Name: 评估主要神经再生爪胚胎使用免疫染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 了解使用免疫荧光染色在Xenopus胚胎中可视化不同神经元细胞群体的快速方法。该技术可在单次实验中同时观察神经干细胞前体池和分化神经元，为发育神经科学研究提供可靠工具。

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我们感谢科罗拉多大学博尔德分校的 Michael Klymkowsky 教授和曼彻斯特大学的 Nancy Papalopulu 教授分别慷慨提供抗 Sox3 和抗 Myt1 抗体。我们感谢 Papalopulu 实验室成员在本实验方案开发过程中提出的富有见地的建议。本工作得到了 Healing Foundation 提供给 SZ 和 JL 的两项博士生奖学金、Healing Foundation 分别提供给 SZ/EA 和 JL/EA 的两项项目资助、Wellcome Trust 提供给 EA 的一项项目资助（WT082450MA），以及 Wellcome Trust 的一项机构战略支持资助 [097820/Z/11/Z] 的支持。

所有动物实验均获得曼彻斯特大学动物福利中心批准，并由英国政府内政部项目许可证涵盖。
1. 样本采集与固定 非洲爪蟾 胚胎
<ol>
	<li>准备实验所需的试剂和材料。
	<ol>
		<li>通过将 56.5 g NaCl 溶解于约 800 ml 超纯水中，并加入 1 M KCl、1 M MgSO4、1 M CaCl2 和 1 M HEPES（pH 7.4）的储备液，配制 10x Marc's Modified Ringers (MMR) 溶液，使终浓度为 20 mM KCl、10 mM MgSO4、20 mM CaCl2、50 mM HEPES。用 10 M NaOH 调节 pH 至 7.4，然后定容至 1 L。</li>
		<li>将 10x MMR 溶液在液体循环条件下于 121 °C 高压灭菌 20 分钟。使用时，用 ddH2O 稀释至 0.1x 终浓度，并添加 20 mg/L 的庆大霉素以抑制微生物生长。</li>
		<li>通过混合 24 g Tris-HCl、5.6 g Tris 碱和 88 g NaCl，并溶于约 900 ml 超纯水中，配制 10x TBS 溶液。最终溶液的 pH 值约为 7.6。用 10 M NaOH 或浓 HCl 调节至终 pH 7.6，并定容至 1 L。</li>
		<li>使用时，将 1 份 10x TBS 溶液与 9 份超纯水混合，配制成 1x TBS。</li>
		<li>通过将 209.2 g MOPS 溶解于约 800 ml 超纯水中，并加入 0.5 M EGTA 和 1 M MgSO4 储备液，使终浓度为 20 mM EGTA 和 10 mM MgSO4，配制 10x MEM 盐溶液。用 10 M NaOH 调节 pH 至 7.4，然后定容至 1 L。</li>
		<li>将 MEM 盐溶液在液体循环条件下于 121 °C 高压灭菌 20 分钟（该溶液在室温下储存数月或高压灭菌后可能变为黄色，但颜色变化不影响其使用）。然而，长期储存（超过 6 个月）后请勿使用。</li>
		<li>通过将 1 份 MEM 盐溶液、1 份 37% 甲醛与 8 份超纯水混合（v/v），配制 1x MEMFA 溶液（在 4 °C 下稳定至少 1–2 周）。</li>
		<li>通过将 4 g 多聚甲醛粉末溶于 100 ml 1x TBS 溶液中，配制含 4% 多聚甲醛的 TBS 溶液（用于后续涉及鬼笔环肽的染色）。将溶液加热至 60 °C，并加入几滴 10 M NaOH 以助溶解。分装为 5–10 ml 体积，于 -20 °C 冻存。解冻后请勿再次冷冻。 
		注意：多聚甲醛粉末具有刺激性，吸入后有毒，因此称量步骤应在通风橱中进行。</li>
		<li>在样品收集前，预先标记多个 4 ml 带螺口盖的玻璃小瓶。</li>
		<li>将 20 ml 40% 鱼明胶（预先在 50 °C 水浴中预热）倒入 50 ml 离心管中，加入 8 g 蔗糖，并用 1x TBS 定容至 50 ml，配制 15% 明胶/15% 蔗糖溶液。</li>
		<li>将明胶管置于旋转混合器或滚轴混合器上，室温混合过夜。该明胶溶液在 4 °C 下可稳定保存 1 周。请勿使用过期溶液，且避免冻融。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养并固定至目标发育阶段的 X. laevis 或 X. tropicalis 胚胎。
	<ol>
		<li>将受精的 X. laevis 或 X. tropicalis 胚胎在含庆大霉素的 0.1x MMR 中培养至目标发育阶段。 
		注意：通常在发育阶段 23 至 40 之间收集胚胎。阶段 40 之后收集胚胎也是可行的，尤其是在观察脊髓轴突生长时，但需注意可能需要更长的明胶渗透时间。胚胎可以是野生型、转基因型、突变型、抑制剂处理型、吗啉代（MO）注射型或电穿孔型23,24。</li>
		<li>将每 20–50 个胚胎收集至一个 4 ml 玻璃小瓶中，尽可能去除培养基，并替换为 MEMFA。 
		注意：若后续染色涉及鬼笔环肽，请使用 4% 多聚甲醛代替 MEMFA，因为市售甲醛溶液通常含有高达 10% 的甲醇作为稳定剂，会干扰鬼笔环肽染色。</li>
		<li>在 4 °C 下固定过夜，或在紧急情况下于室温下在旋转混合器上固定 2 小时。固定后的胚胎在 4 °C 下可在固定液中稳定保存至少 1 周。</li>
		<li>固定后，用含 0.05% Triton X-100 的 1x TBS 溶液洗涤胚胎 3 次，每次 20 分钟。最后一次洗涤后，尽可能去除 TBS-Triton 溶液，并向每个小瓶中加入 3 ml 15% 明胶/15% 蔗糖溶液。</li>
		<li>将小瓶置于滚轴混合器上，室温过夜。对于发育阶段晚于 40 的胚胎，渗透时间应至少为 24 小时。渗透完成后，次日立即进行 2.2 节的操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Xenopus 胚胎的包埋与冷冻切片
<ol>
	<li>准备实验试剂和材料。
	<ol>
		<li>取一盒带正电荷的载玻片，最好为未开封的。 
		注意：若已开封，请将载玻片保存在干燥环境（如干燥箱）中，并在1个月内使用，以确保载玻片表面的静电荷得以维持。切勿使用过期载玻片，否则样本在免疫染色过程中会脱落。</li>
		<li>将冷冻切片机腔室预冷至 -30 °C。设置仪器参数：切片机温度为 -35 °C，切片厚度为 12 µm。将厚玻璃盖板安装到载物台上，并在开始切片前让冷冻切片机至少平衡30分钟。</li>
		<li>准备用于移动切片条的画笔，并将其置于冷冻切片机腔室内。</li>
		<li>准备用于在载玻片上书写的铅笔，并将其置于室温下。</li>
		<li>进行冷冻切片时需佩戴手套，禁止徒手操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定 Xenopus 胚胎
	<ol>
		<li>使用塑料或玻璃移液管小心吸取5–10个胚胎，避免引入气泡。将胚胎转移至包埋腔室中，并在体视显微镜下观察。向包埋腔室中注满明胶溶液，以确保切片块的刚性。</li>
		<li>使用精细尖头镊子按照 图1 排列胚胎。使用耐低温标记笔在腔室边缘画箭头标记头部方向。对于多组胚胎，还需在对应腔室边缘标注每组的描述信息。</li>
		<li>将腔室水平小心放入半满干冰的泡沫盒中，并盖上盖子。观察包埋腔室在5–10分钟内冻结。应依次处理每个腔室（即 在处理下一个腔室前，先将前一个腔室置于干冰上），以便为每个腔室提供充足的冻结时间，并防止干冰盒过于拥挤。 
		注意：冻结后的包埋腔室无需保持水平放置，可在盒内堆叠存放。</li>
		<li>可立即进行冷冻切片，或如需保存，将冷冻样本在 -80 °C 下储存至少1–2周，免疫原性不会丧失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定后 Xenopus 胚胎的冷冻切片
	<ol>
		<li>使用钝棒（如铅笔）按压包埋腔室底部，将冻结的样本块从腔室中取出。</li>
		<li>在样本托盘上滴加数滴组织冷冻介质（含聚乙二醇和聚乙烯醇的介质），将样本块固定于托盘上，确保胚胎前端朝上（图2）。将固定好的样本块在冷冻切片机腔室内静置约1分钟，或直至冷冻介质变为不透明。</li>
		<li>立即将样本托盘安装到切片机上，使样本块底部朝上。当样本块仍相对&#34;柔软&#34;时，使用刀片修切部分样本块，以缩短每条切片的长度（如需要）。将样本托盘留在切片机上至少5分钟，使其温度达到平衡。</li>
		<li>逐步修切样本块，直至通过半透明的明胶可见蝌蚪头部。为加快修切速度，此阶段可采用较高的切片厚度设置（例如 20–25 µm）（如启用&#34;修块&#34;模式），但不宜过厚，以免样本块从托盘上脱落。同时观察冷冻切片机的运行状态，如刀片锋利度和角度，以确保后续切片能形成连续长条。</li>
		<li>一旦蝌蚪头部可见，将冷冻切片机参数调回正常设置（例如 10–12 µm），并用画笔清洁切片机和载物台。使用手动轮设置（勿用电动模式）轻轻切出2–3片作为试切，确保最终切片能形成条带，不重叠且不粘附于刀片。</li>
		<li>继续修切，直至蝌蚪头部几乎暴露（此步骤可能需要一定经验，但可实现）。用画笔清除载物台上残留的切片，开始收集样本切片。</li>
		<li>连续切出约10–15片，使其形成一条长带。</li>
		<li>将厚玻璃盖板翻转至一侧，用精细画笔轻轻将切片条从刀片上取下，并将其排列在载物台上，长轴与刀片平行。</li>
		<li>取一张室温下的带正电荷载玻片，用铅笔标记（该标记在后续染色处理中不会被洗脱），将标记面朝下迅速而牢固地压在切片条上，然后将载玻片从冷冻切片机腔室中取出。若操作正确，切片条应立即粘附于带正电荷的载玻片上（图3A）。</li>
		<li>重复此步骤，使每张载玻片上载有20–30片切片，并平行排列（图3B）。此数量足以覆盖 X. tropicalis 胚胎的整个脑区，以及 X. laevis 胚胎的大部分前脑和中脑区域。</li>
		<li>将载玻片在空气中干燥10分钟，可立即进行后续实验，或将其存放在载玻片盒中，于 -80 °C 保存至少3–6个月，免疫原性不会丧失。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分段的Xenopus胚胎免疫染色
<ol>
	<li>准备实验所需的试剂和材料。
	<ol>
		<li>通过将Triton X-100加入1x TBS中，配制终浓度为0.05%的TBS-Triton X-100溶液。该溶液在室温下可稳定保存3-4天。请勿使用过期溶液。</li>
		<li>使用TBST配制5%热灭活山羊血清或5% BSA作为封闭缓冲液。首先，将约20-30 ml血清置于65 °C水浴中加热30-60分钟以实现热灭活。分装至1.5 ml离心管中，并于-20 °C冷冻保存。使用时无需再次灭活。</li>
		<li>使用前，用TBST将热灭活的血清或BSA稀释至终浓度为5%。</li>
		<li>根据推荐稀释比例，在封闭缓冲液中配制适当的一抗（例如 1:500 anti-Sox3 10,25/1:250 anti-Myt1 26/抗乙酰化微管蛋白）。每张切片使用约100 µl抗体溶液。</li>
		<li>在封闭缓冲液中配制适当的荧光二抗（例如 抗小鼠/兔红色荧光染料偶联抗体），通常稀释比例为1:500。</li>
		<li>（可选）将红色荧光染料偶联的Phalloidin（1:500）加入二抗混合液中，以显示肌动蛋白网络。</li>
		<li>（可选）将DAPI（终浓度0.5 µg/ml）加入二抗混合液中，用于观察细胞核定位。</li>
		<li>从冷冻环境中取出抗荧光淬灭封片剂，并在室温水浴中解冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫染色
	<ol>
		<li>从-80 °C取出冷冻切片，置于通风橱内的纸巾上至少1小时，以去除任何冷凝水滴。随后将干燥的切片正面朝上放置于85-90 °C加热块上烘烤15分钟，以激活粘附机制。最后让切片冷却至室温（至少10分钟）。</li>
		<li>将纯丙酮倒入染色缸中，将切片浸入丙酮中10分钟以去除鱼明胶。若处理多张切片，可将其置于染色架上。处理后的切片在通风橱中空气干燥15分钟。请勿重复使用丙酮。</li>
		<li>使用PAP笔在切片样本周围小心画圈，避免接触样本。确保画出的圈完全闭合，否则染色过程中抗体溶液会外溢。待PAP笔画的圈完全干燥。</li>
		<li>另取一个染色缸，加入不含Triton X-100的1x TBS。将干燥后的切片插入染色缸中，充分再水化至少1小时。同时，使用含0.05% Triton X-100的1x TBS将热灭活山羊血清或BSA稀释至终浓度5%，配制封闭缓冲液。</li>
		<li>将1-2个6孔板放入密封饭盒中，并在孔内加入一半体积的超纯水，制成湿盒。从染色缸中取出再水化后的切片，水平放置于6孔板上（不加盖板盖）。</li>
		<li>小心地在PAP圈内加入300-600 µl封闭缓冲液。密封湿盒并置于室温孵育至少1小时。</li>
		<li>在封闭缓冲液中稀释适当的一抗。通常每张切片使用100-150 µl稀释后的抗体溶液。若同时处理多张切片，应按比例增加总体积。</li>
		<li>封闭结束后，小心吸去切片上的封闭液，并迅速加入一抗溶液以防止切片干燥，然后密封湿盒并在4 °C孵育过夜。</li>
		<li>次日，吸去切片上的一抗溶液。将切片插入含有含0.05% Triton X-100的1x TBS的染色缸中，洗涤3次，每次15分钟。同时，在封闭缓冲液中稀释适当的荧光二抗（可选择性加入DAPI或Phalloidin）。</li>
		<li>小心地在每张切片上加入100-150 µl二抗溶液。将切片放回湿盒中并密封盖子，在室温下孵育1-2小时。</li>
		<li>将切片在含有含0.05% Triton X-100的1x TBS的染色缸中洗涤3次，每次15分钟。最后一次洗涤时，若封片剂储存在-20 °C，则将其置于50 °C水浴中解冻10分钟，并在使用前冷却至室温。</li>
		<li>在切片上滴加约20 µl（一滴）封片剂，并覆盖大片盖玻片（至少22 mm × 64 mm）。封片后6小时内使用荧光或共聚焦显微镜观察。
		<ol>
			<li>若当天无法完成成像，可用指甲油密封切片边缘，并将其置于4 °C湿盒中过夜。 
			注：抗荧光淬灭封片剂在数天后会逐渐氧化（变为棕褐色），因此建议尽快完成图像采集。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li>
<li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+steps+in+the+development+of+the+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Early steps in the development of the forebrain.</a> Dev Cell. 6, 167-181 (2004).</li>
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<li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+activin+receptor+signaling+promotes+neuralization+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus.</a> Cell. 77, 273-281 (1994).</li>
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<li>Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+Sox3+gene+expressed+in+oocytes+of+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages.</a> Gene. 188, 101-107 (1997).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文展示了一种便捷高效的方法，用于可视化非洲爪蟾（Xenopus）胚胎中的原发性神经发生过程。该方法可利用细胞类型特异性标记物，对不同类型的神经细胞进行评估，包括神经干细胞和已分化的初级神经元。
该方案通常具有很高的稳健性，且可重复性极强。对于处于孵化前阶段的胚胎（即 在发育至28期之前，我们建议在固定前手动去除卵黄膜，以便胚胎在固定前充分伸展。这一点在收集较早期胚胎（孵化前）时尤为重要，因为弯曲的胚胎极难在封片腔室内调整至理想的方向。我们未观察到经MEMFA或PFA固定后出现免疫原性丧失的情况，因此本方案无需额外进行抗原修复步骤。此外，该免疫染色程序也可用于已完成显色/荧光原位杂交的样品。在此情况下，建议在原位杂交流程中省略蛋白酶K处理步骤。完成显色/荧光底物反应后，样品可用TBS洗涤，并以与MEMFA/PFA固定样品相同的方式包埋于鱼明胶溶液中。若后续需同时进行荧光原位杂交与免疫荧光染色的成像，可将样品管用铝箔包裹以避光保存。
在某些情况下，胚胎在明胶渗透后可能会过度收缩。这很可能是由于固定不充分或TBS-吐温提取不充分所致。请确保胚胎在PFA/MEMFA中于4 °C固定至少2-3小时，或最好过夜。如果问题仍然存在，将TBS-吐温的洗涤时间延长至每次1小时，共洗涤3次。
在冷冻切片过程中，由于不同批次的鱼明胶特性不同，样品块的硬度可能会有所变化。通过调节切片机的温度可在一定程度上补偿这一问题。较低的温度将导致样品块变硬 &#34;更难&#34; 样品块在过低温度下会变脆，难以切片。在对特别珍贵的样品进行切片前，可先进行一些微调或练习（使用不含胚胎的模拟样品块），以获得更好的切片效果。
切片过程中常见的问题是，薄切片有时会粘附在厚玻璃板上，而不是平整地停留在金属载片台上。这种情况尤其令人困扰，因为它会不断中断连续切片过程。此类问题通常由以下两个原因引起：切片室（尤其是厚玻璃板）温度不够低，或机器及操作者身上存在过多静电，这种情况在干燥天气尤为明显。前者可通过降低切片室温度，并将玻璃板在其中放置更长时间（可能过夜）来解决；后者则可通过正确接地冷冻切片机来缓解。将冷冻切片机的金属表面连接至金属水龙头或类似的金属水管系统，也可作为释放静电的替代方法。每次使用后，厚玻璃板应使用非腐蚀性清洁剂（如洗洁精）彻底清洗，再用超纯水冲洗，喷洒纯乙醇，最后用纸巾包裹，以保护其表面和边缘免受损伤。
方案中列出的抗体通常具有特异性，我们很少遇到非特异性吸附或高背景信号。需要注意的是，如果使用热灭活的山羊/羔羊血清作为封闭剂，应避免过度热灭活（表现为血清中形成絮状沉淀），因为这种沉淀物对二抗具有很强的吸附性，可能导致背景信号升高。
同时进行双重染色以可视化不同类型的神经元细胞群体是可行的，有时也是必要的。使用以下组合通常可以实现良好的双重染色效果：Sox3/N-tub 或 Myt1/N-tub。然而，由于 Sox3 和 Myt1 两种抗体均来源于兔，因此对这两种蛋白进行双重染色较为困难。我们测试了多种抗体直接标记试剂盒，但均未获得满意的结果（信噪比较低），这可能是由于缺乏二抗带来的信号放大效应所致。一种可能的解决方案是如后文所述，在Xenopus中建立转基因品系。
该方案的主要局限性之一在于，尽管其能够充分区分两类主要的神经元细胞群，即Sox3表达的神经干细胞群和Myt1表达的已分化神经元群，但无法揭示已分化神经元中的不同亚群。这些亚群包括但不限于初级运动神经元、中间神经元和感觉神经元，通常以其差异表达的标志基因作为特征 28-30如上所述，近年来在多色技术开发方面取得了新进展 原位 杂交结合基于抗体的免疫荧光检测方法 非洲爪蟾 胚胎可能填补这一空白，揭示这些已分化神经元的亚群，以便进行潜在的研究 31. 或者，正如在小鼠模型中已证明的那样，也可制备一组更全面的细胞类型特异性抗体，以区分这些不同的细胞群体 非洲爪蟾.
值得一提的是，作为本方法的补充，近年来光学成像和图像分析技术的进展，例如多光子显微镜、三维重建和图像分割，也可在初步评估后加以应用，以实现对活体状态下的Xenopus卵母细胞以及早期胚胎更为全面的观察32,33。因此，为了在活体动物中追踪神经细胞的增殖、分化和迁移，有必要建立一种或多种转基因品系，使其携带由细胞类型特异性启动子驱动的荧光蛋白，从而实现对早期Xenopus胚胎中特定细胞群体的活体观察。已有研究成功建立了以神经特异性β-微管蛋白启动子驱动tauGFP的X. laevis品系，并展示了其应用价值，为该领域提供了良好范例23,34。鉴于脊椎动物中sox3和myt1基因的完整启动子序列已被鉴定35-37，在Xenopus中建立更多此类转基因品系应相对容易，这将极大地促进Xenopus研究领域以及初级神经发生这一更广泛领域的研究进展。

在脊椎动物中，中枢神经系统的发育包含若干个独特但连续的阶段。第一个阶段是神经诱导，即未分化的外胚层细胞被指定为神经命运而非表皮命运。在此阶段，Xenopus 及其他模式系统中涉及多个相互关联的调控机制1,2。该过程主要由下层中胚层分泌的因子协调，例如chordin、noggin和follistatin3-7。神经诱导之后，一部分神经前体细胞退出细胞周期，并开始分化，这一过程称为初级神经发生。并非所有神经前体细胞都在此时分化。剩余的神经前体细胞继续增殖，从而维持中枢神经系统在整个发育过程乃至成体阶段持续生长所需的干细胞库。
这些增殖的神经前体细胞的特征在于表达 SRY（性别决定区Y）-box 3 (sox3) 基因 8-11另一群细胞则退出细胞周期并走向分化命运，可通过分化基因标记物的表达来识别， 微管蛋白，β2B 类 IIb (tubb2bN-tub）和 髓鞘转录因子1 (myt1) 12-14这些分化出的神经元细胞最终会形成不同类别的神经元，包括但不限于位于神经管内不同区域的运动神经元、中间神经元和感觉神经元。 15-17.
尽管已有大量研究致力于揭示调控前部神经外胚层模式形成及命运决定事件的分子机制，但对于初始模式建立之后发生的神经发生事件，关注则相对较少。事实上，信号转导、转录调控以及翻译后修饰等多种机制均参与了这一后续阶段，共同调控神经发生过程中的时间进程和细胞谱系特化18-20。对这些机制的进一步研究需要一种可靠的方法，以便直观地观察并区分不同类型的神经元细胞群体。上述提及的神经标志物，如 Sox3、Myt1 和 N-tub，可为识别这些不同的细胞群体提供手段，从而为揭示神经元分化的潜在机制奠定必要的基础21-23。
尽管在其他模式生物中已实现神经元细胞群体的差异标记，但在此方面对Xenopus系统进行充分开发的研究仍相对较少。这主要是由于缺乏足够可靠且能特异性识别神经管中各类神经元细胞群体的兼容性抗体。本文介绍一种通过免疫染色技术对早期Xenopus胚胎中神经元分化进行可视化的方法，为研究Xenopus的初级神经发生提供了一种可靠且便捷的技术途径。本实验方案可为关注Xenopus中枢神经系统在发育第26至第45阶段早期发育过程的研究人员提供充分的操作指导。

<table><tbody><tr><td>庆大霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>冷水鱼皮明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>一次性基模 15 mm × 15 mm × 5 mm Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-015A</td><td></td></tr><tr><td>一次性基模 7 mm × 7 mm × 5 mm Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-010K</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 载玻片</td><td>ThermoFisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>组织冷冻介质（OCT）</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;85–90 &amp;deg;C 恒温加热块</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP笔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>丙酮，分析纯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带玻片架的染色缸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>合适尺寸的按扣式食品盒（可容纳1–2个6孔板）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗乙酰化微管蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠IgG（H+L）F(ab')2&amp;nbsp;片段（Alexa Fluor&amp;reg;&amp;nbsp;488 标记）</td><td>Cell Signaling</td><td>4408</td><td></td></tr><tr><td>抗兔IgG（H+L）F(ab')2&amp;nbsp;片段（Alexa Fluor&amp;reg;&amp;nbsp;555 标记）</td><td>Cell Signaling</td><td>4413</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 647 鬼笔环肽</td><td>Cell Signaling</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

评估初级神经发生 非洲爪蟾 使用免疫染色法的胚胎研究

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

原发性神经发生是胚胎发育过程中一个动态而复杂的过程，它建立了中枢神经系统的初始结构。在此过程中，一部分神经干细胞经历分化，产生位于新生中枢神经系统内的首批分化初级神经元。已有多种脊椎动物模式生物被用于探索神经细胞命运决定、模式形成及分化的机制。其中，非洲爪蟾（Xenopus）因其发育迅速、易于操作，并且便于进行胚胎学和分子水平的实验干预，成为研究原发性神经发生所涉及的分子与细胞机制的有力模型系统。本文介绍一种简便快速的方法，用于观察 Xenopus 中枢神经系统内不同类型的神经细胞群体。通过对 Xenopus 胚胎切片进行抗体染色和免疫荧光检测，我们能够定位原发性神经发生过程中神经干细胞和已分化的初级神经元的空间分布。

代表性结果展示了不同层面的30期Xenopus胚胎横截面，包括前脑、中脑、后脑和脊髓，并使用了不同的抗体进行染色（图4）。如前所述，Sox3标记的神经祖细胞群位于神经管管腔附近，而MyT1标记的已分化初级神经元则向外迁移，定位于神经管的边缘层（基底层）附近。抗乙酰化微管蛋白抗体可标记已分化神经元中的轴突，这些轴突可在整个神经管内观察到。
位点特异性基因敲低或过表达是神经生物学中广泛使用的一种方法，用于评估调控特定基因的表达是否会影响神经元细胞的生长与分化。在此类实验中，可将吗啉代寡核苷酸（Morpholinos, MOs）或携带启动子驱动基因的DNA载体注射到两细胞期胚胎的其中一个卵裂球中23。另一种方法是将其注射至脑室后进行电穿孔，从而实现目标基因的敲低或过表达27。在这两种情况下，处理效应均局限于胚胎的一侧，而对侧则可作为未经处理的内部对照。
固定、切片和免疫染色后，通过计数并比较胚胎两侧不同细胞群体的细胞数量，来量化基因敲低/过表达的影响。通过积累多个胚胎的数据，可进行统计分析。在本研究的代表性结果中，胚胎未进行任何干扰处理。有关基因干扰及其对不同神经元细胞群体影响的示例，可参见参考文献20,23。
<img alt="色谱过程示意图与实验，溶剂体系中的样品加载，顶空分析。" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：包埋模具中胚胎的排列与方向。（A）示意图显示包埋装置的组装方式，注意托盘上已标记日期、发育阶段以及胚胎的方向。（B）包埋装置实际外观的照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="磁悬浮概念；超导圆盘示意图及使用液氮的演示。" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：明胶块在样品托盘上的方向与位置。（A）示意图展示包埋块的组装方式，注意胚胎呈“头部朝上”位置，明胶块通过底部的组织冷冻介质牢固地固定在样品托盘上（见图 2B）。（B）显示包埋块组装实际外观的图像，注意明胶块与样品托盘之间有组织冷冻介质积聚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微流控装置组装；示意图；组件对齐，展示倒置按压过程。" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3：连续切片。（A）切片室模型。样品承载盘应旋转并固定，使胚胎面朝上。在完成数次（6–10次）切片后，用细刷轻轻将连续切片条从刀片（蓝色）上分离，然后在承载板上旋转90°。随后，将一张室温的带正电荷载玻片牢固地倒置按压在切片条上，并立即提起，以收集完成的切片条。（B）通常，每张载玻片可容纳两排平行的切片条，如图所示。请务必用铅笔在载玻片标签上详细记录。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑区示意图、共聚焦显微镜结果；Sox3、乙酰化微管蛋白、MyT1、DAPI染色。" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4：30期X. laevis蝌蚪神经组织的横截面及染色结果，20倍放大。（A）示意图显示了在Xenopus蝌蚪上切面的相对位置（前脑、中脑、后脑和脊髓）。（B）相应横截面使用抗Sox3抗体（红色）、抗乙酰化微管蛋白抗体（绿色）和DAPI（蓝色）染色，显示神经干细胞群以及神经管内神经丝的相对位置。（C）相应横截面使用抗MyT1抗体（红色）和DAPI（蓝色）染色，显示神经管内已分化初级神经元的相对位置。比例尺 = 20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了一种利用切片免疫荧光染色技术快速、便捷地可视化Xenopus胚胎中枢神经系统中不同神经元细胞群体的方法。

初级神经发生是胚胎发育过程中一项动态而复杂的过程，它建立了中枢神经系统的初始结构。在……

本实验的总体目标是实现对发育中非洲爪蟾胚胎脑内不同神经元细胞群体的快速、便捷可视化观察。这些方法有助于回答初级神经发生领域的关键问题，例如观察非洲爪蟾中枢神经系统中神经元分化的调控过程。该技术的主要优势在于，可在单次实验中同时观察神经干细胞前体细胞群以及已分化的初级神经元细胞群。开始此操作时，使用塑料或玻璃移液管小心地从玻璃小瓶中吸取五到十个胚胎，注意避免引入气泡。将胚胎转移至包埋 chamber 中，并在体视显微镜下观察。用明胶溶液充满包埋 chamber，以确保切片块的刚性。接下来，使用一对精细镊子将胚胎并排排列。使用耐低温标记笔在腔室边缘画一个箭头，以标记头部方向。对于多组胚胎，将每组的描述信息写在相应腔室的边缘。然后，小心地将切片盒水平放置于一个装有半盒干冰的泡沫盒中。盖上盖子，使包埋盒逐个冷冻五到十分钟。之后，可立即进行冷冻切片，或将冷冻样本在-80摄氏度下保存至少一至两周，且不会丧失免疫原性。在此步骤中，使用钝棒或手指按压样本舱底部，将冷冻的样本块从舱内取出。然后，在样本承载盘上滴加数滴组织冷冻介质。将样本块安装在承载盘上，使胚胎的前端朝上，并将安装好的样本块置于冷冻切片机舱内约一分钟，或直至组织冷冻介质变为不透明状。立即将样品承载盘安装到切片机上，使样品块的底面朝上。在样品块仍相对较软时，使用刀片修切掉部分样品块。然后，将样品承载盘留在切片机上至少五分钟，使其温度达到平衡。随后，逐渐修整样品块，直至通过半透明的明胶能够看到蝌蚪的头部。为加快修整速度，可增加切片厚度。监测冰冻切片机的性能，例如刀片的锋利程度和角度，以确保后续切片能够连续成条生成。一旦蝌蚪头部可见，立即将切片机的设置调回正常状态，以确保完成的切片能够形成条带，而不会相互重叠或粘附在刀片上。然后继续修块，直至蝌蚪头部几乎完全暴露。在开始收集样本切片之前，用刷子清除载物台上残留的任何切片组织。制作约10至15个切片，使其连成一条长条状。将厚盖玻片翻转至一侧，用细尖画笔轻轻将切片条从刀片上取下。接着，将其放置于载物台上，使长轴与刀片平行。制作10到15个切片，使其连成一条完整的长条而不中断。这可能并不容易，需要练习。一个技巧是不要将手轮的速度调得过高。相反，应小心而缓慢地旋转手轮。随后，取一片室温下带正电荷的载玻片，并用铅笔进行标记。然后，将载玻片标记面朝下，迅速而牢固地压在条带上。随后，将切片从冷冻切片机腔室中取出。重复此步骤，使每张载玻片上平行放置20至30个切片。室温下晾干10分钟，然后立即进行免疫染色操作，或在免疫染色前将载玻片置于切片盒中，于-80摄氏度保存三至六个月。在此，我们可以看到非洲爪蟾蝌蚪前脑、中脑、后脑和脊髓的相应切面，这些切面将为后续图像提供位置参考。这些经 Anti-Sox 3、Anti-Acetylated Tubulin 和 DAPI 染色的相应横截面显示了神经干细胞池以及神经管内神经丝的相对位置。以下是经 Anti-MyT1 和 DAPI 染色的相应横截面，显示了神经管内已分化初级神经元的相对位置。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。在进行此操作时，务必要确保样品块在干冰中具有足够的冷却时间。否则，样品块可能不够坚硬，从而难以切片。该技术建立后，为发育神经科学领域的研究人员探索非洲爪蟾中枢神经系统中的神经分化奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备切片，并观察非洲爪蟾中枢神经系统中特定的神经元细胞群。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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评估初级神经发生非洲爪蟾使用免疫染色法的胚胎研究

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