En Femtoliter Droplet Array för massivt parallell proteinsyntes från single DNA-molekyler

JoVE Journal
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Det övergripande målet med protokollet är att förbereda över en miljon beställda, enhetliga, stabila och biokompatibla femtoliterdroppar på ett 1 cm2 planarsubstrat som kan användas för cellfri proteinsyntes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Framsteg inom rumslig upplösning och detektionskänslighet för vetenskaplig instrumentering gör det möjligt att tillämpa små reaktorer för biologisk och kemisk forskning. För att möta efterfrågan på högpresterande mikroreaktorer utvecklade vi en femtoliterdroppsystem (FemDA) och exemplifierade dess tillämpning i massivt parallella cellfria proteinsynteser (CFPS) reaktioner. Över en miljon enhetliga droppar genererades lätt inom ett finger-storlek område med hjälp av en tvåstegs olja-tätning protokoll. Varje droppe var förankrad i en femtoliter microchamber består av en hydrofil botten och en hydrofoba sidovägg. Hybrid hydrofil-i-hydrofoba struktur och dedikerade tätningsoljor och ytaktiva ämnen är avgörande för att stabilt behålla femtoliter vattenlösning i femtoliter utrymmet utan avdunstning förlust. Femtolatorkonfigurationen och den enkla strukturen hos FemDA-enheten tillät minimal reagensförbrukning. Den enhetliga dimensionen av droppreaktorerna gjorde storskaliga kvantitativa och tidsloppsmätningar övertygande och tillförlitliga. FemDA-tekniken korrelerade proteinutbytet för CFPS-reaktionen med antalet DNA-molekyler i varje droppe. Vi effektiviserade förfarandena om mikrotillverkning av enheten, bildandet av femtoliterdropparna och förvärvet och analysen av mikroskopiska bilddata. Det detaljerade protokollet med optimerad låg driftskostnad gör FemDA-tekniken tillgänglig för alla som har standardrenrumsfaciliteter och ett konventionellt fluorescensmikroskop på sitt eget ställe.

Introduction

Forskare använder reaktorer för att utföra bio/kemiska reaktioner. Det finns betydande ansträngningar som har gjorts för att minska reaktorns storlek och öka den experimentella genomströmningen för att minska reagensförbrukningen och samtidigt förbättra arbetseffektiviteten. Båda aspekterna syftar till att befria forskare från en tung arbetsbelastning, minska kostnaderna och påskynda forskning och utveckling. Vi har en tydlig historisk färdplan för utvecklingen av reaktortekniken med tanke på reaktionsvolymer och genomströmning: enstaka bägare/kolv/provrör, milliliterrör, mikroliterrör, mikroliter 8-rörsremsor, mikroliter 96/384/1536-brunnsplatta och mikrofluidisk nanoliter/picoliter/femtoliterreaktorer1,,2,,3,,4,,5,,6,7. Analogt med nedskärningar av funktionen storlek transistorer på integrerade kretschips i halvledarindustrin under de senaste decennierna, bio / kemiska mikroreaktorer går igenom volymminskning och systemintegration. Sådana småskaliga verktyg har haft en djupgående inverkan på cellbaserad eller cellfri syntetisk biologi, biotillverkning och prototyper med hög genomströmning8,,9,10,11,12. Detta dokument beskriver vår senaste insats för utveckling av en unik droplet array teknik och visar dess tillämpning i CFPS13, en grundläggande teknik för syntetisk biologi och molekylär screening samhällen14. I synnerhet tillhandahåller vi avsiktligt ett optimerat och billigt protokoll för att göra FemDA-enheten tillgänglig för alla. Det billiga och lätthanterliga protokollet för den miniatyriserade enheten skulle bidra till universitetens utbildningsändamål och bidra till att sprida tekniken.

FemDA förbereder femtolter droppar på en ultrahigh densitet på 106 per 1 cm2 på en plana glassubstrat. Vi belagda en hydrofoba polymer, CYTOP15, på glassubstratet och selektivt etsade (bort) CYTOP vid fördefinierade positioner för att generera en mikrokammare array på substratet. Således består den resulterande mikrokammaren av en hydrofoba sidovägg (CYTOP) och en hydrofil botten (glas). När sekventiellt rinner vatten och olja över den mönstrade ytan, kan vattnet fångas och förseglas i mikrokammare. Den hydrofila-i-hydrofoba strukturen är avgörande för att stöta bort vatten utanför mikrokammare, isolera enskilda mikroreaktorer, och behålla en liten vattenlösning inne i femtolter utrymmet. Den unika egenskapen tillämpades framgångsrikt för beredning av vatten-i-olja droppar och lipid bilayer mikrokompar16,17. Jämfört med prototypenheten16optimerade vi först mikrotillverkningsprocessen för att förverkliga ett fullständigt avlägsnande av CYTOP-polymeren samt en fullständig exponering av glasbotten. CYTOP är en speciell fluorpolymer med extremt låg ytspänning (19 mN/m) lägre än för konventionella mikroreaktormaterial som glas, plast och silikon. Dess goda optiska, elektriska och kemiska prestanda har redan utnyttjats vid ytbehandling av mikrofluidiska enheter18,,19,20,21,22,23,24. I FemDA-systemet, för att uppnå god vätning av oljan på CYTOP-ytan, måste oljans ytspänning vara lägre än den fastaytans 25. Annars tenderar den flytande oljan som kommer i kontakt med den fasta ytan att bli sfärisk snarare än att sprida sig över ytan. Dessutom fann vi att vissa populära perfluorkolväten oljor (t.ex., 3M FC-40)16 och fluororoether oljor (t.ex., 3M Novec-serien) kan lösa cytop som ett resultat av amorf morfologi av CYTOP, vilket är dödligt för kvantitativ mätning och skulle ifrågasättas i form av korskontaminering bland droppar. Lyckligtvis identifierade vi en biokompatibel och miljövänlig olja uppvisar lägre (< 19 mN / m) ytspänning13. Vi hittade också ett nytt ytaktivt företag som kan lösas upp i den valda oljan och funktion i en låg koncentration (0,1%, minst 10 gånger lägre än tidigare rapporterats populära26,27)13. Det resulterande vatten-/oljegränssnittet kan stabiliseras av ytaktivt. På grund av oljans höga avdunstningshastighet, efter spolningen med oljan, applicerade vi en annan biokompatibel och miljövänlig olja för att ersätta den första för att täta mikrokammare. Vi kallar den första oljan (ASAHIKLIN AE-3000 med 0,1 wt % SURFLON S-386) "spololja" och den andra oljan (Fomblin Y25) "tätningsoljan", respektive.

Den tvåstegs oljetätningsstrategin kan förverkliga en robust bildning av femtolterdropparsystemet inom några minuter och utan sofistikerad instrumentering. På grund av avdunstningsproblemet har det ansetts vara svårt att generera mikroreaktorer som är mindre än picolitervolymerna28. FemDA tog upp denna fråga genom att systematiskt optimera de material och processer som används för beredning av mikroreaktorer/droppar. Flera anmärkningsvärda funktioner i de resulterande dropparna inkluderar hög enhetlighet (eller monodispersitet), stabilitet och biokompatibilitet på femtoliterskalan. Variationskoefficienten (CV) för droppvolymen är endast 3 % (utan vinjetteringskorrigering för mikroskopiska bilder), det minsta CV:t bland droppplattformar i världen, vilket säkerställer en mycket parallell och kvantitativ mätning. Femtoliterdroppen är stabil i minst 24 timmar utan korskontaminering bland droppar vid rumstemperatur, vilket är värdefullt för en tillförlitlig tidsförloppsmätning. När det gäller biokompatibilitet lyckades vi syntetisera olika proteiner från en enda kopia mall DNA i femtoliter droppen, som tidigare hade ansetts svårt eller ineffektiv29,30. Det skulle vara värt att belysa varför vissa proteiner som kan syntetiseras i FemDA inte kan syntetiseras i andra droppsystem. FemDA var inte bara ett tekniskt framsteg, men också insåg en aldrig tidigare skådad kvantitativ mätning som kan korrelera proteinavkastningen (vilket återspeglas av fluorescensintensiteten hos droppen) till antalet mall-DNA-molekyler i varje droppe. Som ett resultat visade histogrammet av fluorescensintensiteten hos droppar från FemDA-baserade CFPS en diskret fördelning som fint kan monteras av en summa gaussiska fördelningar av lika topp-till-topp intervall. Dessutom var sannolikheten för förekomst av droppar som innehåller olika antal DNA-molekyler en perfekt passform till en Poisson fördelning31. Således kan de olika proteinavkastningen i varje droppe normaliseras baserat på den diskreta fördelningen. Denna kritiska funktion gör det möjligt för oss att skilja den enzymatiska aktivitetsinformationen från den skenbara intensiteten, som ännu inte har varit tillgänglig med andra mikroreaktorplattformar. Befintliga mikrofluidiska cell-/droppsorteringssystem är skickliga på helautomatisk sortering och bra på att koncentrera prover, men ibland kan bara produktionen av ett relativt brett eller långstjärtat histogram i den analytiska aspekten32,33. Vårt mycket kvantitativa och biokompatibla FemDA-system sätter ett nytt riktmärke och en hög analytisk standard inom mikroreaktorutveckling.

De oljor och ytaktiva ämnen som kan användas för framställning av droppar är fortfarande mycket begränsade34. Kombinationen av ASAHIKLIN AE-3000 och SURFLON S-386 etablerade i FemDA är en ny medlem av den växande arsenalen av det fysiokemiska gränssnittet mellan vattenfasen och oljefasen13. Det nya gränssnittet i FemDA är fysiskt stabil, kemiskt inert, och biologiskt kompatibel med komplexa transkription, översättning och post-translationell modifiering maskiner för många typer av proteiner13. Det skulle vara ganska attraktivt att hitta ett protein som inte kan syntetiseras i droplet inställningar istället. Dessutom är kostnadsbesparingen av reagenser tydligare i femtolterdroppsystemet än i nanoliter- och picoliterreaktorsystem35,36. I synnerhet skulle det ofta finnas en stor död volym, som huvudsakligen orsakas av slangar eller externa leveranser, i mikrofluidiska droplet generation system men inte i vår FemDA. Matrisformatet gynnas också av upprepad och detaljerad mikroskopisk karakterisering (liknande så kallad höginnehållsanalys) för varje enskildreaktor 37, snarare än bara en enda ögonblicksbild för ett snabbrörligt objekt. Femtoliterskalan möjliggjorde integration av över en miljon reaktorer på ett fingerstort område, medan samma antal nanoliterreaktorer (om sådana finns) kräver ett område med kvadratmeter, vilket utan tvekan skulle vara opraktiskt att tillverka eller använda ett sådant system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikrotillverkning av femtolitermikrokammarmatrissubstratet

OBS: Utför följande mikrotillverkningsexperiment i ett renrum. Använd handskar och en renrumsdräkt innan du går in i renrummet.

  1. Rengöring av överknäckat glassubstrat
    1. Ställ täckglaset på ett omslagsglas glas glas glas. Sonikera täckglaset i 8 M natriumhydroxid (NaOH) i 15 min vid rumstemperatur (RT).
      VARNING: NaOH i höga koncentrationer är mycket farligt för hud och öga. Hantera den försiktigt utan stänk.
    2. Ta ut racket ur NaOH-lösningen och skölj täckglaset med vatten i tio gånger. Förvara täckglaset i rent vatten.
      OBS: Kasta det alkaliska avfallet till den avsedda tanken. NaOH-lösningen kan återvinnas till originalflaskan och användas i upp till fem gånger.
    3. Torka varje bit av täckglas med en luftblåspistol.
    4. Grädda det torkade täckglaset på en kokplatta vid 200 °C i 5 min. Se till att glassubstratets övre sida är konsekvent under följande hanteringsprocesser.
  2. Silanisering av glasytan
    1. Återställ det rengjorda täckglaset på ett torrt färgställ.
    2. Tillsätt 150 ml etanol i en PTFE-bägare. Använd en nål (22 G x 70 mm) utrustad 1 ml spruta för att dra 0,075 ml (3-aminopropyl)triethoxysilane och injicera den omedelbart på etanol (dvs. 0,05 volymprocent %). Dra och tryck på sprutan flera gånger för att skölja insidan av sprutan. Rör om lösningen med nålen för att göra den homogen.
      OBS: (3-aminopropyl)triethoxysilane kan förvaras i rumstemperatur och 1 atm tryck i två år med en tät tätning. Absolut etanol bör förseglas tätt efter användning. Vi rekommenderar inte att du använder några utgångna reagenser.
    3. Inkubera täckglaset i 0,05 vol % aminosilanelösning för 1 h vid RT.
    4. Skölj täckglaset med rent vatten i fem gånger. Förvara täckglaset i rent vatten.
      OBS: Kasta avfallet till den avsedda tanken.
    5. Torka varje bit av täckglas med luftblåspistol.
    6. Placera alla torkade täckglas på aluminiumfolie. Grädda täckglaset på värmeplattan vid 80 °C i 5 min.
  3. Spin-beläggning CYTOP perfluoropolymer
    1. Placera täckglaset på en anpassad vakuumchutt på en spinnkappa (bild 1A). Slå på vakuumbrytaren för att fixera glassubstratet.
      OBS: Vakuumchuckens konstruktion är avgörande för en enhetlig beläggning av viskös polymer på det rektangulära (24 mm × 32 mm) och tunt (0,13-0,17 mm) substrat (figur 1A). Vi fann att ett rektangulärt prov steg med flera hål (48 hål, var och en med 1 mm diameter) ansluter till vakuumkanalen fungerade bättre än den runda scenen med ett enda centralt hål gjorde.
    2. Släpp 70-90 μL av typ-A CYTOP polymer i mitten av glassubstratet. Snurra omedelbart polymeren (figur 1B).
      OBS: Spinnbeläggningstillståndet (3 400 varv/min, 30 s) ger 3 μm tjocklek. Använd mikropipettan avsedd för trögflytande vätska. Håll mikropipettan upprätt för att få polymeren att falla nästan perfekt cirkel på substratet. En luftbubbla genereras ofta inuti pipettspetsen när kolven rör sig nedåt. Tappa inte den sista droppen av CYTOP med bubblan.
    3. Plocka upp det belagda glaset med fingrarna som håller hörn av glassubstratet, och placera den på aluminiumfolie.
    4. Upprepa steg 1.3.1-1.3.3 för att spin-coat alla återstående delar av locket glas.
    5. Grädda det belagda glaset vid 80 °C i 30 min och sedan vid 200 °C i 1 h.
      OBS: Denna bearbetning botar cytop och kovalent binda CYTOP till glasytan. Täck bakningsområdet med ett lock av aluminiumfolie för att undvika eventuellt damm under lång tid bakning processen om det behövs.
    6. Ta bort det CYTOP-belagda täckglaset från värmeplattan och kyl ner till RT. Plocka försiktigt upp varje bit av det belagda glaset och inspektera det för att se om det är ordentligt belagt. Kassera substratet uppvisar inhomogen beläggning.
      OBS: Ytan på en fint bestruken CYTOP bör se platt utan oregelbundna regnbågsliknande mönster (figur 1C). Visuell inspektion från en korrekt vinkel kan snabbt bedöma planhet samt beläggningskvalitet. Protokollet kan pausas här.
  4. Spin-beläggning fotoresist
    1. Placera det CYTOP-belagda täckglaset på vakuumchucken (se steg 1.3.1) på spindellacken. Slå på vakuumbrytaren för att fixera täckglaset.
    2. Släpp 0,2-0,3 ml fotoresist i mitten av substratet. Snurra omedelbart fotoresisten vid 6000 rpm för 60 s.
      OBS: Tappa inte den sista droppen av fotoresistensen med bubblor. Om spinnlackern stöder högre rotationshastighet kan rotationshastigheten vara upp till 7 500 varv/min för att uppnå en tunnare beläggning. Den låga ytan energi cytop hindrar de flesta av fotoresister från att följas på dess yta. Om AZ P4903 photoresist inte är tillgänglig, är AZ P4620 photoresist ett bra alternativ.
    3. Plocka upp det belagda substratet med två fingrar som håller i substratets hörn. Torka av överflödig fotoresist nära substratkanten (kallas ofta som kantpärlor eller EBR) med hjälp av en etanoldränkt ren torkare (figur 1D). Placera substratet på aluminiumfolien.
      Aceton rekommenderas INTE för EBR.
    4. Upprepa steg 1.4.1-1.4.3 för att spin-coat fotoresisten för de återstående bitarna av CYTOP-belagda täckglas. Plocka upp varje bit av det belagda glaset och inspektera den för att se om den är ordentligt bestruken.
      OBS: Ytan på en fint bestruken fotoresist bör se platt utan oregelbundna mönster (Figur 1D). Visuell inspektion från en korrekt vinkel kan snabbt bedöma planhet samt beläggningskvalitet. Substratet uppvisar inhomogen beläggning kan återvinnas genom tvätt med aceton, 2-propanol, och H2O i följd, och återanvändas.
    5. Grädda det belagda substratet vid 110 °C i 5 min på värmeplattan.
    6. Ta bort det belagda substratet från värmeplattan och kyl ner till RT. Låt stå i 30 min vid en relativ luftfuktighet på 40%-60% för rehydrering av fotoresisten.
      OBS: H2O är nödvändigt för följande fotokemiska reaktion. Den bakade fotoresisten förlorade H2O innehåll inuti fotoresisten. Rehydreringsprocessen gör att H2O kan absorberas från luften. Relativ luftfuktighet lägre än 20% eller högre än 80% är inte lämplig för rehydrering processen.
  5. Photolithography
    1. Under väntetiden för rehydrering (se steg 1.4.6) startar du mask alignern. Värm upp ljuskällan. Ladda kromfotomasken.
      OBS: Följ bruksanvisningen för att använda mask alignern. Fotomasken kan tillverkas via elektronstråle (EB) litografi om EB-anläggningen finns tillgänglig. Alternativt kan fotomasken läggas ut på entreprenad till ett lokalt företag.
    2. Fyll på det rehydrerade substratet (efter avslutad steg 1.4.6) på chucken (bild 1E).
    3. Ställ in exponeringsparametrar. Exponera substratet i 25 s med en UV-intensitet på 13 mW/cm2 (h-line) i vakuumkontaktläge. Lasta sedan av substratet och ställ in det på överdragsglaset (samma rack som används i steg 1.1.1).
    4. Upprepa steg 1.5.2-1.5.3 för att exponera de återstående delarna av det rehydrerade substratet.
  6. Utveckling
    1. Utveckla substratet i 5 min för att lösa upp den exponerade fotoresisten (Bild 1F). Under vilken, försiktigt skaka rack i utvecklaren en gång vid tidpunkten för 4 minuter.
      OBS: Exploatören var AZ 300 MIF. Alternativa alkaliska utvecklare (t.ex. AZ 400 K) är i allmänhet tillämpliga för utveckling, men bör kräva optimering av utvecklingsförhållanden (t.ex. tid, temperatur, agitation). Använd INTE glasbägare som utvecklarbehållare.
    2. Skölj substratet med rent vatten i tio gånger. Förvara täckglaset i rent vatten.
      Obs: Kasta utvecklaren till den avsedda tanken.
    3. Torka noggrant varje bit substrat med luftsprutan.
  7. Reaktiv jonetsning
    1. Placera det torkade substratet (från steg 1.6.3) i reaktionskammaren på reaktiv jonetsning (RIE) maskinen.
      OBS: Enligt underhållsregeln för anläggningen kan RIE-maskinen antingen alltid vara på eller stängas av varje gång. Om strömbrytaren var avstängd, slå på strömbrytaren enligt manualen.
    2. Etsa den fotoresist-avslöjade CYTOP med O2 plasma (Figur 1G).
      OBS: RIE villkoret var följande. O2 gasflöde: 50 fmcm; kammartryck: 10.0 Pa; RF-effekt: 50 W; etsningstid: 27 min. Etsningstiden optimerades för helt etsning av 3 μm tjocklek av CYTOP.
    3. Pick up every piece of substrate from the reaction chamber using the tweezer and place them on the cover glass staining rack.
      OBS: Enligt anläggningens underhållsregel kan reaktionskammaren kräva2 en kort O 2-plasmarengöringsprocess (t.ex. etsningstid: 5 min) för att hålla reaktionskammaren ren efter varje körning.
  8. Ta bort fotoresist och rengöring
    1. Sonikera substratet i aceton i 5 min på RT för att lösa upp den återstående fotoresisten.
    2. Sonicate substratet i 2-propanol för 5 min på RT.
    3. Skölj substratet med rent vatten fem gånger. Sonikera substratet i 5 min på RT. Skölj provet med rent vatten i ytterligare fem gånger. Förvara substratet i rent vatten.
    4. Torka varje substrat med luftspjälken (figur 1H).
      OBS: Substratet kan förvaras i en plast petriskål. Det tillverkade substratet är strukturellt stabilt vid RT i minst ett år. Protokollet kan pausas här.
    5. Karakterisera ytprofilen för det som berett substratet med tredimensionell (3D) laserscanningskonfokalmikroskopi, vitt ljusinterferometri (eller koherensskanningsinterferometry) eller svep elektronmikroskopi. Använd respektive programvara för att mäta diametern och djupet på de resulterande mikrokammare.
      OBS: Provet kan återanvändas för andra experiment efter karakteriseringen med den beröringsfria och icke-förstörande 3D-laserscanningskoncocalmikroskopet eller vit ljusinterferometer. Protokollet kan pausas här.

2. Beredning av mikrokanal med polydimetylsiloxan (PDMS)

OBS: Använd INTE latexhandskar för att hantera PDMS. Använd istället polyetenhandskar (PE).

  1. Göra mikrokanal mästare
    1. Skär en dubbelbelagd lim Kapton filmtejp i en definierad (3 mm x 19 mm) mikrokanal form med hjälp av en stationär fräs.
      Kaptontejpen var nr 7602 #25 (Teraoka Seisakusho), vilket resulterade i en kanalhöjd på 135 μm. Stika desktop cutter använder en plugin (tillgänglig från Roland hemsida: https://www.rolanddga.com) av Adobe Illustrator för att köra styckning enligt ritningen i Adobe Illustrator filen. Protokollet kan pausas här.
    2. Stick varje snitt Kapton tejp på den platta botten av en petriskål. Standard 90 mm petriskål rymmer 12 delar av bandet.
      OBS: Lättnadsstrukturen fungerar som en mästare för replikgjutning av PDMS. Tryck tejpytan försiktigt med en pincett om det finns några luftbubblor inklämda mellan tejpen och petriskålssubstratet. Alternativt kan klassisk mjuk-litografi appliceras för att förbereda befälhavaren på en kisel wafer38. Protokollet kan pausas här.
  2. Härdning PDMS harts i bandmönstrade petriskål
    1. Använd nya PE-handskar och överför 2,5 g härdningsmedel i SYLGARD 184 silikonelastomer med hjälp av en engångsplastpipet i den angivna plastbägaren (figur 2A).
    2. Byt till nya handskar och överför 25 g av förpolymerbasen på SYLGARD 184 silikonelastomer med en engångsspruta på 50 ml i ovanstående plastbägare.
      OBS: Byt handskar häri för att förhindra eventuell korskontaminering av härdningsmedlet till basen.
    3. Använd en avering mixer för att blanda och avaerera blandningen (program: 3 min blandning följt av 2 min deaeration).
      OBS: Om avluftningsblandaren inte är tillgänglig kan en manuellt upprörd (i ca 15 min) blandning avgasas i en vakuumkammare.
    4. Häll PDMS-blandningen i den tejpmönstrerade petriskålen (figur 2B). Ställ petriskålen i en minivakuumkammare och deaerate PDMS blandningen för 1-3 h(Figur 2C).
      OBS: Om någon luft finns kvar i PDMS-blandningen efter 1 h, ta ut petriskålen ur vakuumkammaren, bryt luftbubblan med en luftfläkt och lägg sedan tillbaka petriskålen i vakuumkammaren och fortsätt avluftningsprocessen.
    5. Placera petriskålen i en ugn vid 60 °C över natten för att härda PDMS(bild 2D).
      OBS: Även om en höjning av temperaturen kan förkorta härdningstiden, är den maximala temperaturen som kan tolereras av polystyren petriskål utan fysisk deformation ca 60 °C.
  3. Replikgjutning av PDMS-kanal
    1. Skala av den härda PDMS-elastomern från petriskålen (figur 2E).
    2. Klipp av varje bit PDMS-kanalblock med en plattkabelsax(bild 2F).
    3. Placera PDMS elastomer på en skärmatta vänd kanalsidan uppåt. Slå ett hål i varje ände av kanalen med hjälp av en biopsi punch (Figur 2G).
    4. Rengör ytan på PDMS-kanalen med tejp. Linda sedan PDMS harts i en annan bit skotsk tejp för att hålla den ren före användning. Förvara den förberedda PDMS-kanalen i en ren petriskål.
      Protokollet kan pausas här.

3. Montering av femtoliter mikrokammare array enhet

  1. Placera några bitar av vattendränkta rena torkar längs insidan väggen av en petriskål för att göra en förenklad befuktning kammare. Placera PDMS-hartset som täcks av tejpen i befuktningskammaren och försegla kammaren med paraffinfilm. Inkubera i minst 3 timmar men inte längre än en dag.
    OBS: PDMS är ett poröst material som gör att gas kan passera över hartset39. Den porösa strukturen av PDMS leder till en absorption av vattenmolekyler från omgivningen tills de når en jämvikt. Denna förbehandling fyller porerna i PDMS med vattenånga och kan avsevärt undertrycka avdunstningen av vattendroppar intill kanten av PDMS-kanalen.
  2. Ta bort tejpen från PDMS harts. Placera PDMS-kanalen på mikrokammarens matrisområde i substratet (bild 2H).
    OBS: PDMS hartset fastnar på CYTOP-ytan. Tryck försiktigt på PDMS-blocket med en pincett för att avlägsna eventuella luftbubblor mellan PDMS-hartset och substratet om sådana finns.
  3. Sätt i en 200 μL icke-filtrerad pipettspets på en (som utlopp) av hålen på PDMS-kanalen.
    OBS: Vidhäftningsstyrkan mellan PDMS och CYTOP är begränsad. För att undvika fysisk deformation av PDMS harts samt lossnar PDMS-kanalen från ytan, sätt inte in pipettspetsen för djupt.

4. Lastning av reaktionslösning på den monterade enheten

  1. Sätt ett mikrorör i aluminium på isen. Prechill spololjan (ASAHIKLIN AE-3000 olja blandad med 0,1 wt % SURFLON S-386 ytaktivt medel) i en 1,5 ml mikrorör på aluminium stativ.
  2. Lägg ett aluminiumblock till på is.
  3. Förberedelse av CFPS-reaktionslösning
    1. Förbered CFPS-reaktionslösningen i ett PCR-rör. Blanda varje alikvotkomponent i CFPS-satsen, en utspädd mall-DNA (som exemplifieras häri av fluorescerande protein mNeonGreen40 och Escherichia coli alkalisk fosfatas41) lösning och andra nödvändiga komponenter enligt de specifika behoven (t.ex. RNase-hämmare, fluorogena substrat, förkläde).
      OBS: Mall-DNA som används för CFPS måste beredas enligt instruktionerna i motsvarande CFPS-sats. Den här demonstrationen tillämpade ett T7-baserat uttryckssystem42. Eftersom reagensförbrukningen i FemDA-enheten är ganska liten är 10 μL tillräckligt stor för att fylla hela PDMS-kanalen.
    2. För mNeonGreen fluorescerande proteinsyntes, blanda komponenterna i följande ordning: tillsätt 2,7 μl nukleafri H2O till en 6 μL alikvot av lösning A (från CFPS-satsen); tillsätt 0,3 μl RNase-hämmare; Tillsätt 1,5 μl utspädd dna-lösning av mallen, Blanda och överför blandningen till en 4,5 μL alikvot av lösning B (från CFPS-satsen).
      OBS: Den totala volymen är 15 μL. Eftersom mängden av varje alikvot står i proportion till den slutliga blandningens totala volym, kan en total volym som är mindre än 10 μL resultera i en alldeles för liten volym (< 0,2 μL) av någon komponent alikvot.
    3. För alkalisk fosfatassyntes, blanda komponenterna i följande ordning: tillsätt 1,2 μl av H2O till 6 μL lösning A; tillsätt 0,3 μl RNase-hämmare; Tillsätt 0,6 μl disulfidbindningsförstärkare 1 och 2 (från ett kit), tillsätt 0,3 μl 5 mM 6,8-difluor-4-metylumbelliferylfosfat (DiFMUP), tillsätt 1,5 μl DNA-lösning, blanda och överför blandningen till 4,5 μl lösning B.
      OBS: I analysen av alkalisk fosfatas kan det fluorogena substratet DiFMUP producera mycket fluorescerande 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-metylcoumarin (DiFMU) vid enzymatisk klyvning av terminalfosfatgruppen.
  4. Dra upp 10 μL av blandningen med en 200 μL icke-filtrerad pipettspets. För in pipettspetsen i inloppshålet (se steg 3.3) på PDMS-kanalen. Tryck ner kolven för att injicera lösningen på kanalen tills den svämmar över från utloppet (där en annan pipettspets redan har satts in i steg 3.3).
  5. Separera pipetten från pipettspetsen och håll dessa två pipettspetsar fortfarande insatta på inloppet och utloppet.
    OBS: Undvik att generera luftbubblor under pipetteringen. Lämna inte tummen från kolven förrän pipetten har separerats från pipettspetsen för att förhindra att lösningen kommer tillbaka inuti PDMS-kanalen.

5. Generera femtoliterdroppar (FemDA) för CFPS

  1. Överför hela uppsättningen av den monterade enheten till det förkylda aluminiumblocket (se steg 4.2). Kontrollera noggrant att matrisområdet för mikrokammare snabbt övergår från genomskinligt (figur 2I) till transparent (figur 2J).
    OBS: CFPS-reaktionslösningen kan inte direkt komma in i mikrokammaren. Lösligheten av luft i vatten är i omvänd proportion till temperaturen. Den instängda luften kommer att lösas upp i lösningen efter att enheten flyttats från RT till den låga temperaturen. Transparensförändringen är en praktisk visuell indikator för att bedöma om lösningen kommer in i mikrokammaren.
  2. Dra 30 μL av den förkylda spololjan (se steg 4.1) och överför omedelbart oljan till den inloppsinsatta pipettspetsen från den övre öppningen. Spololjan rör sig in i kanalen och extruderar den överflödiga reaktionslösningen som ligger utanför mikrokammaren. Varje mikrokammare isoleras av spololjan.
    OBS: Det rörliga gränssnittet mellan reaktionslösningen och spololjan är synligt, vilket hjälper människor att observera vätskans rörelse inuti kanalen. Den extruderade lösningen kan samlas in i det tidigare röret, förvaras vid 4 °C och återanvändas för en annan FemDA-enhet eller en parallell bulkreaktion (i mikrotuben eller en mikrotiterplatta).
  3. Fördragning 30 μL tätningsolja (Fomblin Y25) till en 200 μL filtrerad pipettspets. Häng pipetten upprätt någonstans.
  4. Ta samtidigt bort de två insatta pipettspetsarna (se steg 3.3 och 4.4) från enheten. Omedelbart flytta enheten från aluminiumblocket till parafilm.
    OBS: Använd en pincett för att fixera (men håll dig borta från kanalområdet) enheten på aluminiumblocket under perioden för att ta bort pipettspetsarna.
  5. För omedelbart in den färdiga pipettspetsen som innehåller tätningsoljan (se steg 5.3) i PDMS-kanalens inlopp och injicera oljan i kanalen tills den svämmar över från utloppet.
    Obs: Utför detta steg så snart du flyttar enheten till RT. För att förhindra tillbakaflödet inuti kanalen, lämna inte tummen från kolven förrän tätningsoljan svämmar över från utloppet. Spololjan avdunstar omedelbart efter att den flyttat ut ur kanalens utlopp, medan följande tätningsolja ackumuleras i utloppet på grund av dess extremt låga avdunstningsförlust.
  6. Separera pipetten från pipettspetsen och ta sedan bort pipettspetsen från enheten. Rengör PDMS-ytan med hjälp av en bit av den rena torkaren och applicera sedan en ny droppe tätningsolja på inloppet respektive utloppet. Femtolitdropparna förseglas i enskilda mikrokammare av oljan.
    OBS: Använd en pincett för att fixera (men håll dig borta från kanalområdet) PDMS-kanalen på substratet under perioden för att ta bort mikropipettespetsen.
  7. Torka av den fukt som samlats på täckglasets nedre yta. Den förberedda FemDA-enheten är nu redo för inkubering och mikroskopiavbildning.

6. Mikroskopi bildbehandling

  1. Starta ett inverterat fluorescensmikroskop. Vänta på kamerans stabilisering (kylning). Använd en 60x eller 100x olja nedsänkning objektiv. Ställ in FemDA-enheten på den motoriserade scenen. Ställ in bildningsparametrarna.
    Bildframställningsparametrarna inkluderar filsökvägen, bildkanaler, filter, exponeringstider (i allmänhet räcker det med 100 ms; kortare eller längre tid är också möjlig enligt kamerans specifikation) och ljusintensitet.
  2. Hitta fokalplanet. Justera objektivets z-axelposition och fäst fokalplanet med hjälp av ett internt autofokussystem. Ange att det område av intresse (ROI; d.v.s. x, y-axeln) ska avbildas.
    OBS: De stora mikroskop tillverkare (Nikon, Olympus, Zeiss, Leica) alla ger möjlighet att integrera autofokus systemet med mikroskop. Detta autofokussystem är nödvändigt för att hålla fokalplanet konstant under den automatiska flerområdesavbildningen. ROI täcker FemDA-området i PDMS-kanalen.
  3. Fånga fluorescensbilderna. Fånga en enda bildruta i en ofokuserad BF-bild (Bright-Field) för varje avkastning. Ändra INTE ordningen och koordinaterna för ROIs när de olika kanalerna avbildas.

7. Bilddataanalys

OBS: Analysera bilddata med hjälp av en hemmagjord plugin (som heter "FemDA") baserat på Fiji (http://fiji.sc) för att extrahera fluorescensintensiteten för varje droppe43. Installera rätt version av Fiji enligt operativsystemet. Fiji stöder de flesta bildfilformat (t.ex. den 2-fil från Nikon mikroskop, czi fil från Zeiss mikroskop) med hjälp av en inbyggd plugin "Bio-Formats."

  1. Plugin-installation
    1. Kopiera och klistra in plugin-filen (som är tillgänglig vid förfrågan till motsvarande författare eller via följande institutionella länk: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) i Fijis "plugins" mapp.
    2. Starta Fiji-programvaran; plugin "FemDA" finns i rullgardinsmenyn "Plugins" i Fiji.
  2. Förbehandling av bilddata
    1. Öppna den ofokuserade BF-bilden (se steg 6.3). Klicka på Process | Subtrahera bakgrund... för att ta bort jämna kontinuerliga bakgrunder i varje bildbildsdata(bild 4B). Klicka på Process | Filter | Median för att minska bruset i varje bildbildsdata(bild 4C).
    2. Klicka på Bild | Justera | Tröskelvärde för att kontrollera och separera förgrunden (som anger mikrokammare) från bakgrunden (som anger området utanför mikrokammare) för varje bildruta (förstorade skär i figur 4A-C).
      Obs: Välj en korrekt algoritm från listrutan i tröskelfönstret så att endast mikrokammare områden, liksom kanterna på varje mikrokammare, kan identifieras och markeras som förgrunden. I synnerhet måste de flesta av de markerade kanterna vara kontinuerliga utan mellanrum.
  3. Bestämning av droppkoordinat
    1. Klicka på Plugins | FemDA | FemDA Analys för att öppna det grafiska användargränssnittet (GUI) av den anpassade plugin (övre halvan av figur 4D).
    2. Mata in det ungefärliga minimi- och maximiantalet pixlar i en enda mikrokammare. Mata in den förväntade minsta och högsta cirkeliteten (0: godtycklig form; 1: perfekt cirkel) av mikrokammare. Mata in bildrutenumret för startramen och slutramen.
    3. Klicka på Generera ROI på GUI för att identifiera varje mikrokammare, och de framgångsrikt upptäckta ROM visas i ett popup-fönster ROITable.
    4. Gå tillbaka till fönstret FemDA Analys och klicka på knappen Använd ROI mask för att kontrollera om mikrokammare över ramarna upptäcktes korrekt (nedre vänstra figur 4D). Om nej, ändra några av dem och upprepa klicka på Generera ROI och Använd ROI-mask. Om ja, gå till nästa steg.
      OBS: Det kan finnas ett fåtal mikrokammare som inte kan identifieras väl som ROI (se den nedre halvan av figur 4D) av någon algoritm av tröskelvärdet på grund av den otillräckliga kontrasten mellan förgrunden och bakgrunden. Det är inte problematiskt i den statistiska synvinkeln.
  4. Fluorescensintensitetsextraktion
    1. Öppna fluorescensbilden och ta den fram. Klicka på Använd ROI-mask igen om du vill använda de bestämda rois på fluorescensbilden (nedre högra figur 4D).
    2. Välj antingen One-Shot för att analysera en slutpunktsbild (som exemplifieras med mNeonGreen-data) eller Time-Lapse för att analysera en tidskördsdata (som exemplifieras med alkaliska fosfatasdata).
    3. Indata 100 i rutan Antal översta pixlar innebär att endast de översta 100 pixlarna i varje avkastning kommer att användas för att beräkna medelintensiteten för motsvarande droppe. Om indata 0 i antalet översta pixlaranvänds alla pixlar i varje avkastning på avkastningen för att beräkna medelintensiteten för motsvarande droppe.
      OBS: Det kan finnas en drift av flera pixlar mellan BF och fluorescensbilder, vilket innebär att vissa pixlar i ROIs kan tillhöra bakgrunden av fluorescensbilden. Därför ger plugin ett alternativ för att ange antalet toppintensitetsrankade pixlar för beräkning av medelintensiteten för varje droppe.
    4. För analys av slutpunktsbilden (dvs. välj One-Shot i steg 7.4.2) klickar du på knappen Mät intensitet för att beräkna medelnivåerna för alla upptäckta droppar. ROITable uppdateras med nya data från fluorescensbilden. Under tiden visas ett histogram i ett nytt popup-fönster Histogram (Bild 4E).
      Om du ändrar lagerplatsstorleken i rutan Lagerplatsnummer kan du optimera visningen av histogrammet. En passande till en summa av Gaussian fördelningar kan vara fulländat i det framkallade GUI. Popup-fönstret i Fiji visar de passande resultaten. Alternativt kan du exportera uppgifterna genom att klicka på knappen spara som text och utföra olika statistiska analyser med annan programvara ( bild4F, G).
    5. För analys av tidskursen (dvs. välj Time-Lapse i steg 7.4.2), är popup-fönstret Intensitetstidskurs i stället för Histogram, som innehåller ett histogram som motsvarar en viss tidpunkt och ett tidsintensitetsdiagram (figur 5). Textdata kan också exporteras med hjälp av Arkiv-menyn i popup-fönstret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikrofabriceringsprocessen består av substratrengöring, ytfunktionalisering, CYTOP-beläggning, fotolitografi, torretsning, fotoresiststriktion och slutrengöring. Viktigt är att det presenterade protokollet tillät fullständigt avlägsnande av den hydrofoba CYTOP-polymeren inuti mikrokammare figur 3A), vilket ger en mycket parallell hydrofil-i-hydrofoba struktur på ett standardtäcke glassubstrat. Med hjälp av oljetätningsprotokollet kontrollerades den enhetliga dimensionen av de resulterande dropparna genom att fluorescerande lösning kapslades i mikrokammare (figur 3B). Fluorescensintensiteten som extraheras med hjälp av den utvecklade programvaran är en bra indikator på droppstorleken. Fluorescensintensitetens CV, 3 %, återspeglade den smala fördelningen av droppstorleken över hela matrisen (figur 3C). Den rekonstruerade 3D-bilden från konfokalmikroskopi visade också den konsekventa droppvolymen över tiden (figur 3D, Kompletterande film 1)44. I jämförelse genererade en allmänt använd FC-40 olja dropparna uppvisar en flerafaldig skillnad i fluorescensintensiteten45. De bildade dropparna i FemDA var stabila på RT i minst 24 timmar (figur 3E). Den höga kvaliteten på dropparna utgjorde så småningom grunden för kvantitativ mätning.

Data med hög genomströmning kräver dataanalysverktyg med hög genomströmning46,47. Den utvecklade plugin kraftigt förenklas och påskyndas bilddataanalys. Baserat på teorin om digital bildbehandling48kan den ofokuserade BF-bilden binariseras och användas för att ge koordinatinformation för varje droppe efter bakgrundskorrigering och brusreducering (figur 4A-C). Denna idé gjorde den exakta lokaliseringen av mörka droppar möjligt.

Fluorescerande proteinet mNeonGreen syntetiserades i FemDA. Mall DNA med en koncentration av 0,05 molekyler per droppe delades slumpmässigt i varje droppe för att initiera proteinsyntesen med kopplade cellfria transkription och översättningsreaktioner. Eftersom det genomsnittliga antalet DNA-molekyler per droppe var mindre än 1 innehöll vissa droppar noll mall-DNA, medan andra innehöll en eller flera DNA-molekyler. Efter 6 timmars inkubation vid RT togs slutpunktsbilden med mikroskopet. Stacken bilddata analyserades av den utvecklade programvaran med hjälp av den samtidiga ofokuserad BF bild (Figur 4A-E). Fluorescensintensiteten för varje droppe är ett mått på proteinavkastningen i motsvarande dropp. Histogrammet av fluorescensintensiteterna visade en diskret fördelning och var väl utrustad med en summa gaussiska fördelningar av lika topp-till-topp intervall (figur 4F), som starkt föreslog en beläggning av olika antal DNA-molekyler per droppe. I likhet med det upprepade mynt-vända spelet, antalet oberoende slumpmässiga händelser som inträffar är matematiskt beskrivs av Poisson fördelningen. Sannolikheten för förekomst av droppar som innehåller olika tal (upp till 3 i detta exempel) av DNA-molekyler passade perfekt till en Poisson-fördelning (P = e• λk / k!, där λ är det förväntade genomsnittliga antalet DNA-molekyler per droppe och k är det faktiska antalet DNA-molekyler i en droppe) med ett genomsnitt på 0,05 DNA-molekyler per droppe (figur 4G)31, som förväntat för en slumpmässig fördelning av DNA-molekyler. Eftersom lastningskoncentrationen av mallens DNA-lösning var densamma som den slutliga monterade λ (dvs. 0,05), var CFPS reaktionseffektivitet i vår FemDA 100% (eller nära 100%). Med andra ord är en enda DNA-molekyl tillräckligt för att utlösa CFPS-reaktionen i femtolitdroppen effektivt.

CFPS-reaktionen hos alkalisk fosfatas registrerades var femte minut. Den utvecklade programvaran stöder också analys av tidskursdata (figur 5). Den kopplade fluorogena reaktionen visade en liknande diskret fördelning av fluorescensintensiteten hos dropparna vid tidigare tidpunkter. Histogrammet resultaten verifierade också en beläggning av olika antal DNA-molekyler i droppen. Fluorescensintensiteten konvergerade så småningom till ett värde tillsammans med den gradvisa utarmningen av det fluorogena substratet DiFMUP.

Figure 1
Figur 1: Mikrotillverkningsprocessen för mikrokammarens substrat med ultrahög densitet. (A) Teknisk ritning av den anpassade vakuumchucken. Enhet: mm. (B) CYTOP-filmtjocklek kontra spinnhastighetsdata. (C)Spindelbeläggning av perfluoropolymercyop på ett silaniserat glassubstrat. Fotografierna visade ett bra exempel på homogen beläggning och ett dåligt exempel på inhomogen beläggning, respektive. Den svarta pilen indikerade den inhomogena CYTOP-filmens specifika position. (D)Spin-beläggning av fotoresist på det CYTOP-belagda substratet. Efter spinnbeläggningen måste fotoresisten nära substratkanten avlägsnas med hjälp av en etanoldränkt ren torkare (mittfotografering). Fotografierna visade ett bra exempel på homogen beläggning och ett dåligt exempel på inhomogen beläggning, respektive. Den vita pilen indikerade den specifika positionen för den inhomogena fotoresistensfilmen. ( E)Exponering av den belagda fotoresisten med hjälp av en mask aligner. (F) Utveckling av exponerade fotoresist i en utvecklare. Den exponerade delen av fotoresisten är löslig i utvecklarlösningen. (G)Reaktiv jonetsning av CYTOP. Den avtäckta CYTOP togs bort av O2 plasma. H)Borttagning av fotoresistensmasken. Fotoresisten togs bort av aceton. Substratet rengjordes med 2-propanol och H2O. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Förberedelse och användning av mikrokammares matrisenhet. (A)Vägning av härdningsmedlet och förpolymeren av PDMS. (B)Häll den blandade och avlånga blandningen i en bandmönstrad petriskål. Det fanns några nygenererade luftbubblor i polymerblandningen. (C)Avarna blandningen igen i en vakuumkammare. Luftbubblorna steg och brast på ovansidan. D)De averats och härdat PDMS-harts. (E) Skala av den härdat PDMS elastomer från petriskålen. F)Skära av alla PDMS-kanalblock med hjälp av en plattkabelsax. (G) Stanshål i varje ände av PDMS-kanalen med hjälp av en biopsi punch. H)Den monterade enheten. PDMS harts kan fästas på CYTOP-ytan. (I)Genomskinligt mikrokammare arrayområde inuti PDMS-kanalen fylld med vattenlösningen före kylning. (J)Transparent mikrokammare array område inne i PDMS kanal efter kylning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Ultrauniformade och ultrastabila femtoliterdroppar. (A)3D-laserscanning confocal mikroskopi imaging för det tillverkade substratet. De cylindriska mikrokammarna i exempelbilden visade en höjd på 3 μm och en diameter på 4 μm. (B)Enhetliga femtoliterdroppar över ett stort område av planarmatrisen. Endast ett partiellt område av hela matrisen visades häri. En fluorescerande lösning (10 μM ATTO-514) förseglades i varje droppe. (C)Storleksfördelningen för dropparna över en hel enda matris. Fluorescensintensiteten användes som en indikator på droppstorleken. CV:et var bara 3 procent. (D)Volymetrisk mätning med hjälp av confocal z-stack tidskurs data. Volymen droppar över matrisen gavs av mikroskopprogramvaran (NIS-Elements, Nikon). E)Fluorescensåtervinning efter fotoblekning. Efter den första ramen, flera droppar var helt photobleached med hjälp av en begränsad laserstråle av en confocal mikroskop. Deras fluorescens intensitet registrerades för 24 h, och ingen fluorescens återhämtning observerades (röd linje). Fluorescensintensiteten hos andra icke-fotobleached droppar i samma synfält spelades in i den svarta linjen. Felstaplar (genomskinliga färger) var 1 SD för varje tidspunkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Analysförfarande för slutpunkts mikroskopiska bilddata. Den ofokuserade ljusfältsbilden användes för att extrahera koordinaten för varje mikrokammare/droppar. Baserat på intensitetsskillnaden mellan mikrokammares kant (som förgrund) och andra områden (som bakgrund) kan den kontinuerliga och nästan cirkulära kanten extraheras från bakgrunden. På grund av den ojämna bakgrundsfördelningen över visningsfältet (A) krävs i allmänhet viss bildförbearbetning för att förbättra kvaliteten på lagerföringsutgången. Efter subtrahering bakgrund (B), bakgrunden till varje ram uniformerades. Empiriskt var ingångsvärdet i "Rullande bollradie" (steg 1) 20-50 för 2048 pixel × 2048 pixelbilder och 10-20 för 512 pixel × 512 pixelbilder. Ju större värde, desto kortare bearbetningstid. Om du vill minska bruset i den bakgrundssubtraherade bilden använder du ett medianfilter på bilden (C). I allmänhet var indatavärdet i Radien (steg 3) 1-2 pixlar. Som visas i den förstorade insatsen kan den bakgrundssubtraherade och filtrerade bilden vara snyggt binariserad med hjälp av inbyggda tröskel plugin så att förgrunden som motsvarar kanterna samt regionen av intressen (ROIs) kan kännas igen korrekt. ROIs-identifieringen för alla bildrutor utfördes med hjälp av den installerade hemmagjorda insticksprogrammet FemDA Analysis (D). Pixelstorleken (steg 5 och 6) och cirkuläriteten (steg 7 och 8) i ROIs, de ramar som vi vill lägga in i beräkningen (steg 9 och 10) definierades manuellt enligt faktiska data. När du har klickat på Generera ROI (steg 11) och väntat, fastställdes koordinaten för varje avkastning över indataramarna. När du har klickat på Använd ROI-masken (steg 12) omringades varje upptäckt avkastning och markerades med en gul linje. När fluorescensbilden har öppnats och klickat på använd ROI-masken igen applicerades den bestämda ROIs-masken på fluorescensbilden. I antalet översta pixlar (steg 14) angavs antalet toppintensitetsrankade pixlar för varje avkastning för beräkning av medelintensiteten för respektive droppar. Efter att ha klickat på Mätintensitet (steg 15) och väntat genererades histogrammet (E). Histogrammet kan utrustas med en summa gaussiska fördelningar med hjälp av de parametrar som finns i histogrammet. Alternativt kan medelintensdata exporteras till en textfil (steg 16) och analyseras med annan programvara (F). g)Sannolikheten för förekomst av droppar som innehåller olika antal DNA-molekyler i den givna matrisen. Histogrammet (grå färg) var fint monteras av en Poisson fördelning (röd streckad linje) med ett genomsnitt på 0,05 DNA-molekyler per droppe, som förväntat för en slumpmässig fördelning av DNA-molekyler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Analys av tidskursens mikroskopiska bilddata. De identifierade avkastningsrätterna (i och med stegen 1-12 i figur 4)tillämpades direkt på tidskursdata. I steg 13 i figur 4väljer du Time-lapse och matar in det faktiska tidsintervallet (i minuter) mellan intilliggande bildrutor i Tidsintervall [min]. Efter att ha klickat på Mätintensitet (steg 15 i figur 4) och väntat genererades tidsintensiteten och histogrammet (samma som figur 4E). Hist-positionen angav tidspunkten för histogrammet, som visades som en vertikal röd linje. Insticksprogrammet stöder också att ange färger för varje spårningslinje. Gul: 0 DNA; blått var 1 DNA; röd: 2 DNA; svart: 3 DNA. Tidskursdata kan också exporteras till en textfil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande film 1. Klicka här för att ladda ner den här filmen. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mycket kvantitativa mätningen baserad på de mycket enhetliga, stabila och biokompatibla dropparna i FemDA möjliggjorde den diskreta fördelningen, det unika inslaget i vår studie som skiljer sig från andra. Vi optimerade och detaljerade systematiskt mikrotillverknings- och droppbildningsprocesserna i detta dokument. Det finns flera kritiska steg i det etablerade protokollet.

För det första bestämmer den enhetliga beläggningen av mycket trögflytande CYTOP-polymer på det rektangulära tunna glassubstratet till stor del kvaliteten på det resulterande substratet. Med tanke på objektivets allmänt korta arbetsavstånd med höga förstoringar (se steg 6.1) måste det tunna täckglaset användas. En högkvalitativ spinnbeläggning på ett tunt och flexibelt substrat är i allmänhet knepigt. Vi har ännu inte testat alla möjliga konstruktioner men har funnit att flerhålsvakuumchucken med samma rektangulära dimension fungerade bra för spinnbeläggningen. Det är viktigt att släppa CYTOP-polymeren i mitten av täckglassubstratet och omedelbart starta spinnbeläggningen (se steg 1.3.2). Svårighetsgraden är mindre relaterad till substratets form men polymerens viskositet. CYTOP-produktlinjen erbjuder flera olika koncentrationer av det kommersiellt tillgängliga paketet. Det medföljande spädmedlet i förpackningen kan också användas för att späda ut originalprodukten till en lägre viskositet om det behövs. CYTOP 816 som vi använde i experimentet är den kommersiella produkt med den högsta koncentrationen som kan stickat lösa upp polymeren i lösningsmedlet. Den tjockare beläggningen kräver lägre rotationshastighet eller flera omgångar av beläggning och härdning. En tomt med karakteristisk tjocklek kontra spinnhastighetskurva rekommenderas starkt när du använder en ny spinnkappa i en ny miljö.

För det andra är lämplig fuktighet i renrummet avgörande för perfekt fotolitografi samt fullständigt avlägsnande av fotoresisten på angiven position. Den fotokemiska reaktionen i fotolitografi använder H2O som en av reaktanterna. Mjukbaken vid den temperatur som är högre än den kokande temperaturen på H2O tar dock bort H2O-halten från den belagda fotoresisten. Den "torkade" fotoresistensen måste ta tid att absorbera H2O igen från luften (se steg 1.4.6). Denna punkt förbises ofta. Med tanke på att många laboratorier kan bara ha några förenklade renrum anläggningar utan fuktkontroll, skulle luftfuktigheten fluktuera dramatiskt under säsongen eller påverkas av vädret. En billig lösning är att använda en hem-användning luftfuktare eller avfuktare i renrummet. Det fullt exponerade CYTOP-skiktet efter utveckling kan selektivt och helt avlägsnas genom RIE, helt utsätta glasbotten. Så småningom är hybridstrukturen i den hydrofila glasbotten och den hydrofoba CYTOP sidoväggen viktig för att stabilt fånga vattenlösning till femtolterutrymmet.

För det tredje visade de nyfunna oljorna (ASAHIKLIN AE-3000, Fomblin Y25) och ytaktivt medel (SURFLON S-386) oöverträffad tätningsprestanda för fluorpolymerreaktorn13. Insprutningen av spololjan måste utföras på det kylda platta metallblocket (se steg 5.2). I annat fall kan droppar nära kanalens inlopp inte bildas. Injektionen av den andra tätningsoljan kan utföras vid RT (se steg 5.5). Dessa oljor och ytaktiva ämnen har aldrig använts i biologisk forskning innan. Inga bättre alternativ har hittats för tillfället. För att utöka arsenalen av den användbara kombinationen av oljor och ytaktiva ämnen för droppberedning, den nya medlemmen av oljor (eller liknande i samma produktlinje) och ytaktiva (eller liknande i samma produktlinje) är värda att försöka appliceras i mikrofluidiska droppar system.

Här är ytterligare två punkter att notera. En är det faktum att det finns en tidsfördröjning bland ROIs under mikroskopi imaging. Den totala bildtiden för en cykel beror huvudsakligen på matrisstorleken och förstoringen av objektivet. Exponeringstiden, slutartiden och den motoriserade scenens rörliga hastighet är också mindre faktorer. Som en tumregel, bildbehandling 106 droppar vid 60 × förstoring skulle minst kräva 10-20 minuter. Denna oundvikliga tidsfördröjning medför vissa fel i dataanalys, som alltid bör beaktas noggrant. Den andra är det faktum att det totala antalet droppar på ett enda substrat inte skulle överstiga 108-109, även öka tätheten av droppar eller minska den individuella storleken på droppen. Detta beror på att storleken på glassubstratet som kan hanteras av mask aligner (för 4-tums plattor) är begränsad. Ytterligare öka storleken på täckglaset rekommenderas inte eftersom en stor, tunn och bräcklig glassubstrat är svårt att hantera.

FemDA kan betraktas som en super miniatyriserad mikrotiterplatta. Alla biokemiska reaktioner som har utförts i 96-brunnsmikrotiterplattor kan försöka genomföras med FemDA. Det kan säkert användas för enzymaktivitetsmätning utan komplicerad proteinrening. Det kan också vara kompatibelt med digital polymeras kedjereaktion (digital PCR) och digitala enzym-linked immunsorbent analys (digital ELISA)31,49. Den lilla volymen, stor array och hög stabilitet skulle medföra vissa fördelar jämfört med befintliga digitala bioassay metoder. FemDA-systemet som kan lösa olika antal mall-DNA-molekyler i femtoliterdroppar har redan visat kraften på korrekt proteinscreening13. FemDA är ett nytt in vitro-facksystem som snabbt kan utveckla en mängd olika enzymer. Med framsteg inom bioinformatik och teknik bibliotek konstruktion, en tid präglad av en snabb on-demand skapande av högpresterande proteiner kommer säkert att komma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI stipendienummer JP18K14260 och budgeten för Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology. Vi tackar Shigeru Deguchi (JAMSTEC) och Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) för att de tillhandahåller karakteriseringsanläggningarna. Vi tackar Ken Takai (JAMSTEC) för kommersiell programvara stöd. Mikrofabricationen genomfördes vid Takeda Sentanchi Supercleanroom, University of Tokyo, med stöd av "Nanotechnology Platform Program" från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT), Japan, Grant Number JPMXP09F19UT0087.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81, (13), 5111-5118 (2009).
  2. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, (3), 977-1026 (2005).
  3. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12, (12), 2146-2155 (2012).
  4. Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17, (1), 34-75 (2017).
  5. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24, (9), 395-402 (2006).
  6. Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46, (11), 114004 (2013).
  7. Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. Fan, C. Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).
  8. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
  9. Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9, (3), (2018).
  10. Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8, (11), 1292-1300 (2013).
  11. Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10, (5), (2019).
  12. Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. (2019).
  13. Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5, (8), 8185 (2019).
  14. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. (2019).
  15. Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18, (10), 104011 (2008).
  16. Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10, (24), 3355-3362 (2010).
  17. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
  18. Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28, (4), 729-735 (2010).
  19. Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21, (1), 698-709 (2013).
  20. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16, (13), 2481-2486 (2016).
  21. Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303, (2), 517-524 (2006).
  22. Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150, (1), 465-470 (2010).
  23. Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8, (5), 741-746 (2008).
  24. Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24, (46), 12078-12083 (2018).
  25. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57, (3), 827-863 (1985).
  26. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8, (10), 1632-1639 (2008).
  27. Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16, (1), 65-69 (2016).
  28. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  29. Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81, (12), 4813-4821 (2009).
  30. Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55, (9), 3120-3123 (2016).
  31. Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89, (1), 92-101 (2017).
  32. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8, (5), 870-891 (2013).
  33. Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9, (3), 439-446 (2008).
  34. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12, (3), 422-433 (2012).
  35. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (9), 4004-4009 (2010).
  36. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12, (5), 882-891 (2012).
  37. Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
  38. Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5, (3), 491-502 (2010).
  39. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. Analytical Chemistry. 79, (9), 3248-3253 (2007).
  40. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, (5), 407-409 (2013).
  41. Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, (6), 3473-3477 (1981).
  42. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19, (8), 751-755 (2001).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  44. Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. Conn, P. M. Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).
  45. Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. 630-632 (2013).
  46. Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4, (10), 3466-3470 (2012).
  47. Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7, (3), 034110 (2013).
  48. Gonzalez, R. C., Woods, R. E. Digital image processing. Pearson. New York, NY. (2018).
  49. Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10, (1), 345-363 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics