Uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de DNA único

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Chemistry

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Summary

O objetivo geral do protocolo é preparar mais de um milhão de gotículas femtoliter ordenadas, uniformes, estáveis e biocompatíveis em um substrato planar de 1 cm2 que pode ser usado para síntese proteica sem células.

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Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).

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Abstract

Os avanços na resolução espacial e na sensibilidade de detecção da instrumentação científica possibilitam a aplicação de pequenos reatores para pesquisas biológicas e químicas. Para atender à demanda por microreatores de alto desempenho, desenvolvemos um dispositivo Femtoliter droplet array (FemDA) e exemplificamos sua aplicação em reações de síntese proteica livre de células massivamente paralelas (CFPS). Mais de um milhão de gotículas uniformes foram prontamente geradas dentro de uma área do tamanho de um dedo usando um protocolo de vedação de óleo de duas etapas. Cada gotícula estava ancorada em uma microcâmara femtoliter composta por um fundo hidrofílico e uma parede lateral hidrofóbica. A estrutura hidrofóbica híbrida e os óleos de vedação dedicados e surfactantes são cruciais para manter a solução aquosa femtoliter no espaço femtoliter sem perda de evaporação. A configuração femtoliter e a estrutura simples do dispositivo FemDA permitiram o consumo mínimo de reagentes. A dimensão uniforme dos reatores de gotículas tornou as medições quantitativas e de curso de tempo em larga escala convincentes e confiáveis. A tecnologia FemDA correlacionou o rendimento proteico da reação do CFPS com o número de moléculas de DNA em cada gotícula. Agilizamos os procedimentos sobre a microfabização do dispositivo, a formação das gotículas femtoliter e a aquisição e análise dos dados de imagem microscópica. O protocolo detalhado com o baixo custo otimizado de execução torna a tecnologia FemDA acessível a todos que possuem instalações padrão de limpeza e um microscópio de fluorescência convencional em seu próprio lugar.

Introduction

Pesquisadores usam reatores para realizar reações bioquím químicas. Há esforços significativos que têm sido feitos para reduzir o tamanho do reator e aumentar o rendimento experimental, a fim de diminuir o consumo de reagentes e, ao mesmo tempo, melhorar a eficiência do trabalho. Ambos os aspectos visam libertar os pesquisadores de uma carga de trabalho pesada, diminuindo o custo e acelerando a pesquisa e o desenvolvimento. Temos um roteiro histórico claro sobre o desenvolvimento das tecnologias do reator do ponto de vista dos volumes de reação e do throughput: bicos únicos/frascos/tubos de ensaio, tubos mililitros, tubos microliteres, microliter 8-tube tiras, microliter 96/384/1536-well placa, e nanoliter/picoliter/picoliter/femtoliter reatores1,,2,3,,4,5,6,7. Análogo à redução do tamanho do recurso de transistores em chips de circuito integrados na indústria de semicondutores nas últimas décadas, os microreatores bioquímicos estão passando por redução de volume e integração do sistema. Tais ferramentas de pequena escala tiveram um impacto profundo na biologia sintética baseada em células ou sem células, a biocoformação biomafatorial e a prototipagem e triagem de alta produtividade8,,9,,10,,11,12. Este artigo descreve nosso recente esforço no desenvolvimento de uma tecnologia única de gotículas e demonstra sua aplicação no CFPS13, uma tecnologia fundamental para a biologia sintética e comunidades de triagem molecular14. Em particular, fornecemos intencionalmente um protocolo otimizado e de baixo custo para tornar o dispositivo FemDA acessível a todos. O protocolo de baixo custo e fácil de lidar para o dispositivo miniaturizado contribuiria para os propósitos educacionais das universidades e ajudaria a disseminar a tecnologia.

FemDA prepara gotículas femtoliter a uma densidade ultra-alta de 106 por 1 cm2 em um substrato de vidro planar. Nós revestemos um polímero hidrofóbico, CYTOP15,no substrato de vidro e gravado seletivamente (removido) CYTOP em posições predefinidas para gerar uma matriz de microcâmara no substrato. Assim, a microcâmara resultante é composta por uma parede lateral hidrofóbica (CYTOP) e um fundo hidrofílico (vidro). Quando fluimos sequencialmente água e óleo sobre a superfície padronizada, a água pode ser presa e selada nos microchambers. A estrutura hidrofóbica-em-hidrofóbica é vital para repelir a água fora dos microchambers, isolar microreatores individuais e reter uma pequena solução aquosa dentro do espaço femtoliter. A propriedade única foi aplicada com sucesso para a preparação de gotículas de água em óleo e microcompartamentos lipídes bicamadas16,17. Em comparação com o protótipo do dispositivo16,primeiro otimizamos o processo de microfabaçação para realizar uma remoção completa do polímero CYTOP, bem como uma exposição completa do fundo de vidro. CYTOP é um fluoropolímero especial com tensão superficiais (19 mN/m) inferior à de materiais microrretores convencionais, como vidro, plásticos e silicone. Seu bom desempenho óptico, elétrico e químico já foi utilizado no tratamento superficial de dispositivos microfluidos18,19,20,,21,,22,,23,,24. No sistema FemDA, para obter uma boa moçação do óleo na superfície CYTOP, a tensão superficial do óleo deve ser menor do que a da superfície sólida25. Caso contrário, o óleo líquido em contato com a superfície sólida tende a se tornar esférico em vez de se espalhar sobre a superfície. Além disso, descobrimos que alguns óleos populares de perfluorocarbono (por exemplo, 3M FC-40)16 e óleos de hidrofluoroether (por exemplo, série 3M Novec) podem dissolver CYTOP como resultado da morfologia amorfa do CYTOP, que é fatal para medição quantitativa e seria questionável em termos de contaminação cruzada entre gotículas. Felizmente, identificamos um óleo biocompatível e ecologicamente correto que exibe tensão superficial mais baixa (< 19 mN/m)13. Também encontramos um novo surfactante que pode dissolver-se no óleo selecionado e funcionar em baixa concentração (0,1%, pelo menos 10 vezes menor do que os populares relatados anteriormente26,27)13. A interface água/óleo resultante pode ser estabilizada pelo surfactante. Devido à alta taxa de evaporação do óleo, após a descarga com o óleo, aplicamos outro óleo biocompatível e ambientalmente amigável para substituir o primeiro a selar os microchambers. Chamamos o primeiro óleo (ASAHIKLIN AE-3000 com 0,1 wt % SURFLON S-386) o "óleo de descarga" e o segundo óleo (Fomblin Y25) o "óleo de vedação", respectivamente.

A estratégia de vedação de óleo em duas etapas pode realizar uma formação robusta da matriz de gotículas femtoliter em minutos e sem instrumentação sofisticada. Devido ao problema de evaporação, tem sido considerado desafiador gerar microreatores menores do que os volumes picoliter28. A FemDA abordou essa questão otimizando sistematicamente os materiais e processos utilizados para a elaboração de microreatores/gotículas. Várias características notáveis das gotículas resultantes incluem a alta uniformidade (ou monodispersidade), estabilidade e biocompatibilidade na escala femtoliter. O coeficiente de variação (CV) do volume de gotículas é de apenas 3% (sem correção de vinheta para as imagens microscópicas), o menor CV entre as plataformas de gotículas do mundo, o que garante uma medição altamente paralela e quantitativa. A gotícula femtoliter é estável por pelo menos 24 horas sem contaminação cruzada entre gotículas à temperatura ambiente, o que é valioso para uma medição confiável do curso de tempo. Em relação à biocompatibilidade, conseguimos sintetizar várias proteínas a partir de um DNA modelo de cópia única na gotícula femtoliter, que anteriormente havia sido considerada difícil ou ineficiente29,30. Seria digno de elucidar por que algumas proteínas capazes de ser sintetizadas no FemDA não podem ser sintetizadas em outros sistemas de gotículas. FemDA não foi meramente um avanço técnico, mas também realizou uma medição quantitativa sem precedentes que pode correlacionar o rendimento da proteína (como refletido pela intensidade da fluorescência da gotícula) ao número de moléculas de DNA modelo em cada gotícula. Como resultado, o histograma da intensidade de fluorescência de gotículas do CFPS baseado em FemDA mostrou uma distribuição discreta que pode ser bem encaixada por uma soma de distribuições gaussianas de intervalos de pico a pico iguais. Além disso, a probabilidade de ocorrência de gotículas contendo diferentes números de moléculas de DNA foi perfeita para uma distribuição de Poisson31. Assim, o rendimento diferente de proteínas em cada gotícula pode ser normalizado com base na distribuição discreta. Este recurso crítico nos permite separar as informações de atividade enzimática da intensidade aparente, que ainda não está disponível com outras plataformas de microreatores. Os sistemas de classificação de células/gotículas microfluidas existentes são habilitados em classificação totalmente automática e bons em concentrar amostras, mas às vezes só podem produzir um histograma relativamente amplo ou de cauda longa no aspecto analítico32,33. Nosso sistema FemDA altamente quantitativo e biocompatível estabelece um novo benchmark e um alto padrão analítico no campo do desenvolvimento de microreatores.

Os óleos e surfactantes que poderiam ser usados para a preparação de gotículas ainda são muito limitados34. A combinação de ASAHIKLIN AE-3000 e SURFLON S-386 estabelecida na FemDA é um novo membro do crescente arsenal da interface fisioquímica entre a fase aquosa e a fase13do óleo . A nova interface em FemDA é fisicamente estável, quimicamente inerte e biologicamente compatível com a transcrição complexa, tradução e máquinas de modificação pós-translacional para muitos tipos de proteínas13. Seria bastante atraente encontrar uma proteína que não pode ser sintetizada nas configurações de gotícula. Além disso, a economia de custos dos reagentes é mais evidente no sistema de gotícula femtoliter do que no sistema de reator nanoliter e picoliter35,36. Em particular, muitas vezes haveria um grande volume morto, que é causado principalmente por tubos ou suprimentos externos, em sistemas microfluídicos de geração de droplet, mas não em nosso FemDA. O formato de matriz também é favorecido pela caracterização microscópica repetida e detalhada (semelhante à chamada análise de alto conteúdo) para cada reator37, em vez de apenas um único instantâneo para um objeto em movimento rápido. A escala femtoliter permitiu a integração de mais de um milhão de reatores em uma área do tamanho de um dedo, enquanto o mesmo número de reatores nanoliteres (se existir) requer sobre a área do metro quadrado, o que seria sem dúvida impraticável para fabricar ou usar tal sistema.

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Protocol

1. Microfabricação do substrato de matriz de microcrobra femtoliter

NOTA: Realize o seguinte experimento de microfabização em uma sala de limpeza. Use luvas e um terno de limpeza antes de entrar na sala de limpeza.

  1. Substrato de vidro de cobertura de limpeza
    1. Coloque o vidro da tampa em um rack de coloração de vidro de cobertura. Sonicar o vidro de cobertura em hidróxido de sódio de 8 M (NaOH) por 15 min a temperatura ambiente (RT).
      ATENÇÃO: O NaOH em altas concentrações é altamente perigoso para a pele e os olhos. Manuseie-o suavemente sem qualquer respingo.
    2. Tire o rack da solução NaOH e enxágue o vidro de cobertura usando água por dez vezes. Mantenha o vidro da tampa na água pura.
      NOTA: Descarte os resíduos alcalinos para o tanque designado. A solução NaOH pode ser reciclada para a garrafa original e usada por até cinco vezes.
    3. Seque cada pedaço de vidro de cobertura com uma pistola de ar.
    4. Asse o vidro de cobertura seca em uma placa quente a 200 °C por 5 minutos. Mantenha a orientação do lado superior do substrato de vidro consistente durante os seguintes processos de manuseio.
  2. Silanização da superfície de vidro
    1. Reinicie o vidro de cobertura limpo em um rack de coloração seca.
    2. Adicione 150 mL de etanol em um béquer PTFE. Use uma agulha (22 G x 70 mm) equipada com seringa de 1 mL para desenhar 0,075 mL de (3-aminopropil)triexisilano e injete imediatamente no etanol (ou seja, 0,05 vol %). Puxe e empurre a seringa várias vezes para enxaguar o interior da seringa. Mexa a solução com a agulha para torná-la homogênea.
      NOTA: (3-aminopropil)triethoxysilane pode ser armazenado à temperatura ambiente e 1 atm pressão por dois anos com uma vedação apertada. O etanol absoluto deve ser bem selado após o uso. Não recomendamos o uso de reagentes vencidos.
    3. Incubar o vidro de cobertura na solução de aminosilano de 0,05 vol % por 1 h na RT.
    4. Enxágüe o vidro da tampa usando água pura por cinco vezes. Mantenha o vidro da tampa na água pura.
      NOTA: Descarte os resíduos para o tanque designado.
    5. Seque cada pedaço de vidro de cobertura com a pistola de ar.
    6. Coloque todo o vidro de cobertura seca na folha de alumínio. Asse o copo de cobertura na placa quente a 80 °C por 5 minutos.
  3. Perfluoropolímero CYTOP de revestimento de spin
    1. Coloque o vidro de cobertura em um mandril de vácuo personalizado de um revestimento de spin(Figura 1A). Ligue o interruptor de vácuo para fixar o substrato de vidro.
      NOTA: O design do mandril a vácuo é crucial para um revestimento uniforme de polímero viscoso no substrato retangular (24 mm × 32 mm) e fino (0,13-0,17 mm) substrato(Figura 1A). Descobrimos que um estágio de amostra retangular com múltiplos orifícios (48 orifícios, cada um com 1 mm de diâmetro) conectando-se ao canal de vácuo funcionou melhor do que o estágio redondo com um único orifício central.
    2. Solte 70-90 μL de polímero CYTOP tipo A no centro do substrato de vidro. Reveste imediatamente o polímero(Figura 1B).
      NOTA: A condição de revestimento de spin (3.400 rpm, 30 s) fornece 3 μm de espessura. Use a micropipette projetada para líquido viscoso. Segure a micropipette na vertical para fazer o polímero cair quase perfeitamente no substrato. Uma bolha de ar é frequentemente gerada dentro da ponta da pipeta à medida que o êmbolo se move para baixo. Não deixe cair a última gota de CYTOP com a bolha.
    3. Pegue o vidro revestido com os dedos segurando os cantos do substrato de vidro e coloque-o sobre a folha de alumínio.
    4. Repita as etapas 1.3.1-1.3.3 para revestir todas as peças restantes do vidro de cobertura.
    5. Asse o copo revestido a 80 °C por 30 min e depois a 200 °C por 1h.
      NOTA: Este processamento cura totalmente o CYTOP e liga o CYTOP à superfície do vidro. Cubra a área de cozimento com uma tampa feita de papel alumínio para evitar poeira potencial durante o processo de cozimento de longa data, se necessário.
    6. Remova o vidro de cobertura revestido de CYTOP da placa de aquecimento e esfrie para RT. Pegue cuidadosamente cada pedaço do vidro revestido e inspecione-o para ver se está devidamente revestido. Descarte o substrato exibindo revestimento inhomogêneo.
      NOTA: A superfície de um CYTOP bem revestido deve parecer plana sem padrões irregulares semelhantes ao arco-íris(Figura 1C). A inspeção visual de um ângulo adequado pode julgar rapidamente o achatamento, bem como a qualidade do revestimento. O protocolo pode ser pausado aqui.
  4. Fotoresist de spin-coating
    1. Coloque o vidro de cobertura revestido de CYTOP no mandril a vácuo (ver passo 1.3.1) do revestimento de giro. Ligue o interruptor de vácuo para fixar o vidro de cobertura.
    2. Queda de 0,2-0,3 mL de fotoresist no centro do substrato. Imediatamente gire o fotoresist a 6.000 rpm por 60 s.
      NOTA: Não deixe cair a última gota do fotoresist com bolhas. Se o revestimento de giro suportar maior velocidade de giro, a velocidade de giro pode ser de até 7.500 rpm para obter um revestimento mais fino. A baixa energia superficial do CYTOP impede que a maioria dos fotoresistas seja aderida à sua superfície. Se o fotoresist AZ P4903 não estiver disponível, o fotoresist AZ P4620 é uma boa alternativa.
    3. Pegue o substrato revestido com dois dedos segurando cantos do substrato. Limpe o excesso de fotoresist próximo à borda do substrato (muitas vezes chamado de remoção de contas de borda ou EBR) usando um limpador limpo encharcado de etanol(Figura 1D). Coloque o substrato sobre a folha de alumínio.
      NOTA: A acetona NÃO é recomendada para ebr.
    4. Repita as etapas 1.4.1-1.4.3 para girar o fotoresist para as peças restantes de vidro de capa revestido CYTOP. Pegue cada pedaço do vidro revestido e inspecione-o para ver se está devidamente revestido.
      NOTA: A superfície de um fotoresist bem revestido deve parecer plana sem padrões irregulares(Figura 1D). A inspeção visual de um ângulo adequado pode julgar rapidamente o achatamento, bem como a qualidade do revestimento. O substrato que exibe revestimento inhomogêneo pode ser reciclado através da lavagem com acetona, 2-propanol e H2O em sequência, e reutilizado.
    5. Asse o substrato revestido a 110 °C por 5 minutos na placa de aquecimento.
    6. Remova o substrato revestido da placa quente e esfrie para rt. Deixe-nos ficar por 30 minutos com umidade relativa de 40%-60% para reidratação do fotoresist.
      NOTA: H2O é necessário para a seguinte reação fotoquímica. O fotoresist assado perdeu o conteúdo H2O dentro do fotoresist. O processo de reidratação permite que H2O seja absorvido do ar. A umidade relativa abaixo de 20% ou superior a 80% não é adequada para o processo de reidratação.
  5. Photolithography
    1. Durante o tempo de espera da reidratação (ver passo 1.4.6), inicie o alinhador da máscara. Aqueça a fonte de luz. Carregue a máscara cromada.
      NOTA: Siga o manual de instruções para operar o alinhador de máscaras. A máscara fotográfica pode ser fabricada através da litografia do feixe de elétrons (EB) se a instalação EB estiver disponível. Alternativamente, o fotomask pode ser terceirizado para uma empresa local.
    2. Carregue o substrato rehidratado (após terminar a etapa 1.4.6) no mandril(Figura 1E).
    3. Definir parâmetros de exposição. Exponha o substrato para 25 s com uma intensidade UV de 13 mW/cm2 (h-line) no modo de contato a vácuo. Em seguida, descarregue o substrato e coloque-o no rack de coloração de vidro de cobertura (o mesmo rack usado na etapa 1.1.1).
    4. Repita as etapas 1.5.2-1.5.3 para expor as peças restantes do substrato rehidratado.
  6. Desenvolvimento
    1. Desenvolva o substrato por 5 minutos para dissolver o fotoresist exposto(Figura 1F). Durante o qual, agite suavemente o rack no desenvolvedor uma vez no ponto de tempo de 4 minutos.
      NOTA: O desenvolvedor era AZ 300 MIF. Desenvolvedores alcalinos alternativos (por exemplo, AZ 400 K) são geralmente aplicáveis para o desenvolvimento, mas devem exigir otimização das condições de desenvolvimento (por exemplo, tempo, temperatura, agitação). NÃO use béquers de vidro como recipiente de desenvolvedor.
    2. Enxágüe o substrato usando água pura por dez vezes. Mantenha o vidro da tampa na água pura.
      NOTA: Descarte o desenvolvedor para o tanque designado.
    3. Seque completamente cada pedaço de substrato com a pistola de ar.
  7. Gravura de íons reativos
    1. Coloque o substrato seco (a partir da etapa 1.6.3) na câmara de reação da máquina de gravura de íons reativos (RIE).
      NOTA: De acordo com a regra de manutenção da instalação, a máquina RIE pode estar sempre desligada ou desligada todas as vezes. Se o interruptor estiver desligado, ligue o interruptor de acordo com o manual.
    2. Etch o CYTOP descoberto pelo fotoresistista com o plasma O2 (Figura 1G).
      NOTA: A condição rie foi a seguinte. Taxa de fluxo de gás O2: 50 sccm; pressão da câmara: 10.0 Pa; Potência RF: 50 W; tempo de gravação: 27 min. O tempo de gravação foi otimizado para a gravura completamente de 3 μm de espessura do CYTOP.
    3. Pegue cada pedaço de substrato da câmara de reação usando a pinça e coloque-os no rack de coloração de vidro da tampa.
      NOTA: De acordo com a regra de manutenção da instalação, a câmara de reação pode exigir um curto processo de limpeza de plasma O2 (por exemplo, tempo de gravação: 5 min) para manter a câmara de reação limpa após cada execução.
  8. Remoção fotoresist e limpeza
    1. Sonicar o substrato em acetona por 5 min no RT para dissolver o fotoresist restante.
    2. Sonicar o substrato em 2-propanol por 5 min no RT.
    3. Enxágüe o substrato usando água pura por cinco vezes. Sonicar o substrato por 5 min na RT. Enxágue a amostra usando água pura por mais cinco vezes. Mantenha o substrato em água pura.
    4. Seque cada pedaço de substrato com a pistola de ar(Figura 1H).
      NOTA: O substrato pode ser armazenado em uma placa de petri de plástico. O substrato fabricado é estruturalmente estável na RT por pelo menos um ano. O protocolo pode ser pausado aqui.
    5. Caracterize o perfil superficial do substrato preparado como preparado por microscopia confocíquica de varredura a laser tridimensional (3D), interferometria de luz branca (ou interferometria de varredura de coerência) ou microscopia eletrônica de varredura. Use o respectivo software para medir o diâmetro e a profundidade dos microchambers resultantes.
      NOTA: A amostra pode ser reutilizada para outros experimentos após a caracterização com o microscópio confocal de varredura a laser 3D não-contato e não destrutivo ou interferômetro de luz branca. O protocolo pode ser pausado aqui.

2. Preparação do microcanal polidimetilsiloxano (PDMS)

NOTA: NÃO use luvas de látex para manusear PDMS. Em vez disso, use luvas de polietileno (PE).

  1. Fazendo o mestre microcanal
    1. Corte uma fita de filme Kapton de revestimento duplo em uma forma de microcanal definida (3 mm x 19 mm) usando um cortador de desktop.
      NOTA: A fita kapton foi nº 7602 #25 (Teraoka Seisakusho), resultando em uma altura de canal de 135 μm. O cortador de desktop STIKA usa um plugin (disponível no site da Roland: https://www.rolanddga.com) da Adobe Illustrator para executar o corte de acordo com o desenho no arquivo Adobe Illustrator. O protocolo pode ser pausado aqui.
    2. Coloque cada fita kapton cortada no fundo plano de uma placa de Petri. A placa petri padrão de 90 mm pode acomodar 12 pedaços da fita.
      NOTA: A estrutura de relevo serve como mestre para a moldagem de réplicas do PDMS. Pressione a superfície da fita suavemente com uma pinça se houver alguma bolha de ar entre a fita e o substrato da placa de Petri. Alternativamente, a litografia clássica macia pode ser aplicada para preparar o mestre em um waferde silício 38. O protocolo pode ser pausado aqui.
  2. Curando resina PDMS na placa de Petri com padrão de fita
    1. Use novas luvas pe, e transfira 2,5 g de agente de cura do elastômero de silicone SYLGARD 184 usando uma pipeta de plástico descartável no béquer plástico especificado(Figura 2A).
    2. Mude-se em luvas novas e transfira 25 g da base prepolímero do elastômero de silicone SYLGARD 184 usando uma seringa descartável de 50 mL no béquer de plástico acima.
      NOTA: Troque as luvas aqui para evitar a possível contaminação cruzada do agente de cura para a base.
    3. Use uma batedeira de deaeração para misturar e desaerar a mistura (programa: mistura de 3 minutos seguida de deaeração de 2 min).
      NOTA: Se a misturadora de deaeração não estiver disponível, uma mistura agitada manualmente (por cerca de 15 minutos) pode ser desgaseada em uma câmara de vácuo.
    4. Despeje a mistura PDMS na placa petri com padrão de fita(Figura 2B). Coloque a placa de Petri em uma mini câmara de vácuo e desaerar a mistura PDMS por 1-3 h(Figura 2C).
      NOTA: Se algum ar permanecer na mistura PDMS após 1h, tire a placa de Petri da câmara de vácuo, quebre a bolha de ar usando um soprador de ar e, em seguida, coloque a placa de Petri de volta na câmara de vácuo e continue o processo de desaeração.
    5. Coloque a placa de Petri em forno a 60 °C durante a noite para curar o PDMS (Figura 2D).
      NOTA: Embora o aumento da temperatura possa encurtar o tempo de cura, a temperatura máxima que pode ser tolerada pela placa petri de poliestireno sem deformação física é de cerca de 60 °C.
  3. Moldagem de réplica do canal PDMS
    1. Retire o elastomer PDMS curado da placa de Petri(Figura 2E).
    2. Corte cada pedaço de blocos de canais PDMS usando um cortador de cabo plano(Figura 2F).
    3. Coloque o elastômero PDMS em um tapete de corte voltado para o lado do canal para cima. Faça um buraco em cada extremidade do canal usando um soco de biópsia(Figura 2G).
    4. Limpe a superfície do canal PDMS com fita adesiva. Em seguida, enrole a resina PDMS em outro pedaço de fita adesiva para mantê-la limpa antes de usar. Armazene o canal PDMS preparado em uma placa de Petri limpa.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

3. Montagem do dispositivo de matriz de microchamador femtoliter

  1. Coloque alguns pedaços de limpadores limpos encharcados de água ao longo da parede interna de uma placa de Petri para fazer uma câmara umidificante simplificada. Coloque a resina PDMS coberta pela fita escocesa na câmara umidificante e sele a câmara usando filme de parafina. Incubar por pelo menos 3h, mas não mais do que um dia.
    NOTA: PDMS é um material poroso que permite que o gás passe através da resina39. A estrutura porosa do PDMS leva a uma absorção de moléculas de água do entorno até chegar a um equilíbrio. Este pré-tratamento enche os poros de PDMS com vapor de água e pode reprimir significativamente a evaporação de gotículas aquosas adjacentes à borda do canal PDMS.
  2. Tire a fita adesiva da resina PDMS. Posicione o canal PDMS na área de matriz de microcletrades do substrato(Figura 2H).
    NOTA: A resina PDMS adere reversivelmente à superfície CYTOP. Pressione o bloco PDMS suavemente com uma pinça para remover quaisquer bolhas de ar entre a resina PDMS e o substrato se existir.
  3. Insira uma ponta de pipeta não filtrada de 200 μL a uma (como saída) dos orifícios do canal PDMS.
    NOTA: A força de adesão entre PDMS e CYTOP é limitada. Para evitar a deformação física da resina PDMS, bem como o desprendimento do canal PDMS fora da superfície, não insira a ponta da pipeta muito profunda.

4. Solução de reação de carregamento ao dispositivo montado

  1. Coloque um microtubo de alumínio no gelo. Prechill o óleo de descarga (óleo ASAHIKLIN AE-3000 misturado com 0,1 wt % SURFACTANTE SURFLON S-386) em um microtubo de 1,5 mL no suporte de alumínio.
  2. Coloque outro bloco de alumínio no gelo.
  3. Preparação da solução de reação CFPS
    1. Prepare a solução de reação CFPS em um tubo PCR. Misture cada componente de alíquota do kit CFPS, um DNA de modelo diluído (conforme exemplificado aqui pela proteína fluorescente mNeonGreen40 e Escherichia coli alcalina fosfate41) solução, e outros componentes necessários de acordo com as necessidades específicas (por exemplo, inibidor de RNase, substrato fluorogênico, acompanhante).
      NOTA: O DNA do modelo utilizado para CFPS deve ser preparado de acordo com a instrução do kit CFPS correspondente. Esta demonstração aplicou um sistema de expressão baseado em T742. Como o consumo de reagente no dispositivo FemDA é bastante pequeno, 10 μL é grande o suficiente para preencher todo o canal PDMS.
    2. Para a síntese de proteína fluorescente mNeonGreen, misture os componentes na seguinte ordem: adicione 2,7 μL de H2O sem nuclease a uma alíquota de 6 μL da solução A (do kit CFPS); adicionar 0,3 μL de inibidor de RNase; adicionar 1,5 μL de solução de DNA de modelo diluído; misture brevemente e transfira a mistura para uma alíquota de 4,5 μL da solução B (do kit CFPS).
      NOTA: O volume total é de 15 μL. Como a quantidade de cada alíquota é proporcional ao volume total da mistura final, um volume total inferior a 10 μL pode resultar em um volume muito pequeno (< 0,2 μL) de alguma alíquota componente.
    3. Para síntese de fosfatase alcalina, misture os componentes na seguinte ordem: adicione 1,2 μL de H2O a 6 μL de solução A; adicionar 0,3 μL de inibidor de RNase; adicionar 0,6 μL de melhorador de ligação de dissulfeto 1 e 2 (a partir de um kit); adicionar 0,3 μL de 5 mM 6,8-difluoro-4-metilumbelliferyto fosfato (DiFMUP); adicionar 1,5 μL de solução de DNA; misture brevemente e transfira a mistura para 4,5 μL de solução B.
      NOTA: No ensaio da fosfatase alcalina, o substrato fluorogênico DiFMUP pode produzir altamente fluorescente 6,8-difluoro-7-hidroxi-4-metilcoumarina (DiFMU) sobre o decote enzimático do grupo fosfato terminal.
  4. Desenhe 10 μL da mistura usando uma ponta de pipeta não filtrada de 200 μL. Insira a ponta da pipeta no orifício de entrada (consulte a etapa 3.3) do canal PDMS. Empurre para baixo no êmbolo para injetar a solução no canal até que ela transborda da tomada (onde outra ponta de pipeta já foi inserida na etapa 3.3).
  5. Separe a pipeta da ponta da pipeta e mantenha essas duas pontas de pipeta ainda inseridas na entrada e na saída.
    NOTA: Evite gerar bolhas de ar durante a tubulação. Não deixe o polegar do êmbolo até separar a pipeta da ponta da pipeta para evitar o backflow da solução dentro do canal PDMS.

5. Geração de matriz de gotícula femtoliter (FemDA) para CFPS

  1. Transfira todo o conjunto do dispositivo montado para o bloco de alumínio pré-refrigerado (ver passo 4.2). Confirme cuidadosamente que a área de matriz de microcâmara passa rapidamente de translúcida(Figura 2I) para transparente(Figura 2J).
    NOTA: A solução de reação CFPS não pode entrar diretamente nos microchambers. A solubilidade do ar na água é em proporção inversa à temperatura. O ar preso se dissolverá na solução depois que o dispositivo foi movido de RT para a baixa temperatura. A mudança de transparência é um indicador visual conveniente para avaliar se a solução entra nos microchambers.
  2. Desenhe 30 μL do óleo de descarga pré-refrigerado (ver passo 4.1) e transfira imediatamente o óleo para a ponta de pipeta inserida por entrada a partir de sua abertura superior. O óleo de descarga se move para o canal e extrudia a solução de reação em excesso localizada fora dos microchambers. Cada microcâmara é isolada pelo óleo de descarga.
    NOTA: A interface móvel entre a solução de reação e o óleo de descarga é visível, o que ajuda as pessoas a observar o movimento do fluido dentro do canal. A solução extrudada pode ser coletada no tubo anterior, armazenada a 4 °C, e reutilizada para outro dispositivo FemDA ou uma reação a granel paralela (no microtubo ou em uma placa de microtúrculo).
  3. Pré-desenhe 30 μL de óleo de vedação (Fomblin Y25) para uma ponta de pipeta filtrada de 200 μL. Pendure a pipeta em algum lugar.
  4. Remova simultaneamente as duas pontas de pipeta inseridas (ver as etapas 3.3 e 4.4) do dispositivo. Mova imediatamente o dispositivo do bloco de alumínio para o parafilm.
    NOTA: Use uma pinça para corrigir (mas mantenha-se longe da área do canal) no dispositivo no bloco de alumínio durante o período de remoção das pontas da pipeta.
  5. Insira imediatamente a ponta de pipeta pronta contendo o óleo de vedação (ver passo 5.3) na entrada do canal PDMS e injete o óleo no canal até que ele transborde da tomada.
    NOTA: Realize esta etapa assim que mover o dispositivo para RT. Para evitar o fluxo de volta dentro do canal, não deixe o polegar do êmbolo até que o óleo de vedação transborde da tomada. O óleo de descarga evapora imediatamente após sair da saída do canal, enquanto o óleo de vedação se acumula na tomada devido à sua perda de evaporação extremamente baixa.
  6. Separe a pipeta da ponta da pipeta e, em seguida, remova a ponta da pipeta do dispositivo. Limpe a superfície PDMS usando um pedaço do limpador limpo e, em seguida, aplique uma nova gota de óleo de vedação na entrada e saída, respectivamente. As gotículas femtoliter são seladas em microchambers individuais pelo óleo.
    NOTA: Use uma pinça para corrigir (mas mantenha-se longe da área do canal) no canal PDMS no substrato durante o período de remoção da ponta da micropipette.
  7. Limpe a umidade acumulada na superfície inferior do vidro de cobertura. O dispositivo FemDA preparado está agora pronto para incubação e imagens de microscopia.

6. Imagem de microscopia

  1. Inicie um microscópio de fluorescência invertido. Aguarde a estabilização (resfriamento) da câmera. Use uma lente objetiva de imersão de óleo de 60x ou 100x. Coloque o dispositivo FemDA no estágio motorizado. Defina os parâmetros de imagem.
    NOTA: Os parâmetros de imagem incluem o caminho do arquivo, canais de imagem, filtros, tempos de exposição (em geral, 100 ms é suficiente; tempo mais curto ou maior também é possível de acordo com a especificação da câmera) e intensidade da luz.
  2. Encontre o avião focal. Ajuste a posição do eixo z da lente objetiva e fixe o plano focal usando um sistema de foco automático interno. Defina a região de interesse (ROI; ou seja, x, y-axis) a ser imageada.
    NOTA: Os principais fabricantes de microscópio (Nikon, Olympus, Zeiss, Leica) oferecem a opção de integrar o sistema de foco automático com o microscópio. Este sistema de foco automático é necessário para manter o plano focal constante durante a imagem automática de várias áreas. Os ROIs cobrem a área femda no canal PDMS.
  3. Capture as imagens de fluorescência. Capture um único quadro de uma imagem de campo brilhante desfocado (BF) para cada ROI. NÃO altere a ordem e as coordenadas dos ROIs ao fotografar os diferentes canais.

7. Análise de dados de imagem

NOTA: Analise os dados da imagem usando um plugin caseiro (chamado "FemDA") baseado em Fiji (http://fiji.sc) para extrair a intensidade de fluorescência de cada gotícula43. Instale a versão correta de Fiji de acordo com o sistema operacional. Fiji suporta a maioria dos formatos de arquivo de imagem (por exemplo, o arquivo nd2 do microscópio Nikon, arquivo czi do microscópio Zeiss) usando um plug-in "Bio-Formats".

  1. Instalação de plugin
    1. Copie e cole o arquivo de plugin (que está disponível no momento da consulta ao autor correspondente ou através do seguinte link institucional: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) na pasta "plugins" de Fiji.
    2. Iniciar o software Fiji; o plugin "FemDA" pode ser encontrado no menu suspenso "Plugins" de Fiji.
  2. Pré-processamento de dados de imagem
    1. Abra a imagem BF desfocada (ver passo 6.3). Clique em Processo | Subtrair fundo... para remover fundos contínuos suaves de cada quadro dos dados de imagem(Figura 4B). Clique em Processo | Filtros | Mediana para reduzir o ruído de cada quadro dos dados da imagem(Figura 4C).
    2. Clique em Imagem | Ajuste | Limiar para verificar e separar o primeiro plano (indicando os microchambers) do fundo (indicando a área fora dos microchambers) de cada quadro dos dados da imagem (inserções ampliadas na Figura 4A-C).
      NOTA: Selecione um algoritmo adequado da lista de drop-down na janela Limiar para que apenas as áreas de microcâmara, bem como as bordas de cada microcâmara, possam ser identificadas e destacadas como o primeiro plano. Em particular, a maioria das bordas destacadas deve ser contínua sem lacunas.
  3. Determinação da coordenada de gotícula
    1. Clique em Plugins | FemDA | Análise FemDA para abrir a interface gráfica do usuário (GUI) do plugin personalizado (metade superior da Figura 4D).
    2. Insira o número mínimo e máximo aproximado de pixels de uma única microcâmara. Insira a circularidade mínima e máxima esperada (0: forma arbitrária; 1: círculo perfeito) dos microchambers. Insira o número do quadro do quadro inicial e o quadro final.
    3. Clique em Gerar ROI na GUI para detectar cada microcâmara, e os ROIs detectados com sucesso são mostrados em um ROITablede janela pop-up .
    4. Volte para a janela Análise FemDA e clique no botão Aplique máscara de ROI para verificar se os microchambers sobre os quadros foram detectados corretamente (inferior esquerdo da Figura 4D). Se não, modifique alguns deles e repita o clique em Gerar ROI e Aplicar máscara de ROI. Se sim, vá para o próximo passo.
      NOTA: Pode haver muito poucos microchambers que não podem ser bem identificados como o ROI (ver a metade inferior da Figura 4D) por qualquer algoritmo do Limiar devido ao contraste insuficiente entre o primeiro plano e o fundo. Não é problemático no ponto de vista estatístico.
  4. Extração de intensidade de fluorescência
    1. Abra a imagem da fluorescência e traga-a para a frente. Clique em Aplicar a máscara roi novamente para aplicar os ROIs determinados na imagem de fluorescência (inferior direito da Figura 4D).
    2. Selecione one-shot para analisar uma imagem de ponto final (como exemplificado com os dados mNeonGreen) ou Time-Lapse para analisar um data de curso de tempo (como exemplificado com os dados fosfatados alcalinos).
    3. Entrada 100 na caixa O número de pixels superiores significa que apenas os 100 pixels superiores de cada ROI serão usados para calcular a intensidade média da gotícula correspondente. Se a entrada 0 no número de pixels superiores,todos os pixels de cada ROI serão usados para calcular a intensidade média da gotícula correspondente.
      NOTA: Pode haver uma deriva de vários pixels entre as imagens BF e fluorescência, o que significa que alguns pixels dentro dos ROIs podem pertencer ao fundo da imagem de fluorescência. Assim, o plugin fornece uma opção para especificar o número de pixels classificados em alta intensidade para o cálculo da intensidade média de cada gotícula.
    4. Para analisar a imagem de ponto final (ou seja, selecione One-Shot na etapa 7.4.2), clique no botão Medir intensidade para calcular as intensidades médias de todas as gotículas detectadas. O ROITable é atualizado com os novos dados da imagem de fluorescência. Enquanto isso, um histograma é exibido em uma nova janela pop-up Histogram (Figura 4E).
      NOTA: Alterar o tamanho da lixeira na caixa O número da caixa pode otimizar a exibição do histograma. Uma adequada para uma soma de distribuições gaussianas pode ser realizada na GUI desenvolvida. A janela popup Log de Fiji exibe os resultados de montagem. Alternativamente, exporte os dados clicando no botão salvar como texto e realizar várias análises estatísticas com outros softwares ( Figura4F, G).
    5. Para a análise da imagem do curso de tempo (ou seja, selecione Time-Lapse na etapa 7.4.2), a janela pop-up é o Curso de Tempo de Intensidade em vez de Histograma, que contém um histograma correspondente a um ponto de tempo específico e um enredo de intensidade de tempo(Figura 5). Os dados textuais também podem ser exportados usando o menu Arquivo da janela pop-up.

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Representative Results

O processo de microfabricação consiste em limpeza de substratos, funcionalização de superfície, revestimento CYTOP, fotolitografia, gravura a seco, despojo fotoresist e limpeza final. É importante ressaltar que o protocolo apresentado permitiu a remoção completa do polímero CYTOP hidrofóbico dentro dos microchambers Figura 3A, produzindo uma estrutura hidrofóbica-hidrofóbica altamente paralela em um substrato de vidro de cobertura padrão. Com o auxílio do protocolo de vedação de óleo, verificou-se a dimensão uniforme das gotículas resultantes por encapsular solução fluorescente nos microchambers(Figura 3B). A intensidade de fluorescência extraída usando o software desenvolvido é um bom indicador do tamanho da gotícula. O CV da intensidade da fluorescência, 3%, refletiu a distribuição estreita do tamanho da gota sobre toda a matriz(Figura 3C). A imagem 3D reconstruída da microscopia confocal também mostrou o volume consistente de gotícula ao longo do tempo (Figura 3D, Filme Suplementar 1)44. Em comparação, um óleo FC-40 amplamente utilizado gerou as gotículas exibindo uma diferença várias vezes maior na intensidade da fluorescência45. As gotículas formadas em FemDA ficaram estáveis na RT por pelo menos 24 horas(Figura 3E). A alta qualidade das gotículas eventualmente formou a base da medição quantitativa.

Dados de alto rendimento exigem ferramentas de análise de dados de alto rendimento46,47. O plugin desenvolvido simplificou e acelerou a análise dos dados de imagem. Com base na teoria do processamento de imagem digital48,a imagem BF desfocada pode ser binarizada e usada para fornecer as informações coordenadas de cada gotícula após correção de fundo e redução de ruído(Figura 4A-C). Essa ideia tornou possível a localização precisa de gotículas escuras.

A proteína fluorescente mNeonGreen foi sintetizada em FemDA. O DNA do modelo com uma concentração de 0,05 moléculas por gotícula foi distribuído aleatoriamente em cada gotícula para iniciar a síntese proteica com reações de transcrição e tradução sem células acopladas. Como o número médio de moléculas de DNA por gotícula era menor que 1, algumas gotículas continham DNA de modelo zero, enquanto outras continham uma ou mais moléculas de DNA. Após 6 horas de incubação no RT, a imagem de ponto final foi capturada usando o microscópio. Os dados da imagem da pilha foram analisados pelo software desenvolvido com o auxílio da imagem BF desfocada simultânea(Figura 4A-E). A intensidade da fluorescência de cada gotícula é uma medida do rendimento da proteína na gotícula correspondente. O histograma das intensidades de fluorescência mostrou uma distribuição discreta e foi bem equipado por uma soma de distribuições gaussianas de intervalos de pico a pico iguais(Figura 4F),que sugeriu fortemente uma ocupação de diferentes números de moléculas de DNA por gotícula. Semelhante ao repetido jogo de lançamento de moedas, o número de eventos aleatórios independentes que ocorrem é matematicamente descrito pela distribuição poisson. A probabilidade de ocorrência de gotículas contendo diferentes números (até 3 neste exemplo) de moléculas de DNA foi um ajuste perfeito para uma distribuição de Poisson (P = e• λk / k!, onde λ é o número médio esperado de moléculas de DNA por gotícula e k é o número real de moléculas de DNA em uma gotícula) com uma média de 0,05 moléculas de DNA por gotícula(Figura 4G)31, como esperado para uma distribuição aleatória de moléculas de DNA. Como a concentração de carregamento da solução de DNA do modelo foi a mesma do λ ajustado final (ou seja, 0,05), a eficiência de reação do CFPS em nosso FemDA foi de 100% (ou perto de 100%). Em outras palavras, uma única molécula de DNA é suficiente para desencadear a reação de CFPS na gotícula femtoliter eficientemente.

A reação cfps de fosfattase alcalina foi registrada a cada 5 minutos. O software desenvolvido também suporta a análise dos dados do curso de tempo(Figura 5). A reação fluorogênica acoplada mostrou uma distribuição discreta semelhante da intensidade de fluorescência das gotículas em pontos de tempo anteriores. Os resultados do histograma também verificaram uma ocupação de diferentes números de moléculas de DNA na gotícula. A intensidade da fluorescência eventualmente convergiu para um valor juntamente com o esgotamento gradual do substrato fluorogênico DiFMUP.

Figure 1
Figura 1: Processo de microfabricção do substrato de matriz de microcroâmpa de ultra-alta densidade. (A) Desenho técnico do mandril de vácuo personalizado. Unidade: mm. (B) espessura da película CYTOP vs. dados de velocidade de giro. (C) Revestimento de spin do citop de perfluoropolímero em um substrato de vidro silanizado. As fotografias mostraram um bom exemplo de revestimento homogêneo e um mau exemplo de revestimento inhomogêgógeno, respectivamente. A seta preta indicou a posição específica do filme CYTOP inhomogêneo. (D) Spin-coating de fotoresist no substrato revestido de CYTOP. Após o revestimento de spin, o fotoresist perto da borda do substrato deve ser removido usando um limpador limpo encharcado de etanol (fotografia do meio). As fotografias mostraram um bom exemplo de revestimento homogêneo e um mau exemplo de revestimento inhomogêgógeno, respectivamente. A seta branca indicou a posição específica do filme fotoresist. (E) Exposição do fotoresist revestido usando um alinhador de máscara. (F) Desenvolvimento do fotoresist exposto em um desenvolvedor. A parte exposta do fotoresist é solúvel na solução do desenvolvedor. (G) Reactive-ion etching of CYTOP. O CYTOP descoberto foi removido pelo plasma O2. (H) Remoção da máscara fotoresist. O fotoresist foi removido por acetona. O substrato foi limpo usando 2-propanol e H2O. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparação e uso do dispositivo de matriz de microcâmara. (A) Pesando o agente de cura e o prepolymer do PDMS. (B) Derramar a mistura mista e desaerada em uma placa de Petri com estampa de fita. Havia algumas bolhas de ar recém-geradas na mistura de polímeros. (C) Desaerando a mistura novamente em uma câmara de vácuo. As bolhas de ar estavam subindo e estourando na superfície superior. (D) A resina PDMS desaerada e curada. (E) Descascando o elastomer PDMS curado da placa de Petri. (F) Cortar cada pedaço de blocos de canal PDMS usando um cortador de cabo plano. (G) Furos de perfuração em cada extremidade do canal PDMS usando um soco de biópsia. (H) O dispositivo montado. A resina PDMS pode aderir à superfície CYTOP. (I) Área translúcida de matriz de microcâmara dentro do canal PDMS preenchido com a solução aquosa antes de esfriar. (J) Área transparente de matriz de microcâmara dentro do canal PDMS após o resfriamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Gotículas femtoliter ultra-uniformes e ultra-estáveis. (A) Imagens de microscopia confocal de varredura a laser 3D para o substrato fabricado. Os microchambers cilíndricos na imagem do exemplo mostraram uma altura de 3 μm e um diâmetro de 4 μm. (B) Gotículas de femtoliter uniforme sobre uma grande área da matriz do planar. Apenas uma área parcial de toda a matriz foi mostrada aqui. Uma solução fluorescente (10 μM ATTO-514) foi selada em cada gotícula. (C) A distribuição de tamanho das gotículas sobre uma única matriz inteira. A intensidade da fluorescência foi utilizada como indicador do tamanho da gota. O CV foi de apenas 3%. (D) Medição volumétrica utilizando dados de curso de tempo de pilha z confocal. O volume de gotículas sobre a matriz foi dado pelo software de microscópio (NIS-Elements, Nikon). (E) Recuperação de fluorescência após fotobleaching. Após o primeiro quadro, várias gotículas foram completamente fotobleachadas usando um raio laser confinado de um microscópio confocal. Sua intensidade de fluorescência foi registrada por 24 h, e nenhuma recuperação de fluorescência foi observada (linha vermelha). A intensidade da fluorescência de outras gotículas não fotobleachadas no mesmo campo de visão foi registrada na linha preta. As barras de erro (cores translúcidas) foram de 1 SD para cada ponto de tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Procedimento de análise dos dados de imagem microscópica de ponto final. A imagem de campo brilhante desfocada foi usada para extrair a coordenada de cada microchambers/gotículas. Com base na diferença de intensidade entre a borda dos microchambers (como primeiro plano) e outras áreas (como plano de fundo), a borda contínua e quase circular pode ser extraída do fundo. Devido à distribuição de fundo desigual em todo o campo de visão (A),alguns pré-processamento de imagem são geralmente necessários para melhorar a qualidade da saída binarizadora. Após subtrair fundo(B),o fundo de cada quadro foi uniformizado. Empiricamente, o valor de entrada no "raio de bola rolando" (passo 1) foi de 20-50 para 2048 pixels × 2048 pixels imagens e 10-20 para 512 pixels × 512 pixels. Quanto maior o valor, menor o tempo de processamento. Para reduzir o ruído na imagem subtraída em segundo plano, aplique um filtro mediano à imagem (C). Em geral, o valor de entrada no raio (passo 3) foi de 1 a 2 pixels. Como mostrado na inserção ampliada, a imagem subtraída e filtrada em segundo plano pode ser bem binarizada usando o plugin de limiar de construção para que o primeiro plano correspondente às bordas, bem como a região de interesses (ROIs) possa ser reconhecido com precisão. A detecção de ROIs para todos os quadros da imagem foi realizada utilizando-se o plugin caseiro instalado FemDA Analysis (D). O tamanho do pixel (passos 5 e 6) e a circularidade (passos 7 e 8) de ROIs, os quadros que queremos colocar no cálculo (etapas 9 e 10) foram definidos manualmente de acordo com os dados reais. Após clicar em Gerar ROI (etapa 11) e esperar, a coordenada de cada ROI nos quadros de entrada foi determinada. Depois de clicar na máscara de APLICAR ROI (etapa 12), cada ROI detectado foi fechado e destacado por uma linha amarela. Depois de abrir a imagem da fluorescência e clicar novamente na máscara de GRIPE Aplicar, a máscara ROIs determinada foi aplicada à imagem de fluorescência. O número de pixels superiores (etapa 14) especificou o número de pixels de maior intensidade de cada ROI para o cálculo da intensidade média das respectivas gotículas. Após o clique Medida intensidade (passo 15) e espera, o histograma foi gerado(E). O histograma pode ser equipado com uma soma de distribuições gaussianas usando os parâmetros disponíveis na janela histograma. Alternativamente, os dados de intensidade média podem ser exportados para um arquivo de texto (etapa 16) e analisados por outros softwares(F). (G) A probabilidade de ocorrência de gotículas contendo diferentes números de moléculas de DNA na matriz dada. O histograma (cor cinza) foi bem equipado por uma distribuição Poisson (linha tracejada vermelha) com uma média de 0,05 moléculas de DNA por gotícula, como esperado para uma distribuição aleatória de moléculas de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Análise dos dados de imagem microscópica do curso de tempo. Os ROIs detectados (seguindo as etapas 1-12 da Figura 4) foram aplicados diretamente aos dados do curso de tempo. Na etapa 13 da Figura 4,selecione Time-lapse e insira o intervalo de tempo real (em minutos) entre os quadros adjacentes no intervalo de tempo [min]. Após o clique, foram geradas a intensidade da medida (etapa 15 da Figura 4) e a espera, o enredo de intensidade de tempo e o histograma (o mesmo da Figura 4E). A posição hist especificou o ponto de tempo do histograma, que foi mostrado como uma linha vermelha vertical. O plugin também suporta especificar cores para cada linha de rastreamento. Amarelo: 0 DNA; azul era 1 DNA; vermelho: 2 DNA; preto: 3 DNA. Os dados do curso de tempo também podem ser exportados para um arquivo de texto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme suplementar 1. Clique aqui para baixar este filme. 

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Discussion

A medição altamente quantitativa baseada nas gotículas altamente uniformes, estáveis e biocompatíveis no FemDA possibilitou a distribuição discreta, a característica única do nosso estudo diferente das outras. Otimizamos sistematicamente e detalhamos os processos de microfabização e formação de gotículas neste artigo. Existem várias etapas críticas no protocolo estabelecido.

Primeiro, o revestimento uniforme do polímero CYTOP altamente viscoso no substrato de vidro fino retangular determina em grande parte a qualidade do substrato resultante. Dada a distância de trabalho geralmente curta da lente objetiva com altas ampliações (ver passo 6.1), o vidro de cobertura fina deve ser usado. Um revestimento de spin de alta qualidade em um substrato fino e flexível é geralmente complicado. Ainda não testamos todos os projetos possíveis, mas descobrimos que o mandril a vácuo de vários buracos com a mesma dimensão retangular funcionou bem para o spin-coating. É importante soltar o polímero CYTOP no centro do substrato de vidro de cobertura e iniciar imediatamente o revestimento de spin (ver passo 1.3.2). O grau de dificuldade está menos relacionado à forma do substrato, mas à viscosidade do polímero. A linha de produtos CYTOP oferece várias concentrações diferentes do pacote comercialmente disponível. O diluído que acompanha a embalagem também pode ser usado para diluir o produto original a uma viscosidade menor, se necessário. CYTOP 816 que usamos no experimento é o produto comercial com a maior concentração capaz de dissolver o polímero no solvente. O revestimento mais grosso requer menor velocidade de giro ou várias rodadas de revestimento e cura. Um gráfico de espessura característica vs. curva de velocidade de giro é altamente recomendado ao usar um novo revestimento de spin em um novo ambiente.

Em segundo lugar, a umidade adequada da sala de limpeza é crucial para a fotolitografia ideal, bem como a remoção completa do fotoresist na posição especificada. A reação fotoquímica na fotolitografia usa H2O como um dos reagentes. No entanto, o macio na temperatura superior à temperatura de ebulição de H2O remove o teor de H2O do fotoresist revestido. O fotoresist "seco" deve levar tempo para absorver H2O novamente do ar (ver passo 1.4.6). Este ponto é muitas vezes negligenciado. Dado que muitos laboratórios podem ter apenas algumas instalações simplificadas de limpeza sem controle de umidade, a umidade flutuaria drasticamente ao longo da estação ou seria afetada pelo clima. Uma solução de baixo custo é usar um umidificador ou desumidificador de uso doméstico na sala de limpeza. A camada CYTOP totalmente exposta após o desenvolvimento pode ser removida seletiva e totalmente pelo RIE, expondo totalmente o fundo de vidro. Eventualmente, a estrutura híbrida do fundo de vidro hidrofílico e da parede lateral CYTOP hidrofóbica é importante para prender acadamente a solução para o espaço femtoliter.

Em terceiro lugar, os óleos recém-encontrados (ASAHIKLIN AE-3000, Fomblin Y25) e surfactante (SURFLON S-386) mostraram desempenho de vedação sem precedentes para o reator fluoropolímero13. A injeção do óleo de descarga deve ser realizada no bloco metálico plano refrigerado (ver passo 5.2); caso contrário, gotículas perto da entrada do canal não podem ser formadas. A injeção do segundo óleo de vedação pode ser realizada na RT (ver passo 5.5). Esses óleos e surfactantes nunca foram usados em pesquisas biológicas antes. Não foram encontradas alternativas melhores por enquanto. Para expandir o arsenal da combinação útil de óleos e surfactantes para preparação de gotículas, o novo membro dos óleos (ou os similares na mesma linha de produtos) e o surfactante (ou os similares na mesma linha de produtos) são dignos de tentar ser aplicados sistemas de gotículas microfluidas.

Aqui estão dois pontos adicionais a serem notados. Um deles é o fato de que há um atraso de tempo entre os ROIs durante a imagem de microscopia. O tempo total de imagem para um ciclo depende principalmente do tamanho da matriz e da ampliação da lente objetiva. O tempo de exposição, a velocidade do obturador e a velocidade de movimento do estágio motorizado também são fatores menores. Como regra geral, a imagem de 106 gotículas a 60× ampliação exigiria pelo menos 10-20 minutos. Essa inevitável defasagem de tempo introduz alguns erros na análise de dados, que devem ser sempre levados em consideração cuidadosamente. O outro é o fato de que o número total de gotículas em um único substrato não excederia 108-109, mesmo aumentando a densidade das gotículas ou reduzindo o tamanho individual da gotícula. Isso ocorre porque o tamanho do substrato de vidro que pode ser manuseado pelo alinhador de máscara (para wafers de 4 polegadas) é limitado. Aumentar ainda mais o tamanho do vidro de cobertura não é recomendável porque um substrato de vidro grande, fino e frágil é difícil de manusear.

FemDA pode ser considerado como uma placa de microiter super miniaturizada. Qualquer reação bioquímica que tenha sido realizada em placas de microtter de 96 poços poderia ser tentada usando FemDA. Certamente pode ser usado para a medição da atividade enzimática sem purificação complicada de proteínas. Também pode ser compatível com a reação em cadeia de polimerase digital (PCR digital) e o ensaio imunosorbente ligado à enzima digital (ELISA digital)31,49. O pequeno volume, grande matriz e alta estabilidade trariam algumas vantagens sobre os métodos de bioensa de bioensação digital existentes. O sistema FemDA capaz de resolver diferentes números de moléculas de DNA de modelo em gotículas femtoliter já mostrou o poder na triagem precisa deproteínas 13. FemDA é um novo sistema de compartimentação in vitro capaz de evoluir rapidamente uma variedade de enzimas. Com os avanços em bioinformática e técnicas de construção de bibliotecas, a era de uma criação rápida sob demanda de proteínas de alto desempenho certamente virá.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo número de subvenção JSPS KAKENHI JP18K14260 e pelo orçamento da Agência japonesa de Ciência e Tecnologia da Terra Marinha. Agradecemos a Shigeru Deguchi (JAMSTEC) e Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) por fornecerem as instalações de caracterização. Agradecemos a Ken Takai (JAMSTEC) pelo suporte a software comercial. A microfabização foi realizada na Supercleanroom Takeda Sentanchi, a Universidade de Tóquio, apoiada pelo "Programa plataforma de nanotecnologia" do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT), Japão, Número de Subvenção JPMXP09F19UT0087.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).

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References

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