Screening för Amyloid aggregation av Semi-Denaturering Tvättmedel-agarosgelelektrofores

Published 7/16/2008
19 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

SDD-AGE är en användbar teknik för upptäckt och karakterisering av amyloid-liknande polymerer i celler. Här visar vi en anpassning som gör att denna teknik lämpar sig för storskaliga tillämpningar.

Cite this Article

Copy Citation

Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (17), e838, doi:10.3791/838 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Amyloid aggregering är förknippad med många sjukdomar proteiners ansamling och ligger bakom infektiösa egenskaper prioner, som är conformationally själv-mallhantering proteiner som tros ha positiva roller hos lägre organismer. Amyloid har notoriskt svårt att studera på grund av sin olöslighet och strukturella heterogenitet. Dock har upplösning av amyloid polymerer baserade på storlek och diskmedel olöslighet gjorts möjligt genom Semi-Denaturering Tvättmedel-agarosgelelektrofores (SDD-AGE). Denna teknik är att hitta utbredd användning för upptäckt och karakterisering av amyloid konformationsanalys varianter. Här visar vi en anpassning av denna teknik som underlättar dess användning i storskaliga tillämpningar, såsom skärmar för nya prioner och andra amyloidogenic proteiner. Det nya SDD-AGE-metoden använder kapillär överföring för större tillförlitlighet och användarvänlighet, och låter alla storlekar gelen skall förvaras. Således kan ett stort antal prover, som framställts av celler eller renade proteiner, behandlas samtidigt för förekomst av SDS-olösliga conformers av taggade proteiner.

Protocol

Del 1: Förbereda gelen

  1. Montera brickan gelen gjutning. Standardutrustning för horisontell DNA elektrofores kan användas. För ett stort antal prover, förbereder vi en 20 cm x 24 cm platta med upp till fyra 50-bra kammar. Se till att plattan inte har repor, eftersom dessa kan förvränga blot bilden.
  2. Skapa en 1,5% agaroslösningen (medium eller hög gel-styrka, låg EMO) i 1X TAE. Volymen ska vara tillräcklig för att fullständigt dränka kammen tänder - du kommer att vilja läsa så mycket prov som möjligt för att maximera upptäckt. Mikrovågsugn blandningen tills agarosen är helt upplöst.
  3. Snabbt lägga SDS till 0,1% från 10% lager. Swirl att blanda. Om några agarosen stelnar under detta steg, löses med hjälp av en värmeplatta och vara noga med att undvika kokning.
  4. Häll över lösningen i gjutningen facket. Använd en kam för att kratta ut några bubblor, de kunde senare störa överföringen.
  5. När gelen har satt, ta bort kammar och placera gelen i gelen tanken. Helt Sänk ner gelen i 1X TAE innehållande 0,1% SDS.

Del 2: Förbereda prover

  1. För high-throughput analys av jäst lysates, börjar vi med 2-ml kulturer vuxit över natten med snabb omrörning i 96-bra block. I detta fall är varje kultur överuttryck av ett protein av intresse. Vid analys liten förekomst proteiner, måste större kulturvolymer användas
  2. Harvest cellerna genom centrifugering vid 2000 RCF i 5 min vid rumstemperatur.
  3. Resuspendera cellerna i vatten och centrifugera igen.
  4. Resuspendera i 1 ml spheroplasting lösning. Inkubera i ca 30 minuter vid 30 ° C (du kan bekräfta spheroplasting effektiviteten med mikroskopi).
  5. Centrifugera vid 800 RCF i 5 min vid rumstemperatur. Helt ta bort supernatanten.
  6. Resuspendera pelleterat spheroplasts i 100 ml lyseringsbuffert.
  7. Täck blocket med tejp och skaka på hög hastighet i 2 min.
  8. Pellets cellulärt skräp vid 4000 RCF i 2 min.
  9. Ta försiktigt bort supernatanten till en ny container, t.ex. ett 96-bra PCR-plattan.
  10. Om du vill kan bestämma proteinets koncentration av lysates.
  11. Lägg 4X prov buffert för att de prover för att generera lysates innehåller 1X prov buffert. Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur.
  12. Ladda gel. Om så önskas, spara hälften av provvolymen och koka den för SDS-PAGE analys. För att övervaka i vilken utsträckning överföring senare, inkluderar en pre-färgade SDS-PAGE markör. Dessutom kan en molekylviktsmarkör bestående av mycket stora proteiner (t.ex. kyckling pectoralis extrakt) användas för att uppskatta storleken på löst komplex.
  13. Kör på låg spänning (≤ 3 V / cm gel längd) tills färgen når ~ 1 cm från änden av gelen. Detta kommer att ta flera timmar. Det är viktigt att gelen förblir svala, annars diffusion av lågmolekylära proteiner (t.ex. monomerer) kan begränsa deras upptäckt.

Del 3: Överför

  1. Klipp en bit av nitrocellulosa i samma dimensioner som gelen.
  2. Klipp 20 bitar av GB004 och 8 bitar GB002 läskpapper till samma dimensioner som gelen. Klipp en extra bit GB004 att användas som en veke, gör det cirka 20 centimeter bredare än gelen.
  3. Sänk ned nitrocellulosa, veken, och 4 bitar av GB002 i 1X TBS.
  4. I en plastbehållare, montera en bunt papper som följer: 20 bitar av torra GB004, då 4 bitar av torra GB002, sedan en bit före våta GB002. Lägg nitrocellulosa på toppen av denna stack.
  5. Skölj gelen på gjutning plattan en kort stund i vatten för att avlägsna överflödig löpande buffert. Sedan försiktigt börja glida gelen ur facket på stacken. Samtidigt glider gelen ur facket, släck membranet med TBS vid behov. Den extra bufferten förhindrar bubblor från att bli instängda i gelen. En överföringspipett fungerar bra för detta ändamål.
  6. När gelen har flyttats till stacken, kolla noga för bubblor. Om något finns, lyft kanten av gelen och återanvända buffert så att bubblorna kan utarbetas.
  7. Sätt de återstående tre före fuktade GB002 bitar ovanpå gelen. Säkerställa fullständig kontakt mellan alla lager genom att rulla en pipett fast överst i bunten.
  8. Flank överföringen stacken med två förhöjda lådor med TBS. Drapera före våta veke hela bunten så att vardera änden av veken är nedsänkt i TBS.
  9. Täck de församlade överföringen stacken med ytterligare en plastbricka med extra vikt (t ex en 500 ml flaska vatten).
  10. Låt överföringen fortsätta i minst tre timmar eller över natten.
  11. Efter överföring kan membranet bearbetas av standard Western blotting.

Spheroplasting Lösning
1,2 M D-sorbitol
0,5 mM MgCl 2
20 mM Tris, pH 7,5
50 mM BME (lägg färska)
0,5 mg / ml Zymolyase 100T (lägg färska)

coration: underline; "> lyseringsbuffert
100 mM Tris 7,5
50 mM NaCl
10 mM BME (lägg färska)
proteashämmare (lägg färska)

4X Exempel Buffer
2X TAE
20% glycerol
8% SDS
Bromfenolblått till önskemål

Discussion

SDD-AGE först rapporterades av Kryndushkin et al. 1, för att studera SDS-resistenta komplex av [PSI +] prion i jäst, och har sedan funnit en bred användning studera både prioner och andra prion aggregat 2-9. Det är dock överföring av proteiner till ett membran efter elektrofores på en agarosgel problematiska, och kan resultera i en förvrängd blot bild 5. Dessutom introducerar nedsänkt electroblotting teknik som används mest praktiska begränsningar för storleken på gelen och därmed antalet prover som kan behandlas. Vi har tagit upp dessa problem genom att anställa nedåt kapillär överföra 10, en enkel procedur som använder en bunt torrt gråpapper att överföra proteiner från gelen till ett nitrocellulosa membran. Kapillär överföra förhindrar distorsion och tillåter stora geler som ska behandlas enkelt. Det finns några saker att tänka på innan du använder SDD-AGE. För rå prover (t.ex. lysates) är immunodetection av specifika proteiner som behövs. SDD-AGE inte fullt denaturera proteinkomplex av intresse, så det protein (er) som skall detekteras måste bära en epitop tagg utanför amyloidogenic regionen. Lysates kan generellt förberedda som de skulle vara för en normal SDS-PAGE, med två viktiga skillnader. Först måste en ökad försiktighet iakttas för att förhindra nedbrytning av proteolys. Den delvis denaturering villkor används här inte är tillräckliga för att inaktivera proteaser, och kan också göra målproteiner mer mottagliga för proteolys. Använd en komplett cocktail proteashämmare vid minst två gånger den rekommenderade koncentrationen. För det andra, uppvärmning av prover bör undvikas. Om en all-monomer negativ kontroll önskas, t.ex. för att bekräfta att med hög molekylvikt arter är inte på grund av kovalenta modifieringar, en 10-minuters inkubation vid 95 ° C kan användas, vilket kommer att återställa de flesta amyloid till monomera protein.

Acknowledgements

Vi tackar Simon Alberti för hjälp med att utveckla detta protokoll. Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (GM25874), en Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (SL), och en National Science Foundation predoctoral utbildning bidrag (till RH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
zymolyase 100T Seikagaku Corporation 120493-1
Halt Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific, Inc. 78429
Hybond-C extra nitrocellulose Amersham RPN303E
GB004 blotting paper Whatman, GE Healthcare 10427926
GB002 (3MM Chr) blotting paper Whatman, GE Healthcare 3030-917
Agarose (UltraPure) Invitrogen 15510-027

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).
  2. Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).
  3. Allen, K. D., et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics. 169, 1227-1242 (2005).
  4. Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation. The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).
  5. Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
  6. Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase. Current Genetics. 49, 21-29 (2006).
  7. Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).
  8. Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability. Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).
  9. Douglas, P. M., et al. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).
  10. Nagy, B., Costello, R., Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).

Comments

19 Comments

  1. Thanks. This is the best form to communicate results, I have this idea long time ago.. I would like to publish my results like this soon. Please let me know How I need to do it. COngratulations!!!   Dr. Gabriela A. Balogh Genetic Laboratory CERZOS-CONICET BAHIA BLANCA-ARGENTINA EMAIL: gabalogh@criba.edu.ar tel: 54-²91-48611²4 Int:188

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2008 - 7:53 AM
  2. Hi Gabriela, I agree this publication format is very useful.  It really lowers the activation barrier for people considering using a new technique, and it reaches a large audience.  There is an online submission process that you should start with when you are ready to submit.  If you are concerned about how to make the video, just email the editors.  They are very helpful.  For my submission, I emailed the editor with a detailed protocol, then worked with them to make a script.  A videographer was provided by JoVE to record the video, but I'm not sure if they can do this for all shoot locations.  Overall they made the submission process very easy.  Good luck! Randal

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2008 - 12:56 PM
  3. very cool work done

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 21, 2008 - 10:20 PM
  4. This definitely is a new format of publication. It's so cool. Not only a combination of video and paper. But also a very good method to show the ideas of authors. Also I learned a lot tips from this great work that I can not found from the pdf files.   Haitao Zhang Department of Cell Biology and Molecular Genetics Microbiology Bldg University of Maryland College Park, MD ²074² 301 405 0547

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 21, 2008 - 10:33 PM
  5. This new way to share methods and protocols is very nice, though I think that  it will not be simple for people around the world to produce high quality videos. I've a question for Randal, regarding  the statement that "a 10-minute incubation at 95°C  will restore most amyloids to monomeric protein". Is it a personal observation or is it based on published data? Isn't the resistance to the denaturation in boiling Laemmli buffer (which contains much more SDS than your partially denaturing buffer) usually reported as a typical feature of many amyloid aggregates?   Stefania

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2008 - 10:07 AM
  6. Hi Stefania,   While the concentration of SDS in the gel and running buffer is only 0.1%, it is ²% in the sample buffer. Previous work with Sup35 prion amyloids has shown that they are denatured under these conditions (²% SDS, 10’ at 95C). For an example, see: Mechanism of Cross-Species Prion TransmissionAn Infectious Conformation Compatible with Two Highly Divergent Yeast Prion Proteins.  Cell ²005, Volume 1²1 , Issue 1 , Pages 49 - 6² M . Tanaka , P . Chien , K . Yonekura , J . Weissman   Amyloids do vary in their stability when boiled in SDS, as aβ and polyglutamine fibers have been reported to resist such a treatment (see work by R. Wetzel). But in my experience, the vast majority of intracellular amyloids (including all aggregates visualized in the results section of this protocol) are readily solubilized at 95C in ²% SDS.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 6, 2008 - 4:38 PM
  7. thanks alot for sharing methods. I have a question, can I make the lysis buffer and Spheroplast solution without BME? DŒs BME play an important role in this procedure?

    Reply
    Posted by: mahshid R.
    February 21, 2009 - 8:01 AM
  8. thanks alot for sharing methods.I have a question, can I make the lysis buffer and spheroplast without BME?

    Reply
    Posted by: mahshid R.
    February 21, 2009 - 8:10 AM
  9. thanks alot for sharing methods. I have a question, can I make lysis buffer and spheroplast solution without BSE?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2009 - 2:30 AM
  10. thanks alot for sharing methods. I have a question, can I use lysis buffer and spheroplasting solution without BME? thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2009 - 4:17 AM
  11. Hi Randal, do you have a feel if this would work for amyloids in brain homogenate? Do you have a feel if the amyloid associated proteins in a plaque (e.g., stuff bound to abeta) would also be resistant to solubulization in SDS? I was wondering if this would perhaps be a way to enrich plaque proteins for LC-MS analysis.

    Reply
    Posted by: Roger M.
    June 29, 2009 - 9:54 PM
  12. Hi Rojelio. I've never tried it, but I imagine SDD-AGE will work just fine for brain homogenate. I know that people are successfully using it with cell culture lysates. It's definitely worth giving it a try on a small scale. I doubt that non-amyloid plaque associated proteins will remain structured in the SDS treatment, however. Also, in thinking about it, I think you'd have to find a way to solublilize the SDD-AGE-resolved aggregates prior to LC-MS. If you find a way to couple this with identification of amyloid proteins I would be very eager to know! Good luck!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 5, 2009 - 11:21 PM
  13. Thank you for posting this article! I have been using agarose gels to resolve aggregates from multiple Huntington's disease models including cells and mouse brain tissue. I am strugging to find a good high molecular weight marker. I have recently tried using the CPE, but I haven't really had any luck resolving the titin band. Do you have any suggestions about a marker to use? Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 28, 2010 - 3:05 PM
  14. Hi Emily. Generally we don't use the high molecular weight marker, as it only provides a rough estimate anyway (the amyloids likely migrate differently than large soluble proteins). We often include a normal SDS-PAGE marker (highest band at ²50kD) to verify transfer and show at least that proteins are running higher than ²50kD. I've also tried Invitrogen's NativeMark protein standards and found that some of the proteins do not denature on SDDAGE and can provide an alternative to CPE. However, I think the best marker may be von Willebrand factor, a serum protein that forms covalent multimers up to 1.8mD, although I haven't tried it yet. Here's a reference you can start with:
    Bone Marrow Transplantation (²007) 40, ²51&#x²013;²59; doi:10.1038/sj.bmt.17057²4; published online 4 June ²007
    Prophylactic fresh frozen plasma may prevent development of hepatic VOD after stem cell transplantation via ADAMTS13-mediated restoration of von Willebrand factor plasma levels
    M Matsumoto, K Kawa, M Uemura, S Kato, H Ishizashi, A Isonishi, H Yagi, Y-D Park, Y Takeshima, Y Kosaka, H Hara, S Kai, A Kanamaru, S Fukuhara, M Hino, M Sako, A Hiraoka, H Ogawa, J Hara and Y Fujimura.
    If you obtain a source of von Willebrand Factor (either purified or crude, plus antibody), you'd be all set.

    Randal

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2010 - 3:51 PM
  15. Hello Randal, I have also had issues with CPE, so am looking into using VWF, as you suggest. However, VWF runs as many different size multimers, so how do you suggest we determine the molecular weight of each band if we plan to use it as a ladder?

    Reply
    Posted by: Nayan L.
    May 1, 2014 - 9:42 AM
  16. Dear Dr Emily
    Im a pHd student from Portugal. The reason why I send you this e-mail is because im planning to perform Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis in brain samples. In the article from Randal Halfmann they do not refer the protocol to prepare protein extracts from mouse brain.
    Can you give the protocol that you use?

    Thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 22, 2010 - 5:35 AM
  17. A protocol on tissues or mammalian cells would be most useful! Or a reference would help. Would it be enough to break the cells in the lysis buffer, spin down and use the supernatant?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2011 - 10:45 AM
  18. To answer my own question, I tried it on various preps and it worked fine!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 28, 2011 - 11:00 AM
  19. Hello! We are attempting to perform this protocol on yeast to test to see if a natively expressed protein aggregates at mid-log phase under different genetic backgrounds. For this, we are collecting 50 mL cells at OD 0.5, flash freezing in liquid nitrogen, then lysing as described in the (excellent) protocol above. However, we are not getting very good gel results. Do you have any advice? We are using GFP tagged protein and running our gels for about 8 hours at 3 V/cm in the cold room and performing the capillary electrophoresis as described. Any help could be greatly appreciated. Thanks!

    Reply
    Posted by: Kevin M.
    October 14, 2016 - 2:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats