评估初级神经发生 非洲爪蟾 使用免疫染色法的胚胎研究

本实验的总体目标是实现对发育中非洲爪蟾胚胎脑内不同神经元细胞群体的快速、便捷可视化观察。这些方法有助于回答初级神经发生领域的关键问题，例如观察非洲爪蟾中枢神经系统中神经元分化的调控过程。该技术的主要优势在于，可在单次实验中同时观察神经干细胞前体细胞群以及已分化的初级神经元细胞群。

开始此操作时，使用塑料或玻璃移液管小心地从玻璃小瓶中吸取五到十个胚胎，注意避免引入气泡。将胚胎转移至包埋腔中，并在体视显微镜下观察。用明胶溶液充满包埋腔，以确保切片块的刚性。

接下来，使用一对尖头镊子将胚胎并排排列。使用耐低温标记笔在腔室边缘画一个箭头，以标记头部方向。对于多组胚胎，将每组的描述信息写在相应腔室的边缘。

然后，小心地将切片盒水平放置于一个装有半盒干冰的泡沫盒中。盖上盖子，使包埋盒逐个冷冻五到十分钟。之后，可立即进行冷冻切片，或将冷冻样本在 -80 °C 下保存至少一至两周，且不会丧失免疫原性。

在此步骤中，使用钝棒或手指按压样本室底部，将冷冻的样本块从样本室中取出。然后，在样本固定盘上滴加数滴组织冷冻介质。将样本块安装在固定盘上，使胚胎的前端朝上，并将安装好的样本块置于冷冻切片机样本室中约一分钟，或直至组织冷冻介质变为不透明状。

立即将样品承载盘安装到切片机上，使样品块的底面朝上。在样品块仍相对较软时，使用刀片切去部分样品块。然后，将样品承载盘留在切片机上至少五分钟，使其温度达到平衡。

随后，逐渐修整样本块，直至通过半透明的明胶能够看到蝌蚪的头部。为加快修整速度，可增加切片厚度。监测冷冻切片机的性能，例如刀片的锋利程度和角度，以确保后续切片能连续成条生成。

一旦蝌蚪头部可见，立即将切片机的设置调回正常状态，以确保完成的切片能够形成条带，而不会相互重叠或粘附在刀片上。然后继续修块，直至蝌蚪头部几乎完全暴露。在开始收集样本切片之前，用刷子清除载物台上残留的任何切片组织。

制作大约10到15个切片，使其形成一条长条。将厚盖玻片翻转到一侧，用细头画笔轻轻将切片条从刀片上取下。接着，将其放置在载物台上，使长轴与刀片平行。

制作10到15个切片，使其形成一条长条而不中断。这可能并不容易，需要练习。一个技巧是不要将手轮的速度调得过高。

相反，应小心而缓慢地旋转手轮。之后，取一片室温下带正电荷的载玻片，并用铅笔进行标记。然后，将载玻片有标记的一面朝下，迅速而牢固地压在条带上。

随后，将切片从冷冻切片机舱室中取出。重复此步骤，使每张载玻片上平行放置 20 至 30 片切片。室温下晾干 10 分钟，然后立即进行免疫染色操作，或在免疫染色操作前将载玻片置于切片盒中，于 -80 摄氏度保存三至六个月。

在此，我们可以看到非洲爪蟾蝌蚪前脑、中脑、后脑和脊髓的相应切面，这些切面将为后续图像提供位置参考。相应的横截面使用了抗 Sox3 抗体、抗乙酰化微管蛋白抗体和 DAPI 染色，显示了神经干细胞池以及神经管内神经丝的相对位置。以下是使用抗 MyT1 抗体和 DAPI 染色的相应横截面，显示了神经管内已分化初级神经元的相对位置。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。在进行此操作时，重要的是要确保样品块在干冰中具有足够的冷却时间。否则，样品块可能不够坚硬，从而难以切片。

该技术建立后，为发育神经科学领域的研究人员探索非洲爪蟾中枢神经系统中的神经分化奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备切片，并观察非洲爪蟾中枢神经系统中特定的神经元细胞群。