Summary
这里介绍的是一个表皮与真皮分离的协议，用于评估炎症调解器的产生。炎症后，大鼠后爪表皮在4°C下由热利辛从真皮中分离出来。 然后，通过RT-PCR进行表皮分析，通过西方污点和免疫造血术进行蛋白质评估。
Abstract
在皮肤损伤、炎症和/或敏感期间，需要易于使用和廉价的技术来确定炎症调解人和神经营养素的特定产地。本研究的目标是使用热解酶（一种在4°C下活跃的蛋白酶）来描述表皮-皮肤分离协议。 为了说明这个程序，斯普拉格道利大鼠麻醉，右后爪注射卡拉吉南。注射后6小时和12小时，有炎症和天真的老鼠被安乐死，一块后爪，斑点皮肤被放置在寒冷的Dulbecco的改良鹰介质。然后，在地下室膜上用氯化钙将热碱与真皮分离。接下来，真皮由微分切钳固定，表皮被轻轻地调戏。组织部分的甲苯蓝色染色表明表皮与地下室膜上的真皮干净分离。所有角膜细胞层保持完好无损，表皮干脊以及皮肤的凹痕被清晰观察。定性和实时RT-PCR用于确定神经生长因子和间柳金-6表达水平。最终进行西式印迹和免疫造血术，以检测神经生长因子的数量。本报告表明，冷热解素消化是将表皮与真皮分离的有效方法，用于评估炎症期间的mRNA和蛋白质变化。
Introduction
从皮肤对炎症调解人和神经营养因子的评价可以受到限制，因为在发炎的真皮和表皮1，2，3中发现的细胞类型的异质性。最近对涉及两层分离或进行细胞分离评价的几种酶、化学、热或机械技术进行了审查。酸、碱、中性盐和热量可以迅速将表皮与真皮分开，但细胞外肿胀通常发生在5、6。胰腺素、弹性酶、角蛋白酶、拼贴酶、前列腺素、脱口香剂和热解酶是用于表皮-皮肤分离的酶4、7。特普辛和其他大尺度蛋白酶在37~40°C下活跃，但必须仔细监测，防止表皮层分离。迪斯帕塞在拉米纳登萨切开表皮，但在寒冷的4，8或更短的时间点在37°C 4，9中分离需要24小时。所有这些技术的一个限制特征是组织形态的潜在破坏和mRNA和蛋白质的完整性损失。
为了保持mRNA和蛋白质的完整性，应在寒冷中短期进行皮肤分离方法。在评估炎症研究的皮肤分离技术时，热解酶是一种有效的酶，在寒冷的温度下将表皮与真皮分离。热蛋白在4°C下活跃，将表皮除颤体与拉米娜卢西达分离，并将表皮与真皮在1~3小时4、8、10内分离。本报告的目标是优化使用热解质将发炎的老鼠表皮与真皮分离，以检测炎症调解人和神经营养因子的mRNA和蛋白质水平。已提出若干初步报告，包括11、12、13、14、15。这份手稿的目的是描述使用热解质的最佳皮肤分离技术，并证明检测1）炎症标记，2）间柳金-6（IL-6）mRNA，和3）神经生长因子（NGF）mRNA和蛋白质在大鼠表皮与卡拉吉南诱发炎症（C-II）16，17。使用完整的Freund的辅助模型的初步报告显示，NGF mRNA和蛋白质水平在炎症15期间提前增加。在小鼠中，皮肤敏感与牛酮的局部应用导致IL-6 mRNA使用原位杂交36的早期上升。IL-6和NGF都与C-II18、19有牵连，但是没有报告描述IL-6或NGF的mRNA或蛋白质水平，特别是从C-II急性期的表皮。
热解素技术价格低廉，性能简单明了。此外，在炎症过程中，表皮与真皮的热解质分离允许mRNA、西式污点和炎症介导器和神经营养因子的免疫史化学分析。研究者应该能够在皮肤炎症的临床前和临床研究中轻松使用这种技术。
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Protocol
该协议遵循俄克拉荷马州立大学健康科学中心（#2016-03）的动物护理指南。
1. 卡拉吉南诱发炎症 （C-II）
- 麻醉雄性和/或雌性斯普拉格道利大鼠（200×250克;8×9周大）与异黄酮（或注射麻醉剂）。
- 触摸角膜并轻轻捏左后爪，检查麻醉深度。当动物被适当麻醉时，不会观察到角膜或爪子的反应。
- 皮下注射正确的玻璃，后爪与100微升的1%（w/v）+卡拉吉南稀释在磷酸盐缓冲盐水（PBS）20。
- 确保使用适当的控制，如天真的老鼠没有异黄素在本报告中。初步研究表明，有或没有异黄素的天真大鼠具有与表皮IL-6和NGF相同的基底表达。
注：天真的老鼠是炎症研究的首选对照，因为皮下盐水或PBS引起局部炎症23，37。
- 确保使用适当的控制，如天真的老鼠没有异黄素在本报告中。初步研究表明，有或没有异黄素的天真大鼠具有与表皮IL-6和NGF相同的基底表达。
- 评估C-II大鼠的水肿，以保证卡拉吉南（图1）20的有效性。通过用卡钳测量后爪骨质厚度来确定水肿的量。
- 在6×12小时，安乐死大鼠与CO2（ 或注射麻醉过量），并削减1毫米x2毫米的光泽后爪皮肤与锋利的手术刀。如果使用毛茸茸的皮肤，则在切割 1 mm x 2 mm 皮肤之前剃须。
注意：确保根据具体研究选择适当的时间点。 - 使用微分化钳，将皮肤转移到1兆升的冷杜尔贝科的改良鹰中（DMEM）在冰上的微中心管，并保持冷15-60分钟。
2. 表皮和真皮的热解素分离
- 准备并激活热解素。
- 准备热溶胶溶液，在 pH = 8（浓度 500 μg/mL）下将 5 毫克 的地巴霉素三叶草 添加到 10 mL 的 PBS 中。
- 通过在 10 mL 蒸馏 H2 O 中加入 1.11 克氯化钙 （CaCl2无水性）， 准备 1M 溶液。
- 为防止热解铝的自解，在 10 mL 的热解液中加入 10 μL 氯化钙。氯化钙最终浓度为1米。
- 阿利奎特1mL活性热解素进入冰上24井细胞培养板的10口井。
- 使用热解酶消化将表皮与真皮分离。
- 使用微分体钳，将一个皮肤样本转移到每性热解辛井中。确保不要将皮肤浸入热解液中。
- 轻轻轻点井侧的皮肤，帮助将皮肤样本从钳子中释放到热解液上。
- 将皮肤漂浮到热解剂溶液中， 层角膜 （外表皮）朝上，真皮朝下。关键是真皮朝下，否则不会发生有效的分离。
注：热解质孵化的时间量必须由最终用户以经验确定。来自斯普拉格道利大鼠（200+250克;8+9周大）的后爪皮肤，通常需要2.0+2.5小时的分离。孵化时间预计将因物种和年龄而异。 - 在热解酶中适当孵育时间后，使用微分切钳将一个皮肤样本转移到 6 井细胞培养板的井中，该井的冷 （4°C） DMEM 为 7+8 mL。这为表皮与真皮分离留出更多空间。
- 将皮肤浸入 DMEM 中。
- 轻轻地用钳子刷皮肤周围，直到在边界观察到近半透明表皮。如果无法实现此目标，将皮肤样本返回热解素溶液，再持续 15 至 30 分钟。
- 一旦表皮明显地从真皮分离，然后小心地用微分切钳将表皮和真皮同时抱住，然后非常缓慢地将表皮从真皮中拉出。
- 评估孤立表皮的半透明性，并确保其在光学上是一致的。请参 阅图 2， 例如 1 mm x 2 mm 的鼠表皮样本。如果半透明有变异，则未发生适当的分离。
- 在分离的表皮和真皮片中使用乙酰胺乙酰酸 （EDTA） 灭活热解压素。
警告：留在表皮和真皮中的热解压素仍然有效，如果不灭活，可能会损坏层。- 准备 0.5 M EDTA 股票解决方案。为此，将 0.93 g EDTA 缓慢添加到 5 mL 的双蒸馏水中。将氢氧化钠添加到溶液中，直到溶液清除。确保解决方案的 pH 值为 +8.0。
- 在 DMEM 中制作 5 m M EDTA 解决方案。将 0.25 mL 的 0.5 M EDTA 库存解决方案添加到 25 mL 的 DMEM 中。
- 将分离的表皮和真皮放入 5 m EDTA/DMEM 溶液中，在 4 °C 下放置 30 分钟，以停用热解压素的活动。
- 用药理直学8，9，10评估表皮。
- 在室温下（RT）用0.8%的皮酸溶液将部分表皮固定在1小时的中性甲醛、4%的副甲醛或0.25%的甲醛中。
- 将固定表皮放在 Pbs 中的 10% 蔗糖中， 在 Rt 进行 1 小时的搅拌。
- 将表皮冻结在组织嵌入基质中进行分割。使用低温统计器将 14 μm 横截面切割，并在明胶涂层玻璃显微镜滑梯上解冻安装部分。
- 90 年代，滑梯上的干燥部分加热并弄脏，并带有甲苯蓝色 （TB; 1% 氯化钠中的 10% 结核病） 工作溶液。带感性安装介质的阿波斯盖片。
- 以50xx×250倍的亮场显微镜观察表皮。
注意：如果发生适当的分离，表皮将从真皮中干净地分离，并检测到五层： 层巴萨莱、 地层脊柱、 地层颗粒、 地层清醒 和 地层角膜。图 3中可以看到分离的老鼠皮肤表皮的例子。
3. 蛋白质提取和西式污点分析
- 使用先前公布的协议21对分离的组织样本进行西式印迹。
- 将表皮同质化在 50 μL 的裂解缓冲器 （25mM Tris HCl， pH = 7.4， 150 m NaCl， 1 mM EDTA， 5% 甘油， 和 1% Triton X-100） 含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂鸡尾酒。
- 离心机样品在4°C时以最大速度15分钟，使用蛋白质检测试剂盒评估超高分子的蛋白质浓度。
- 将等浓度的蛋白质（30微克）加载到SDS凝胶上，进行电泳，然后将蛋白质转移到硝基纤维素或PVDF膜上。
- 块膜与5%牛奶为2小时，并在原发性抗体（老鼠抗NGF，E12，1：1000）中孵育过夜。
- 用PBS用PBS洗3倍，每次0.3%补间10分钟，并用标记的二级抗体（例如，标有兔抗鼠IgG的碱性磷酸盐）孵育。
- 使用扫描系统评估西式污点信号（例如 ECF 基板和成像平台）。
4. 免疫化学
- 将组织样本放在固定剂中，以获得最佳免疫反应：0.96% （w/v） 皮酸和 0.2% （w/v） 甲醛在 0.1 M 磷酸钠缓冲区， pH = 7.321，22，23代表 4 小时在 RT. 转移到 10% 蔗糖在 PBS 过夜在 4 °C.
- 对组织21、22、23部分进行标准免疫造血术。
- 将动物的表皮嵌入嵌入矩阵的单个冷冻块中，并在低温统计上切割 10 30 μm 部分。将部分安装在明胶涂层、玻璃显微镜滑梯上，在 37 °C 下干燥 2 小时。
- 在PBS中清洗三个10分钟的冲洗部分，在原发性抗血清中孵育24~96小时，[例如，小鼠抗NGF（E12，1：2000）]和兔子抗蛋白基因产物9.9（PGP 9.5， 1：2000） 稀释在 PBS 包含 0.3% （w/v） 特里顿 X-100 （PBS-T） PBS-T 与 0.5% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 0.5% 聚乙烯皮罗酮 （PVP）.
- 在原发性抗鼠潜伏后，在PBS中冲洗三次10分钟，在亚历克萨氟488驴抗兔IgG（1：1000）和亚历克萨氟555驴抗鼠IgG（1：1000）中潜伏1小时，在PBS-T中稀释。
- 在 PBS 中冲洗三次，10 分钟，并贴上覆盖唇，具有不褪色的安装介质，以延缓免疫荧光的褪色。
5. RNA分离和cDNA合成
- 在皮肤样本21上执行标准反转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）。使用苯酚、瓜尼丁异氰酸酯溶液分离总RNA。
- 由莫洛尼穆林白血病病毒逆转录酶进行补充DNA合成。
- 使用以下引物序列进行 NGF 和 IL-6 放大：
恩格夫 （感觉） - 格特加克克克塔加格
Ngf （反感） - 格特加特克特加特加特加塔克特
IL-6 （感性） - 盖特盖特加特加特加特格特加特格特格特加特加特格特加特格
伊尔 - 6 （反感） - 格塔加加加特卡加加加格 - 将NGF和IL-6 mRNA的水平与β-actin家政基因进行比较：
β- 阿克廷 （感觉） - 特格加卡塔加加加格特克特克塔克塔克
β - 阿克廷 （反感） - 加克克特卡特克塔加特加 - 使用热循环器进行定性 RT-PCR 评估，使用 qRT-PCR 系统进行定量实时 PCR （qRT-PCR） 评估。
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Representative Results
卡拉吉南注射到大鼠后爪引起典型的炎症症状，如发红和水肿16，17。后爪肿胀是用机械卡钳20测量的。在卡拉吉南治疗之前，每只大鼠的爪子厚度基线值得到，并在6小时和12小时再次测量。与基线值（图1）相比，爪厚显著增加。
鼠光后爪皮的热利辛孵化产生表皮。布莱特菲尔德显微镜用于评估表皮和真皮热解素分离的有效性（图2）。表皮的层可以确定，同时以更高的放大倍率通过表层进行聚焦。表皮横截面的甲苯蓝色染色表明表皮与地下室膜上的真皮分离（图3）。表皮脊（表皮钉）以及皮肤的凹痕完好无损。观察了所有角膜细胞层。
热蛋白分离表皮的西性印迹产生一致的结果，表明在4°C的技术期间蛋白质水平稳定。 在天真的老鼠表皮中检测到的NGF蛋白很少，但与天真的动物相比，NGF蛋白水平在6小时C-II后得到了调节（250%）。在C-II的12小时后，NGF水平与6小时相比有所降低，但相对于对照组，NGF水平仍然较高（55%）。分离表皮中的NGF免疫造血术提供了可靠的免疫染色，并证实了来自西方斑点的结果（图5）。在天真的控制表皮中未检测到NGF免疫反应（ir），但在6h C-II时，在地层颗粒和地层清醒的大多数角膜细胞中都存在NGF-ir。层脊柱的几个细胞在6h C-II时是NGF免疫反应（IR）。在12h C-II时，NGF-ir发生在地层颗粒和地层清醒的角膜细胞中，部分细胞在地层颗粒中强烈NGF-IR。在地层巴萨勒或地层角膜中未检测到NGF-ir。PGP9.5-IR 内皮质、静脉曲张神经纤维存在于与天真和 C-II 大鼠分离的表皮中（图 5）。
定性RT-PCR表明，热利辛分离表皮（图6A，图7A）有优质的mRNA。使用作为定量实时PCR的家政基因，与天真的老鼠相比，C-II期间表皮中的NGF mRNA表达显著升高（>3倍）。12时，NGF mRNA恢复到基线水平（图6B）。使用Actin作为定量实时PCR的家政基因，与天真的老鼠相比，C-II期间表皮中的IL-6mRNA显著升高（>6倍）。在12小时，IL-6 mRNA水平从6小时的数量大幅下降，但与天真的老鼠相比仍然升高（2倍）（图7B）。
图1：卡拉吉南注射产生爪水肿。
在卡拉吉南治疗之前，每只大鼠都获得了基线值。经过6小时和12小时的治疗，爪子厚度显著增加相比，基线值。结果表示为SEM每次治疗有6只大鼠（*p <0.05，**p <0.01，***p<0.001;学生的t测试，未修复，双尾，在每个时间点进行）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：热利辛产生表皮。
布莱特菲尔德显微镜显示，半透明表皮片的大小约为1毫米×2毫米。表皮的层可以确定，同时以更高的放大倍率通过表层进行聚焦。缩放栏 = 500 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：表皮的葫芦酸蓝色染色。
布莱特菲尔德显微镜确定热解素导致表皮与真皮的有效分离。表皮脊（表皮钉 ; 箭头）与皮肤（箭头）的凹痕一起观察到。所有角膜细胞层都完好无损。Sb： 地层巴萨勒， Ss： 地层脊柱， Sg： 地层颗粒， Sl： 地层清醒， Sc： 地层角膜。缩放栏 = 100 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：卡拉吉南诱发炎症期间表皮中的NGF蛋白表达。
与天真的动物相比，在6小时的炎症后，NGF水平增加了（250%）。12小时后，水平降低到6小时，但与天真的动物相比，水平升高（55%）。结果表示为SEM每组有三只老鼠（*p <0.05，**p <0.01，***p<0.001;学生的t测试，未修复，双尾执行每个时间点） 请点击这里查看这个数字的较大版本。
图5：C-II期间的NGF和PGP9.5免疫反应（ir）。
列 A、B、C 显示 NGF-ir、PGP9.5-ir 和 DAPI 核污渍，而列 A1-C1仅显示 NGF-ir。在所有图像中，地层角膜朝左倾斜，层角膜朝右倾斜。在天真的控制表皮（A，A1）中未检测到NGF-ir。在6h C-II（B，B1）时，NGF-ir存在于地层颗粒（短箭头）和地层清醒（长箭头）的大多数角膜细胞中。层脊柱的几个细胞在 6h C-II （大箭头） 下为 NGF-ir。在12h C-II （C，C1）时，NGF-ir 发生在地层颗粒和层清醒（长箭头）的角膜细胞中，一些细胞在地层颗粒中强烈NGF-ir（短箭头）。在地层巴萨勒或地层角膜中未检测到NGF-ir。PGP9.5-ir 内皮质神经纤维存在于与天真和 C-II 大鼠（小箭头，A-C）分离的表皮中。Sb： 地层巴萨勒， Ss： 地层脊柱， Sg： 地层颗粒， Sl： 地层清醒。缩放栏 = 50 μm.请单击此处查看此图的较大版本。
图6：卡拉吉南诱发炎症期间的NGF mRNA。
C-II期间热裂解表皮中的NGF mRNA表达由定性PCR（A）和定量实时PCR（B）进行评估。NGF 和行动素的定性 mRNA 污点 （A） 表明，在炎症期间可以评估质量良好的 mRNA。C-II 期间表皮中的 NGF mRNA 表达通过定量实时 PCR 使用作为家政基因 （B） 进行评估。与天真的未经治疗的老鼠相比，NGF mRNA在6hC-II后显著升高（>3倍），但水平恢复到12h（B）的基线。结果表示为SEM，每组有三只老鼠（*p <0.05，**p <0.01，***p<0.001;学生的t测试，未修复，双尾在每个时间点执行）。请单击此处查看此图的较大版本。
图7：卡拉吉南诱发炎症期间的IL-6 mRNA。
C-II期间热裂解表皮中的IL-6 mRNA表达由定性PCR（A） 和定量实时PCR（B）进行评估。IL-6 和行动素的定性 mRNA 污点 （A） 表明炎症期间有质量良好的 mRNA 进行评估。C-II 期间表皮中的 IL-6 mRNA 表达通过定量实时 PCR 使用作为家政基因 （B） 进行评估。IL-6 mRNA 在 C-II 6 小时后显著升高（> 6 倍），而天真的未经治疗的大鼠 （B）。在12小时，IL-6 mRNA水平从6小时水平显著降低，但与天真的老鼠（B）相比仍然高（2倍）。结果表示为平均S.E.M每组有两只老鼠（*p <0.05，**p <0.01，***p<0.001，学生的t测试，未修复，双尾在每个时间点执行）。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
研究确定，大鼠后爪光泽皮肤的表皮很容易与真皮分离，使用热解质（0.5 mG/mL）在PBS与1mM氯化钙在4°C为2.5小时。表皮学评估表明，表皮与地下室膜上的真皮分离，表皮山脊完好无损。热蛋白是由Gram阳性（地理）热蛋白酶24产生的细胞外金属蛋白酶。其活动稳定在4°C，但在10，24，25的宽范围温度下工作。这种酶已广泛用于蛋白质化学24，25，但几个组已表明其应用皮肤分离成表皮和/或皮肤表4，8，10，26，27。Walzer等人是第一个报告人类皮肤表皮-皮肤分离使用热碱在4°C（250+500微克/mL为1h）10。通过光和电子显微镜，确定分离发生在层压素和牛皮蛋白抗原位点10之间的表皮地下室膜上。
此外，地基角膜与地下室膜的附着物，有选择地在10、29中被破坏。Rakhorst等人将热碱（4°C，500微克/毫升，过夜）与兔胸粘膜8的表皮-皮肤分离进行了比较。热解素在将粘膜表皮与真皮分离方面是不完整的，表明物种、孵化时间、溶液成分（无CaCl2以防止热解质自解24）、热解原和/或从其他研究10、26、27中指示的特定部位差异可能发生差异。当前协议的最终用户应确保使用新鲜的热碱，并始终包括氯化钙，但也应意识到这些潜在的限制。
虽然一些研究人员在37°C26，29使用过热解蛋白，但使用此协议的人应该注意将皮肤组织保持在4°C，以保持蛋白质和mRNA的稳定性。我们在4°C处使用DMEM作为热解酶分离前后的皮肤解决方案，因为它在培养28中保持细胞的用处，并且以前曾用于与热解酶8、26、27、30、31进行皮肤分离。然而，Walzer等人使用无菌PBS补充200微克/mL链霉素，200U/mL青霉素，和2.5微克/mL真菌酮10，而其他人使用不同的介质（例如，角膜细胞培养介质无表皮生长因子），其次是PBS冲洗29。
在协议中，热碱分离在PBS（pH = 8）中执行500微克/mL热碱和5mM氯化钙，类似于原来的方法10。DMEM已用作4°C（过夜）8的热解酶分离解决方案，HEPES缓冲液在37°C的37°C 2小时29度热溶液中得到有效使用。然而，我们没有探索培养介质或其他缓冲物如何影响热解素的表皮-皮肤分离活性。氯化钙是减少热解质24 ， 32的自动解剖和删除这一步骤可能导致从真皮8表皮的不完全的重要补充。
皮肤样本的大小似乎影响热裂解素孵育所需的时间和真皮表皮的酶的有效性。调查人员需要评估适合自己的组织的样本大小和孵化时间。将样品漂浮在热解液上，表皮朝上，对于最佳酶效性非常重要。如前所述，热碱作用部位位于角膜中层体和地下室膜4、10、29：因此，热解剂从皮肤边缘向内工作。根据我们的经验，皮肤边缘比样品中间更早分离，重要的是留出足够的时间进行完全的酶。当完成时，表皮应轻松从真皮中拉开。如果仍然连接，拉扯层可能会导致部分真皮脱落与表皮。
热解素技术的局限性是所需的时间。将热解辛浓度提高到500μG/mL以上不会减少分离时间，而且高浓度10的表皮保存不良。表皮-皮肤分离方法最近经过4次审查，许多方法在20°40°C下需要30~60分钟。 皮肤的热量（50~60°C）分离发生得很快（30秒至10分钟）4，但众所周知，蛋白质和mRNA在如此高温下会迅速降解。或者，RT的硫氰酸钠（2 N）可能是一种可以接受的快速分离技术（5分钟）4，6，但蛋白质和mRNA的完整性尚未研究与这种方法6。冷热解剂方法是为保存蛋白质和mRNA而选择的，但是没有使用其他技术直接比较蛋白质和mRNA的完整性。
在本研究中，冷热解素消化被证明是将表皮与真皮分离的有效方法，用于评估炎症期间的mRNA和蛋白质变化。在卡拉吉南引起的炎症期间，NGF mRNA 和蛋白质水平以及 IL-6 mRNA 水平在 6 h 时升高，返回接近基线 12 小时。通过免疫造血术，NGF的免疫反应在6小时和12小时角蛋白细胞中增加。热解素方法的一个优点是能够进行现场选择性分析。例如，在目前的研究中，NGF和IL-6的产量增加来自角膜细胞，因为皮肤细胞被排除在检测之外。此方法允许深入了解主要差异终端33的位置和中介类型。此外，这种方法可以更好地了解神经特罗芬生产的时间过程，以及吸收和运输在炎症34，35期间的主要病原体。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
这项研究的资金由国家卫生研究院NIH-AR047410（KEM）提供
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
References
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