeführt werden. Das Popup-Log-Fenster von Fidschi zeigt die passenden Ergebnisse an. Alternativ können Sie die Daten exportieren, indem Sie auf die Schaltfläche als Text speichern klicken und verschiedene statistische Analysen mit anderer Software durchführen ( Abbildung4F, G).
    5. Für die Analyse des Zeitverlaufsbildes (d. h. Time-Lapse bei Schritt 7.4.2) ist das Popup-Fenster Intensitätszeitkurs anstelle eines Histogramms, das ein Histogramm enthält, das einem bestimmten Zeitpunkt entspricht, und ein Zeit-Intensitätsdiagramm (Abbildung 5). Die Textdaten können auch über das Menü Datei des Popup-Fensters exportiert werden.

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Representative Results

Der Mikrofertigungsprozess besteht aus Substratreinigung, Oberflächenfunktionalisierung, CYTOP-Beschichtung, Photolithographie, Trockenätzung, photoresist-Abisolieren und Endreinigung. Wichtig ist, dass das vorgestellte Protokoll die vollständige Entfernung des hydrophoben CYTOP-Polymers in den Mikrokammern ermöglichte Abbildung 3A, wodurch eine hochparallele hydrophil-in-hydrophobe Struktur auf einem Standard-Abdeckungsglassubstrat hergestellt wurde. Mit Hilfe des Ölversiegelungsprotokolls wurde die einheitliche Dimension der resultierenden Tröpfchen durch Verkapseln von fluoreszierender Lösung in den Mikrokammern überprüft (Abbildung 3B). Die fluoreszenz-Intensität, die mit der entwickelten Software extrahiert wird, ist ein guter Indikator für die Tröpfchengröße. Der CV der Fluoreszenzintensität, 3%, spiegelte die enge Verteilung der Tröpfchengröße über das gesamte Array wider (Abbildung 3C). Das rekonstruierte 3D-Bild aus der konfokalen Mikroskopie zeigte auch das konsistente Tröpfchenvolumen im Laufe der Zeit (Abbildung 3D, Ergänzender Film 1)44. Im Vergleich dazu erzeugte ein weit verbreitetes FC-40-Öl die Tröpfchen mit einem mehrfachen Unterschied in der Fluoreszenzintensität45. Die gebildeten Tröpfchen in FemDA waren bei RT für mindestens 24 Stunden stabil(Abbildung 3E). Die hohe Qualität der Tröpfchen bildete schließlich die Grundlage der quantitativen Messung.

Daten mit hohem Durchsatz erfordern Datenanalysetools mit hohem Durchsatz46,47. Das entwickelte Plugin vereinfachte und beschleunigte die Bilddatenanalyse. Basierend auf der Theorie der digitalen Bildverarbeitung48kann das defokussierte BF-Bild binarisiert und verwendet werden, um die Koordinateninformationen jedes Tröpfchens nach Hintergrundkorrektur und Rauschunterdrückung bereitzustellen (Abbildung 4A-C). Diese Idee ermöglichte die genaue Lokalisierung dunkler Tröpfchen.

Das fluoreszierende Protein mNeonGreen wurde in FemDA synthetisiert. Template DNA mit einer Konzentration von 0,05 Molekülen pro Tröpfchen wurde nach dem Zufallsprinzip in jedes Tröpfchen verteilt, um die Proteinsynthese mit gekoppelten zellfreien Transkriptions- und Translationsreaktionen zu initiieren. Da die durchschnittliche Anzahl der DNA-Moleküle pro Tröpfchen kleiner als 1 war, enthielten einige Tröpfchen null Vorlagen-DNA, während andere ein oder mehrere DNA-Moleküle enthielten. Nach 6 Stunden Inkubation bei RT wurde das Endpunktbild mit dem Mikroskop aufgenommen. Die Stapelbilddaten wurden von der entwickelten Software mit Hilfe des gleichzeitigen defokussierten BF-Images analysiert (Abbildung 4A-E). Die Fluoreszenzintensität jedes Tröpfchens ist ein Maß für den Proteinertrag im entsprechenden Tröpfchen. Das Histogramm der Fluoreszenzintensitäten zeigte eine diskrete Verteilung und war gut durch eine Summe von Gaußschen Verteilungen gleicher Peak-to-Peak-Intervalle(Abbildung 4F) angebracht, was stark auf eine Belegung unterschiedlicher Anzahl von DNA-Molekülen pro Tröpfchen hindeutete. Ähnlich wie beim wiederholten Münzflipping-Spiel wird die Anzahl der unabhängigen Zufallsereignisse, die auftreten, mathematisch durch die Poisson-Verteilung beschrieben. Die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Tröpfchen, die unterschiedliche Zahlen (in diesem Beispiel bis zu 3) von DNA-Molekülen enthalten, passte perfekt zu einer Poisson-Verteilung (P = e-- k/ k!, wobei die erwartete durchschnittliche Anzahl von DNA-Molekülen pro Tröpfchen und k die tatsächliche Anzahl der DNA-Moleküle in einem Tröpfchen ist) mit einem Durchschnitt von 0,05 DNA-Molekülen pro Tröpfchen(Abbildung 4G)31, wie für eine zufällige Verteilung erwartet. Da die Belastungskonzentration der Schablonen-DNA-Lösung mit der endmontierten -,0,05-Lösung übereinstimmte, betrug die CFPS-Reaktionseffizienz in unserer FemDA 100 % (oder fast 100 %). Mit anderen Worten, ein einzelnes DNA-Molekül reicht aus, um die CFPS-Reaktion im Femtoliter-Tröpfchen effizient auszulösen.

Die CFPS-Reaktion der alkalischen Phosphatase wurde alle 5 Minuten aufgezeichnet. Die entwickelte Software unterstützt auch die Analyse der Zeitverlaufsdaten (Abbildung 5). Die gekoppelte fluorogene Reaktion zeigte eine ähnliche diskrete Verteilung der Fluoreszenzintensität der Tröpfchen zu früheren Zeitpunkten. Die Histogramm-Ergebnisse bestätigten auch eine Belegung unterschiedlicher Anzahl von DNA-Molekülen im Tröpfchen. Die Fluoreszenzintensität konvergierte schließlich zu einem Wert zusammen mit der allmählichen Erschöpfung des fluorogenen Substrats DiFMUP.

Figure 1
Abbildung 1: Mikrofertigung des Hochdichte-Mikrokammer-Arraysubstrats. (A) Technische Zeichnung des kundenspezifischen Vakuumfutters. Einheit: mm. (B) CYTOP-Filmdicke vs. Drehgeschwindigkeitsdaten. (C) Spin-Beschichtung des Perfluorpolymers CYTOP auf einem silanisierten Glassubstrat. Die Fotografien zeigten ein gutes Beispiel für homogene Beschichtung und ein schlechtes Beispiel für inhomogene Beschichtung. Der schwarze Pfeil zeigte die spezifische Position der inhomogenen CYTOP-Folie an. (D) Spin-Beschichtung von Photoresist auf dem CYTOP-beschichteten Substrat. Nach der Spin-Beschichtung muss der Photoresist in der Nähe der Substratkante mit einem mit Ethanol getränkten sauberen Wischer entfernt werden (mittleres Foto). Die Fotografien zeigten ein gutes Beispiel für homogene Beschichtung und ein schlechtes Beispiel für inhomogene Beschichtung. Der weiße Pfeil zeigte die spezifische Position des inhomogenen Photoresist-Films an. (E) Belichtung des beschichteten Photoresist mit einem Maskenaligner. (F) Entwicklung des exponierten Photoresist sin. Der exponierte Teil des Photoresists ist in der Entwicklerlösung löslich. (G) Reaktiv-Ionen-Ätzung von CYTOP. Der freigelegte CYTOP wurde durchO2-Plasma entfernt. (H) Entfernen der Fotowiderstandsmaske. Der Photoresist wurde durch Aceton entfernt. Das Substrat wurde mit 2-Propanol und H2O gereinigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Vorbereitung und Verwendung des Microchamber-Array-Geräts. (A) Wiegen des Härtungsmittels und des Prepolymers von PDMS. (B) Die gemischte und entlüftete Mischung in eine bandgemusterte Petrischale gießen. Es gab einige neu erzeugte Luftblasen in der Polymermischung. (C) Entasien des Gemischs in einer Vakuumkammer. Die Luftblasen stiegen auf und platzten auf der Oberseite. (D) Das entlüftete und ausgehärtete PDMS-Harz. (E) Abschälen des ausgehärteten PDMS-Elastomers aus der Petrischale. (F) Schneiden Sie jedes Stück PDMS-Kanalblöcke mit einem Flachkabelschneider ab. (G) Lochlöcher an jedem Ende des PDMS-Kanals mit einem Biopsie-Punch. (H) Das montierte Gerät. Das PDMS-Harz kann an der CYTOP-Oberfläche haften. (I) Transluzenter Mikrokammer-Arraybereich innerhalb des PDMS-Kanals, der vor dem Abkühlen mit der wässrigen Lösung gefüllt ist. (J) Transparenter Mikrokammer-Arraybereich innerhalb des PDMS-Kanals nach dem Abkühlen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Ultragleichmäßige und ultrastabile Femtolitertröpfchen. (A) 3D-Laserscanning konfokale Mikroskopie-Bildgebung für das hergestellte Substrat. Die zylindrischen Mikrokammern im Beispielbild zeigten eine Höhe von 3 m und einen Durchmesser von 4 m. (B) Einheitliche Femtolitertröpfchen über einen großen Bereich des planaren Arrays. Hierwurde nur ein Teilbereich des gesamten Arrays angezeigt. In jedem Tröpfchen wurde eine fluoreszierende Lösung (10 M ATTO-514) versiegelt. (C) Die Größenverteilung der Tröpfchen über ein ganzes einzelnes Array. Die Fluoreszenzintensität wurde als Indikator für die Tröpfchengröße verwendet. Der Lebenslauf betrug nur 3%. (D) Volumetrische Messung mit konfokalen Z-Stack-Zeitverlaufsdaten. Das Volumen der Tröpfchen über dem Array wurde von der Mikroskop-Software (NIS-Elements, Nikon) angegeben. (E) Fluoreszenzerholung nach Photobleichung. Nach dem ersten Frame wurden mehrere Tröpfchen mit einem geschlossenen Laserstrahl eines konfokalen Mikroskops vollständig photobleached. Ihre Fluoreszenzintensität wurde für 24 h aufgezeichnet, und es wurde keine Fluoreszenzerholung beobachtet (rote Linie). Die Fluoreszenzintensität anderer nicht photogebinierter Tröpfchen im gleichen Sichtfeld wurde in der schwarzen Linie aufgezeichnet. Fehlerbalken (transluzente Farben) waren 1 SD für jeden Zeitpunkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Analyseverfahren der mikroskopischen Endpunktbilddaten. Das defokussierte Hellfeldbild wurde verwendet, um die Koordinate aller Mikrokammern/Tröpfchen zu extrahieren. Basierend auf dem Intensitätsunterschied zwischen der Kante von Mikrokammern (als Vordergrund) und anderen Bereichen (als Hintergrund) kann die kontinuierliche und nahe kreisförmige Kante aus dem Hintergrund extrahiert werden. Aufgrund der ungleichmäßigen Hintergrundverteilung über das Sichtfeld (A) ist im Allgemeinen eine Bildvorverarbeitung erforderlich, um die Qualität der binarisierenden Ausgabe zu verbessern. Nach dem Subtrahieren des Hintergrunds (B) wurde der Hintergrund jedes Frames uniformisiert. Empirisch betrug der Eingabewert im "Rolling Ball Radius" (Schritt 1) 20-50 für 2048 Pixel x 2048 Pixel Bilder und 10-20 für 512 Pixel x 512 Pixel Bilder. Je größer der Wert, desto kürzer die Verarbeitungszeit. Um das Rauschen im Hintergrund-subtrahierten Bild zu reduzieren, wenden Sie einen Medianfilter auf das Bild an (C). Im Allgemeinen betrug der Eingabewert im Radius (Schritt 3) 1-2 Pixel. Wie in der vergrößerten Einfügung gezeigt, kann das Hintergrundsubtrahierte und gefilterte Bild mit dem eineingebauten Schwellenwert-Plugin schön binarisiert werden, so dass der den Kanten entsprechende Vordergrund sowie der Interessenbereich (ROIs) genau erkannt werden können. Die ROIs-Erkennung für alle Bilderbilder wurde mit dem installierten hausgemachten Plugin FemDA Analysis (D) durchgeführt. Die Pixelgröße (Schritte 5 und 6) und die Zirkularität (Schritte 7 und 8) der ROIs, die Frames, die wir in die Berechnung einfließen lassen möchten (Schritte 9 und 10), wurden manuell entsprechend den tatsächlichen Daten definiert. Nachdem Sie auf ROI generieren (Schritt 11) geklickt und gewartet haben, wurde die Koordinate jedes ROI über die Eingabeframes ermittelt. Nachdem Sie auf die Maske ROI anwenden (Schritt 12) geklickt haben, wurde jeder erkannte ROI umschlossen und durch eine gelbe Linie hervorgehoben. Nach dem Öffnen des Fluoreszenzbilds und erneuten Klicken auf die Maske ROI anwenden wurde die ermittelte ROIs-Maske auf das Fluoreszenzbild angewendet. Die Anzahl der oberen Pixel (Schritt 14) gab die Anzahl der Pixel mit der obersten Intensität jedes ROI für die Berechnung der mittleren Intensität der jeweiligen Tröpfchen an. Nach dem Klicken auf Die Intensität messen (Schritt 15) und Warten wurde das Histogramm generiert (E). Das Histogramm kann mit einer Summe von Gaußschen Verteilungen unter Verwendung der im Histogrammfenster verfügbaren Parameter ausgestattet werden. Alternativ können die mittleren Intensitätsdaten in eine Textdatei exportiert (Schritt 16) exportiert und von anderer Software analysiert werden (F). (G) Die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Tröpfchen, die unterschiedliche Anzahl von DNA-Molekülen im gegebenen Array enthalten. Das Histogramm (graue Farbe) wurde durch eine Poisson-Verteilung (rote gestrichelte Linie) mit durchschnittlich 0,05 DNA-Molekülen pro Tröpfchen, wie für eine zufällige Verteilung von DNA-Molekülen erwartet, schön angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Analyse der mikroskopischen Bilddaten des Zeitverlaufs. Die erkannten ROIs (nach den Schritten 1-12 von Abbildung 4) wurden direkt auf die Zeitverlaufsdaten angewendet. Wählen Sie in Schritt 13 von Abbildung 4 Zeitraffer aus und geben Sie das tatsächliche Zeitintervall (in Minuten) zwischen benachbarten Frames im Zeitintervall [min]ein. Nach dem Anklicken der Messintensität (Schritt 15 von Abbildung 4) und dem Warten wurden das Zeitintensitätsdiagramm und das Histogramm (das gleiche wie Abbildung 4E) generiert. Die Hist-Position gab den Zeitpunkt des Histogramms an, der als vertikale rote Linie angezeigt wurde. Das Plugin unterstützt auch die Angabe von Farben für jede Ablaufverfolgungslinie. Gelb: 0 DNA; blau war 1 DNA; rot: 2 DNA; schwarz: 3 DNA. Die Zeitverlaufsdaten können auch in eine Textdatei exportiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzender Film 1. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen. 

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Discussion

Die hochquantitative Messung auf Basis der hochgleichmäßigen, stabilen und biokompatiblen Tröpfchen in FemDA ermöglichte die diskrete Verteilung, das einzigartige Merkmal unserer Studie unterscheidet sich von anderen. In diesem Papier haben wir die Mikroherstellungs- und Tröpfchenbildungsprozesse systematisch optimiert und detailliert beschrieben. Es gibt mehrere kritische Schritte im etablierten Protokoll.

Zunächst bestimmt die gleichmäßige Beschichtung des hochviskosen CYTOP-Polymers auf dem rechteckigen dünnglasensubstrat weitgehend die Qualität des resultierenden Substrats. Angesichts des in der Regel kurzen Arbeitsabstands der Objektivlinse mit hohen Vergrößerungen (siehe Schritt 6.1) muss das dünne Deckglas verwendet werden. Eine hochwertige Spin-Beschichtung auf einem dünnen und flexiblen Substrat ist in der Regel schwierig. Wir haben noch nicht alle möglichen Konstruktionen getestet, aber festgestellt, dass das Mehrloch-Vakuumfutter mit der gleichen rechteckigen Dimension gut für die Spin-Beschichtung funktioniert hat. Es ist wichtig, das CYTOP-Polymer in der Mitte des Deckglassubstrats fallen zu lassen und sofort mit der Spin-Beschichtung zu beginnen (siehe Schritt 1.3.2). Der Schwierigkeitsgrad hängt weniger mit der Form des Substrats zusammen, sondern mit der Viskosität des Polymers. Die CYTOP Produktlinie bietet verschiedene Konzentrationen des handelsüblichen Pakets. Das begleitende Verdünnungsmittel in der Verpackung kann auch verwendet werden, um das Originalprodukt bei Bedarf auf eine niedrigere Viskosität zu verdünnen. CYTOP 816, das wir im Experiment verwendet haben, ist das kommerzielle Produkt mit der höchsten Konzentration, das in der Lage ist, das Polymer im Lösungsmittel stabil aufzulösen. Die dickere Beschichtung erfordert eine geringere Spin-Geschwindigkeit oder mehrere Beschichtungs- und Aushärtungsrunden. Ein Diagramm mit charakteristischer Dicke vs. Spin-Geschwindigkeitskurve wird dringend empfohlen, wenn sie einen neuen Spincoater in einer neuen Umgebung verwenden.

Zweitens ist die entsprechende Luftfeuchtigkeit des Reinraums entscheidend für die ideale Photolithographie sowie die vollständige Entfernung des Photoresist an der angegebenen Position. Die photochemische Reaktion in der Photolithographie verwendet H2O als einen der Reaktanten. Der Softbake bei einer Temperatur, die über der Siedetemperatur von H2O liegt, entfernt jedoch denH2O-Gehalt aus dem beschichteten Photoresist. Der "getrocknete" Photoresist muss einige Zeit in Anspruch nehmen, um H2O wieder aus der Luft aufzunehmen (siehe Schritt 1.4.6). Dieser Punkt wird oft übersehen. Da viele Laboratorien nur über vereinfachte Reinraumanlagen ohne Feuchtigkeitskontrolle verfügen, würde die Luftfeuchtigkeit über die Jahreszeit dramatisch schwanken oder vom Wetter beeinflusst werden. Eine kostengünstige Lösung ist die Verwendung eines Hausbefeuchters oder Luftentfeuchters im Reinraum. Die vollständig freiliegende CYTOP-Schicht nach der Entwicklung kann selektiv und vollständig durch RIE entfernt werden, wodurch der Glasboden vollständig freigelegt wird. Schließlich ist die Hybridstruktur des hydrophilen Glasbodens und der hydrophoben CYTOP Seitenwand wichtig, um wässrige Lösung für den Femtoliterraum stabil einzufangen.

Drittens zeigten die neu gefundenen Öle (ASAHIKLIN AE-3000, Fomblin Y25) und Tensid (SURFLON S-386) eine beispiellose Dichtleistung für den Fluorpolymerreaktor13. Die Injektion des Spülöls muss auf dem gekühlten Flachmetallblock erfolgen (siehe Schritt 5.2); Andernfalls können Tröpfchen in der Nähe des Kanaleinlasses nicht gebildet werden. Die Injektion des zweiten Dichtöls kann bei RT erfolgen (siehe Schritt 5.5). Diese Öle und Tenside wurden noch nie in der biologischen Forschung verwendet. Es wurden vorerst keine besseren Alternativen gefunden. Um das Arsenal der nützlichen Kombination von Ölen und Tensiden für die Tröpfchenzubereitung zu erweitern, sind das neue Mitglied der Öle (oder die ähnlichen in der gleichen Produktlinie) und das Tensid (oder die ähnlichen in der gleichen Produktlinie) würdig, zu versuchen, in mikrofluidischen Tröpfchensystemen angewendet zu werden.

Hier sind zwei weitere Punkte zu beachten. Eine davon ist die Tatsache, dass es eine Zeitverzögerung unter DEN ROIs während der Mikroskopie-Bildgebung gibt. Die Gesamtbildzeit für einen Zyklus hängt hauptsächlich von der Arraygröße und der Vergrößerung der Objektivlinse ab. Die Belichtungszeit, die Verschlusszeit und die Bewegungsgeschwindigkeit der motorisierten Stufe sind ebenfalls nebensächlich. Als Faustregel gilt, dass die Abbildung von 106 Tröpfchen bei einer Vergrößerung von 60 % mindestens 10-20 Minuten in Der Stadt erfordert. Diese unvermeidliche Zeitverzögerung führt zu einigen Fehlern bei der Datenanalyse, die immer sorgfältig berücksichtigt werden sollten. Die andere ist die Tatsache, dass die Gesamtzahl der Tröpfchen auf einem einzigen Substrat 108–109nicht überschreiten würde, sogar die Dichte der Tröpfchen erhöhen oder die individuelle Größe des Tröpfchens verringern würde. Dies liegt daran, dass die Größe des Glassubstrats, das vom Maskenausrichter (für 4-Zoll-Wafer) gehandhabt werden kann, begrenzt ist. Eine weitere Vergrößerung des Deckglases ist nicht empfehlenswert, da ein großes, dünnes und zerbrechliches Glassubstrat schwer zu handhaben ist.

FemDA kann als super miniaturisierte Mikrotiterplatte betrachtet werden. Alle biochemischen Reaktionen, die in 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt wurden, könnten versucht werden, mit FemDA durchzuführen. Es kann sicherlich für die Messung der Enzymaktivität ohne komplizierte Proteinreinigung verwendet werden. Es könnte auch kompatibel mit digitaler Polymerase-Kettenreaktion (digitale PCR) und digitaleenzymgebundenem Immunosorbent Assay (digitalEr ELISA)31,49sein. Das geringe Volumen, das große Array und die hohe Stabilität würden einige Vorteile gegenüber bestehenden digitalen Bioassay-Methoden mit sich bringen. Das FemDA-System, das in der Lage ist, verschiedene Anzahl von Vorlagen-DNA-Molekülen in Femtolitertröpfchen aufzulösen, hat bereits die Kraft eines genauen Proteinscreenings gezeigt13. FemDA ist ein neues In-vitro-Kompartimentisierungssystem, das in der Lage ist, eine Vielzahl von Enzymen schnell zu entwickeln. Mit den Fortschritten in der Bioinformatik und Bibliotheksbautechniken wird die Ära einer schnellen On-Demand-Erstellung von Hochleistungsproteinen sicherlich kommen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant Nummer JP18K14260 und dem Budget der Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology unterstützt. Wir danken Shigeru Deguchi (JAMSTEC) und Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) für die Bereitstellung der Charakterisierungsmöglichkeiten. Wir danken Ken Takai (JAMSTEC) für die kommerzielle Software-Unterstützung. Die Mikrofabrikation wurde in Takeda Sentanchi Supercleanroom, Der Universität Tokio, durchgeführt, unterstützt vom "Nanotechnology Platform Program" des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan, Grant Number JPMXP09F19UT0087.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

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References

  1. Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81, (13), 5111-5118 (2009).
  2. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, (3), 977-1026 (2005).
  3. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12, (12), 2146-2155 (2012).
  4. Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17, (1), 34-75 (2017).
  5. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24, (9), 395-402 (2006).
  6. Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46, (11), 114004 (2013).
  7. Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. Fan, C. Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).
  8. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
  9. Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9, (3), (2018).
  10. Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8, (11), 1292-1300 (2013).
  11. Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10, (5), (2019).
  12. Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. (2019).
  13. Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5, (8), 8185 (2019).
  14. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. (2019).
  15. Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18, (10), 104011 (2008).
  16. Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10, (24), 3355-3362 (2010).
  17. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
  18. Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28, (4), 729-735 (2010).
  19. Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21, (1), 698-709 (2013).
  20. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16, (13), 2481-2486 (2016).
  21. Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303, (2), 517-524 (2006).
  22. Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150, (1), 465-470 (2010).
  23. Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8, (5), 741-746 (2008).
  24. Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24, (46), 12078-12083 (2018).
  25. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57, (3), 827-863 (1985).
  26. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8, (10), 1632-1639 (2008).
  27. Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16, (1), 65-69 (2016).
  28. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  29. Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81, (12), 4813-4821 (2009).
  30. Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55, (9), 3120-3123 (2016).
  31. Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89, (1), 92-101 (2017).
  32. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8, (5), 870-891 (2013).
  33. Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9, (3), 439-446 (2008).
  34. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12, (3), 422-433 (2012).
  35. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (9), 4004-4009 (2010).
  36. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12, (5), 882-891 (2012).
  37. Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
  38. Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5, (3), 491-502 (2010).
  39. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. Analytical Chemistry. 79, (9), 3248-3253 (2007).
  40. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, (5), 407-409 (2013).
  41. Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, (6), 3473-3477 (1981).
  42. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19, (8), 751-755 (2001).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  44. Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. Conn, P. M. Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).
  45. Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. 630-632 (2013).
  46. Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4, (10), 3466-3470 (2012).
  47. Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7, (3), 034110 (2013).
  48. Gonzalez, R. C., Woods, R. E. Digital image processing. Pearson. New York, NY. (2018).
  49. Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10, (1), 345-363 (2017).

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