评估主要神经再生爪胚胎使用免疫染色

该实验的总体目标是允许在发育中的非洲爪蟾胚胎大脑中快速方便地可视化不同的神经元细胞群。这些方法可以帮助回答原代神经发生领域的关键问题，例如观察非洲爪蟾中枢神经系统神经元分化的调节过程。该技术的主要优点是它允许在单个实验中同时观察神经干细胞祖细胞库以及差异化的初级神经池。

要开始此过程，请使用塑料或玻璃移液管小心地从玻璃瓶中吸出 5 到 10 个胚胎，而不会引入气泡。将胚胎转移到安装室中，并在立体镜下观察。用明胶溶液填充安装室，以确保截面块的刚性。

接下来，使用一对细尖镊子将胚胎并排排列。通过使用低温兼容标记在腔室边缘绘制箭头来标记头部方向。对于多组胚胎，在相应腔室的边缘写下每组的描述。

然后，小心地将腔室水平放入一个装满干冰的泡沫盒中。盖上盖子，让封固室一次冻结一个 5 到 10 分钟。之后，继续冷冻切片或将冷冻样品在 80 摄氏度下保存至少一到两周，而不会失去免疫原性。

在此过程中，使用钝棒或手指按压腔室底部，从腔室中取出冷冻的样品块。然后，在样品固定盘上加入几滴组织冷冻培养基。安装样品块时，胚胎的前端朝上，让安装好的样品块在低温恒温器室内放置约一分钟，或直到组织冷冻培养基变得不透明。

立即将样品固定盘安装到切片机上，使样品块的底部朝上。当样品块仍然相对较软时，使用刀片修剪掉样品块的一部分。然后，将样品固定盘放在切片机上至少 5 分钟，使其温度达到平衡。

之后，逐渐向下修剪样品块，直到通过半透明明胶可以看到蝌蚪的头部。要提高修剪速度，请增加截面厚度。监测低温恒温器的性能，例如叶片的锋利度和角度，以确保后续切片以长条状生成。

一旦看到蝌蚪头，将低温恒温器的设置调整回正常状态，以确保完成的切片可以形成条状，并且不会重叠或粘在刀片上。然后，继续修剪，直到蝌蚪的头部几乎露出来。在开始收集样本部分之前，刷掉舞台上的所有残余部分。

制作大约 10 到 15 个部分，让它们形成一条长条。将厚盖玻璃板翻转到一边，然后用细尖画笔轻轻地从刀片上取下条带。接下来，将其安排在载物台上，长轴与刀片平行。

制作 10 到 15 个部分，让它们形成一条长条而不断裂。这可能并不容易，需要练习。一个技巧是尽量不要在手轮上应用太高的速度。

相反，请小心而缓慢地旋转手轮。之后，在室温下挑选一张带正电荷的载玻片，并用铅笔标记。然后，将其快速而牢固地压在条带上，贴标面朝下。

随后，从低温恒温器室中取出载玻片。重复此步骤，在每张玻片上平行排列 20 到 30 个切片。将侧面风干 10 分钟，然后立即进行免疫染色程序，或将玻片存放在 80 摄氏度的载玻片盒中长达 3 到 6 个月，然后再进行免疫染色程序。

在这里，我们可以看到非洲爪蟾的前脑、中脑、后脑和脊髓的相应截面平面，这将用于为下面的图像提供位置参考。用抗 Sox 3、抗乙酰化微管蛋白和 DAPI 染色的相应横截面显示了神经干细胞池以及神经管内神经丝的相对位置。以下是用 Anti-MyT1 和 DAPI 染色的相应横截面，它们显示了神经管内分化的原代神经元的相对位置。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住确保样品块在干冰中有足够的冷却时间。否则，样品块可能不够硬，因此难以切割。

开发后，这项技术为发育神经科学领域的研究人员探索非洲爪蟾中枢神经系统的神经分化铺平了道路。看完这个视频后，你应该对如何制作切片有很好的了解，并观察非洲爪蟾中枢神经系统中的特定神经元细胞池。