Summary
Den etablerede model af transuretral kateterisation af mus giver mulighed for undersøgelse af blæren patologier, herunder urinvejsinfektion, men kan kun udføres i hunner. En ny model for mandlige transuretral instillation, præsenteres her, vil gøre forskning i et område præget af stærk kliniske og epidemiologiske forskelle mellem kønnene.
Abstract
Urinvejsinfektioner (UTI) er meget almindelige på verdensplan, at pådrage sig betydelig sygelighed og sundhedsvæsenet udgifter. Lille dyremodeller, som præcist afspejler sygdom etablering og progression, tillade dissektion af vært-patogen interaktioner og generation af immunitet over for infektion. I mus, intravesikal instillation af uropathogenic E. coli, det agens i mere end 85% af Fællesskabets erhvervede UTI, indeholder mange af stadier af infektion observeret i mennesker. Indtil for nylig, dog, kunne UTI kun være modelleret i hundyr. Denne begrænsning har hindret studiet af sex-relaterede forskelle i UTI, samt andre blære sygdomme, såsom kræft. Her, beskriver vi en metode til at indgyde mandlige mus, der giver mulighed for direkte sammenligning mellem kvindelige og mandlige dyr og giver en detaljeret protokol for at vurdere blæren væv ved flowcytometri som et middel til bedre at forstå vært svar til infektion. Sammen, vil disse tilgange støtte i identifikationen af vært faktorer, der bidrager til sex afvigelser observeret i UTI og andre blære-associerede sygdomme.
Introduction
Urinvejsinfektioner (ICU) er en af de mest almindelige infektioner i udviklede lande1. Smittespredningen er ens mellem hunner og hanner blandt nyfødte og for ældre2. Præmenopausale voksne kvinder, men har en stærkt øget forekomst af Samfundserhvervede UTI i forhold til mænd2,3. I betragtning af at denne sygdom påvirker primært kvinder, har grundforskning og klinisk forskning overvejende fokuseret på UTI i hunner. Urinvejsinfektion hos mænd er imidlertid en betydelig og forsømt sundhedspleje udfordring4. Faktisk, fordi UTI i mænd er forbundet med højere sygelighed, disse infektioner rutinemæssigt er defineret som kompliceret4,5.
Som vores forståelse af den centrale rolle, køn bias i fysiologi og patologi udvikler sig, er nye metoder forpligtet til at udforske denne tidligere forsømt aspekt af sygdommen. Sex forskelle spiller en væsentlig rolle i immunitet og infektion; Hunnerne har højere forekomst af autoimmune sygdom, mens mænd er mere modtagelige for visse infektioner, såsom tuberkulose, malaria og HIV6,7. Blærekræft, en anden urologiske patologi, er betydeligt hyppigere hos mænd end hos kvinder, og flere undersøgelser har vist en rolle for androgener i udviklingen af malignitet8,9,10,11 ,12. Navnlig, dog er undersøgelsen af intravesikal behandlingsformer for kræft i urinblæren udføres udelukkende i hundyr, på grund af manglende evne til at gentagne gange catheterize mandlige mus13.
Studiet af UTI patogenesen er stærkt afhængig af gnavere modeller af infektion (fx, mus og rotter). Murine modeller af UTI kan ansætte uropathogens oprindeligt isoleret fra infektioner hos mennesker, som uropathogenic E. coli (UPEC), Klebsiella, Enterococcus, Staphylococcuseller Proteus14. Typisk, bakterier føres ind i blæren via kateterisation af urinrøret. Efter infektion, blærer og nyrer kan fjernes for at vurdere specifikke parametre for infektion, såsom bakteriel kolonisering, vævsskader eller vært immunrespons15,16. Universelt, dog der kun hundyr bruges for UTI forskning. Faktisk, mange undersøgelser har bemærket, at på grund af anatomiske årsager, kateterisation af mandlige mus ikke er mulige13,17,18,19. For nylig, en kirurgisk tilgang til mandlige instillation er blevet beskrevet, i som maven er åbnet, blæren er eksternt fordrevne ved at anvende blide tryk åbningen i maven, og bakterier er sprøjtet ind i blæren20. Denne tilgang gør det muligt for mandlige infektion, på bekostning af kirurgisk indgreb. Således omfatter en større advarsel af denne tilgang betændelse, indflydelse på resultatet af infektion såsom potentiale til at fremkalde en anti-inflammatorisk sårheling svar til indsnit21. Som vores interesser omfatter forståelse køn bias som reaktion på sygdom, udviklet vi en metode til bakteriel intravesikal instillation i mandlige mus der mere svarer den veletablerede ikke-kirurgiske transuretral tilgang anvendes i kvindelige gnavere22 .
Vores model bygger på en etableret metode og giver mulighed for at direkte sammenligne vært immunrespons til UTI i kvindelig og mandlig dyr. Denne metode vil tillade dissektion af kønsrelaterede forskelle i infektion og potentielt tilbyde molekylære og cellulære spor til de markante forskelle i modtagelighed og reaktion på infektion mellem kønnene. Denne model har desuden værdi ud over UTI undersøgelser, giver mulighed for oprettelse af modeller til at undersøge andre blære-associerede sygdomme, såsom kræft i urinblæren, prostatitis, under - eller slut - aktiv blære syndrom og interstitiel cystitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Musen eksperimenter blev udført i overensstemmelse med godkendelsen af protokollen nummer 2012-0024 af Comité d'éthique da expérimentation animale Paris centrum et Sud (den etiske komité for dyreforsøg), i anvendelsen af det europæiske direktiv 2010/63 EU.
1. forberedelse af katetre
- Forberede en pediatric intravenøs adgang kanyle for hver gruppe af musene er inficeret. Ved hjælp af indbygget foråret mekanisme, afhænde hver kanylen af dens nål, som anvist af fabrikanten. Kassér nåle, bevare kun den plast intravenøs kanyle.
- Sterilisere katetre i en laminar flow hood for en ultraviolet (UV) cyklus, typisk 25-30 min.
Bemærk: Katetre kan bruges til mere end en mus, men et nyt kateter bør anvendes mellem eksperimentelle grupper, køn eller bakteriestammer.
2. forberedelse af Uropathogenic E. coli for infektion
- Mindst to dage før infektion, ved hjælp af en steril podning løkke, streak UPEC fra en frossen bakteriel bestand på en Luria bouillon (LB) agar plade, der indeholder antibiotika, hvis det er relevant. Der inkuberes ved 37 ° C natten over. Pladerne kan opbevares ved 4 ° C i op til en uge.
- I en 100 ml sterilt Erlenmeyerkolbe, podes 10 ml LB, der indeholder antibiotika eventuelt med en enkelt koloni fra LB-tallerkenen og inkuberes stående ved 37 ° C natten over (ca 16-18 timer).
Bemærk: Stående kulturer tillade udtryk af typen 1 pili, der er nødvendige for infektion23. Kulturer vokset ryster vil have mindre effektive pili udtryk, og derfor inkonsekvent priser af infektion. - Måle optisk densitet (OD)600 overnight kultur og beregne antallet af bakterier pr. ml ved hjælp af et forudbestemt vækstkurve. Som et eksempel, for UPEC stamme UTI89, OD600 = 0,35 er svarende til 2 x 108 CFU pr. ml, således en overnight kultur med en OD600 = 2,4 ville være svarende til 13,7 x 108 CFU pr. ml. empirisk bestemme forholdet mellem den OD600 og levedygtige bakterier med hver ny stamme ansat for infektion.
-
Bestemme mængden af bakterier nødvendigt ved betragtning af antallet af dyr til at være inficeret og at hver mus bør modtage ca 107 kolonidannende enheder (CFU) i 50 μl PBS. Inkludere i beregningen ~ 130 µl dødvolumen kateter og sprøjte kerne og 100 µl skulle bestemme inokulat.
- Spin den bakterielle suspension i en bordplade microcentrifuge ved 17.000 x g i 1 min og resuspenderes resulterende bakteriel på 2 x 108 CFU pr. ml i PBS. Seriefremstillede fortyndes en alikvot af denne suspension og plade på LB-agar, med antibiotika, hvis det er relevant, til at bestemme den nøjagtige inokulum for hver infektion.
- Trække den bakterielle inokulum ind i en 1 ml sprøjte og vedhæfte kateteret til slutningen af sprøjten. Tryk på sprøjte for at fjerne enhver luft og presse stemplet for at udfylde den døde luftrum i kateteret før du begynder instillation.
3. forberedelse af mus
- Bedøver mus via intraperitoneal injektion af 100 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin. Supplerende varme kan leveres.
- Sikre, at hver mus fuldt bedøvet ved at klemme footpad med medium tryk. Mus er fuldt bedøvet, når de ikke reagere og kræve 3-5 min. at nå denne tilstand.
- Placere mus liggende og anvende medium Tryk på den nedre del af maven til at tømme blæren af urin. Fuld blærer føles som en ært under huden mellem ileac kamme.
Bemærk: Inhalerede isofluran har været anvendt til catheterize hunmus15,22, men det er ikke blevet testet, om mandlige mus er tilstrækkeligt bedøvede af inhaleret isofluran for denne procedure.
4. transuretral Instillation af hunmus
- Brug af ikke-dominerende hånd, læg tommelfingeren på halen og en finger på den samme hånd på maven af musen og anvende blide tryk i modsatte retninger for at holde musen forsvarligt på plads.
-
Placer spidsen af kateteret vinkelret på musen på den urethrae åbning. Med blide tryk, skub kateteret ind i urinrøret, indtil hub møder den urethrae åbning, mens samtidig sænke sprøjten, således at det er parallel til den arbejdende overflade. Kateteret kræver ikke smøring. Ikke skubbe eller tvinge kateteret ind i urinrøret. Kateteret skal glide problemfrit og nemt ind i urinrøret, med lidt at ingen modstand.
- Før indgyde inokulum (trin 4.3), når er kateteret på plads, meget forsigtigt trække abdominal huden mod lederen af mus med finger fra den ikke-dominerende hånd der er allerede på maven af musen (trin 4.1). Hvis kateteret er i urinrøret, vævet komponere urinrøret blænde vil ikke flytte, hvorimod hvis kateteret er korrekt placeret i skeden, vævet vil bevæge sig op og væk fra kateteret. Denne hurtige test skal udføres på hver mus.
- Når hub af kateteret opfylder de urethrae åbning, langsomt undvære 50 µl af den bakterielle inokulum. En langsom instillation sats minimerer vesico-ureteral reflux i nyrerne. Langsomt fjerne kateter for at forhindre lækage, over en optælling af 5. Placere mus i deres bure i en liggende stilling.
5. transuretral Instillation af mandlige mus
- Placer to tommelfinger pincet cranially og caudally til musens ydre kønsorganer. Trække forhud for at fuldt udsætte glans penis. Når penis er eksternt placeret, frigive tommelfinger pincet.
- Flytte pincet til at stabilisere den fremspringende penis vinkelret på den animalsk, holde orglet forsigtigt men stramt. Visualisere den urethral meatus og omhyggeligt indføre kateteret ind i den lille åbning på spidsen af orglet. Forsigtigt vejledning kateteret ind i penis, mod selve musen, opretholde blid spændinger med pincet. Kateteret kræver ikke smøring. Tving ikke kateteret ind i penis; kateteret skal glide gnidningsløst ind i urinrøret, med angivelse af korrekte anbringelse.
- Når hub af kateteret opfylder spidsen af penis, meget langsomt undvære 50 µl af inokulum, samtidig opretholde placeringen af penis. Kvaliteten af instillation kan bemærkes på dette tidspunkt efter en forudbestemt instillation kvalitetsresultat, som vist i figur 2.
- Trække kateteret langsomt, over et antal på 5 til at forhindre udsivning af inokulat. Placere mus i deres bure i en liggende stilling. Dyr bør begynde at inddrive 30-45 min efter administration af narkose.
6. bestemmelse af CFU i inficeret organer
- Offer mus ved hjælp af godkendte på forud fastsatte tidspunkter, standardforskrifter (fx, cervikal dislokation eller kuldioxid overdosis). Fugte maven grundigt med 70% ethanol at minimere forurening af pels.
- Gøre et snit på tværs af den nederste tredjedel af musens maven på mindst 2 cm ved hjælp af saks og aseptisk fjerne blæren og andre ønskede organer, herunder men ikke begrænset til, nyrer, testiklerne, Sædblærer eller preputial kirtler, i 5 ml polypropylen snap hætten rør indeholdende 1 ml steril PBS. Holde alle prøver på is.
- Der homogeniseres organer med en håndholdt homogeniseringsapparat, indtil næsten ingen solid væv forbliver, ca 15-60 sekund afhængigt af orglet. Fedt omrystes ikke godt, og er let genkendeligt som skinnende beige-hvid væv. Kassér fedt forud for eller efter homogenisering. Vask af homogeniseringsapparat i ethanol efterfulgt af PBS mellem hver eksperimenterende eller orgel gruppe.
Bemærk: Brug typisk, håndholdte homogenizers eller perle mill homogenizers. Mens alle disse systemer har givet lignende resultater, som fastsættes ved direkte sammenligning af bakteriel CFU på 24 timer efter infektion, bør de optimale betingelser til at homogenisere værten væv samtidig bevare bakteriel levedygtighed fastlægges empirisk før udfører denne protokol rutinemæssigt. - Udføre serielle fortyndinger af homogeniseret orgel suspensioner. Plade fortyndinger på LB agar plader, der indeholder antibiotika, når det er hensigtsmæssigt, og der inkuberes natten over (~ 15 hr) ved 37 ° C. UPEC stammer har meget hurtige fordobling gange og som sådan pleje bør tages til ikke Inkuber agar plader for lang, fordi dette vil hindre muligheden for at tælle enkelte kolonier.
7. flow Cytometric analyse af blæren væv
- Forbered fordøjelsen buffer indeholdende collagenase på 34 enheder/mL og DNase på 100 µg/mL, i PBS. Holde på is. Forbered en 15 ml konisk rør pr. dyr skal analyseres og alikvot 1 ml fordøjelsen buffer pr tube.
- Offer mus ved hjælp af godkendte på forudbestemte timepoints, standardforskrifter (fx, cervikal dislokation eller kuldioxid overdosis). Fugte maven grundigt med 70% ethanol at minimere forurening af pels.
-
Gøre et snit på tværs af den nederste tredjedel af musens maven på mindst 2 cm ved hjælp af saks og fjerne hele blæren. Hakkekød godt med saks, skære blæren i 2-3 mm2 mellemstore stykker, typisk ca. 8 stykker.
- Tilføje en hakket blære pr. rør indeholdende fordøjelsen buffer. Ryste for at vaske hakket blæren væv i fordøjelsen buffer. Holde på is, indtil alle blærer er dissekeret og hakket.
- Inkuber hakket blærer i 60-75 min. ved 37 ° C, med kraftig omrystning med hånden for 5 s hver 15 min. Når vævet er en glasagtig gennemsigtige udseende, der ligner våde silkepapir, er fordøjelsen fuldført. Langvarig fordøjelse vil fjerne overflade proteiner fra de celler, der er nødvendige for identifikation og bør undgås.
- Inaktivere fordøjelse-enzymer ved tilsætning af 2-3 mL iskold flow flowcytometri buffer (PBS indeholdende 2% føtal bovint serum (FBS) og 0,2 mM EDTA) og blandes forsigtigt. Sted rør på is.
- At sikre en enkelt cellesuspension og fjerne enhver bindevæv passere en 100 µm filter placeret i en 15 mL konisk slange indholdet af røret. Tryk forsigtigt alle resterende væv gennem filteret med udgangen af en sprøjte stemplet. Vask filteret med en yderligere 2 mL flow flowcytometri buffer. Holde prøver på is.
- Vaske prøver ved centrifugering i 7 min. ved 200 x g, 4 ° C. Resuspend pellets i 100 µL flow flowcytometri buffer indeholdende Fc blok, fortyndes til 5 µg/mL og overførsel til en 96-brønd runde bundplade. Efter 10-15 min, tilføje 100 µL ønskede antistof cocktail til hver prøve. Inkuber prøver for 30-45 min, på is, beskyttet mod lys.
Bemærk: Fc blok er et reagens, der anvendes til at hindre bindingen af Fc del af antistoffer til celler, der udtrykker Fc-receptorer. Dens formål er at minimere uspecifik antistof bindende. Bestemmelse af antistoffer til at bruge vil være afhængig af den hypotese, der testes i eksperimentet og bør vælges med input fra litteraturen. I figur 3, hen til opmåle den total immun celle infiltration, var en anti-CD45 antistof ansat, der er en pan-immun celle protein. - Vaske prøver ved centrifugering i 7 min. ved 200 x g, 4 ° C. Resuspend celle pellets i 200 µL flow flowcytometri buffer og passerer en 40 µm celle si prøver på en 5 ml polystyren tube lige før erhvervelse på et flow Flowcytometret.
- Samle hele prøven på flow-Flowcytometret. En god fordøjelse vil give 200.000-400.000 celler, med 8.000-10.000 CD45+ immunceller fra naiv mus blærer, mens inficeret organer vil indeholde flere celler16 (figur 3).
Bemærk: Prøver forberedt til flow cytometric analyse kan ikke anvendes til at evaluere CFU. Det anbefales ikke at opdele blæren i to dele, som foreligger ingen beviser til at påvise, at UPEC kolonisering eller immun celle infiltration er ensartet i hele væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I udviklingen af denne protokol alderen kohorter af kvindelige og mandlige C57Bl/6 mus 6 til 8 uger, var indpodet og bakteriel byrde evalueret i blærer på tidspunkter, der spænder fra 1 time til 30 dage. Resultaterne fra disse studier er beskrevet andetsteds (Zychlinsky Scharff et al., ventende). Vi præsenterer her, repræsentative data fra 24 hr infektioner. Navnlig, var bakteriel byrde tilsvarende mellem mandlige og kvindelige mus på 24 timer efter infektionen (figur 1). Lidt variation i bakteriel byrde blev observeret inden for hver gruppe 24 timer efter infektionen, svarende til hvad er blevet rapporteret i hunmus15,16.
Hvis pleje er taget til tilstrækkeligt Tom blærer af urin før infektionen, observeret betydelige udslip af inokulat sjældent i hunmus. Men instillation til mandlige mus resulterede i betydelige mængder af bakteriel inokulum siver ud fra urinrøret, især under udvikling fase af denne protokol. For at afgøre, om tab af inokulum på tidspunktet for infektion påvirket kolonisering eller etablering af infektion, ansat vi et ratingsystem for hver instillation. Hver instillation blev scoret på en skala fra 1-5, med 1 er den mest optimale, og bakteriel kolonisering var fast besluttet på 24 timer efter infektionen (figur 2, box). Mens dette system var investigator afhængige, og derfor potentielt subjektive, den primære forfatter til denne undersøgelse fastlagt alle noder umiddelbart efter instillation, før evalueringen af bakteriel byrde i inficerede blærer. Ingen statistisk signifikant forskel fandtes blandt CFU hidrørende fra dyr med forskellige instillation scores, som vurderet af en ikke-parametrisk Kruskal-Wallis test sammenligne den gennemsnitlige rang af hver kolonne med den gennemsnitlige rang af hver anden kolonne (p = 0,17) og korrigere for flere sammenligninger ved hjælp af en Dunn testen. Fra denne analyse, kan det konkluderes, at suboptimal instillations (score > 3), hvilket resulterer i betydelige udslip af bakteriel inokulum under infektion, ikke signifikant indflydelse på bakteriel kolonisering på 24 hr (figur 2, graf). Især, med erfaring, hyppigheden af utætte i mandlige mus mindsket betydeligt.
Endelig, målet med at udvikle denne model var direkte sammenligne immunrespons til UPEC i kvindelig og mandlig dyr. At teste, om cellulære infiltration er ændret mellem kønnene i svar på UTI, antallet af CD45+ immunceller i naiv og inficerede kohorter af kvindelige og mandlige mus blev vurderet ved flowcytometri. Mens antallet af immunceller i naive dyr ikke var anderledes mellem kvindelige og mandlige mus (p = 0,95), der var en statistisk signifikant stigning i infiltrationen i blærer af inficerede hunmus (p = 0.0015) (Fig. 3A-B).
Figur 1: UPEC koloniserer kvindelige og mandlige blærer med samme effektivitet. 6 til 8 uger gamle kvindelige og mandlige C57Bl/6 mus blev indpodet med 107 CFU af UPEC. 24 timer efter infektionen, blærer var aseptisk fjernet for at optælle bakteriel byrde. Plot skildrer CFU/blære. Hver prik er en mouse, repræsentative eksperiment 5 vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kvaliteten af Instillation ikke korrelerer med bakteriel byrde på 24 timer efter infektionen. 6 til 8 uger gamle kvindelige og mandlige C57Bl/6 mus blev indpodet med 107 CFU af UPEC. Umiddelbart efter hver instillation tildelt en enkelt forsker et kvalitetsresultat instillation, som defineret af specifikke kriterier (boxed tekst). 24 timer efter infektionen, blærer var aseptisk fjernet for at optælle bakteriel byrde. Plot skildrer den tildelte kvalitet score versus CFU/blære. Hver prik er en mus, 5 poolede eksperimenter er vist. p = 0,17, Kruskal-Wallis test sammenligne den gennemsnitlige rang af hver kolonne med den gennemsnitlige rang af hver andre kolonne med post hoc Dunn testen for flere sammenligninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Immun celle Infiltration er steget i hunmus svar på UTI. 6 til 8 uger gamle kvindelige og mandlige C57Bl/6 mus blev indpodet eller ikke med 107 CFU af UPEC. Repræsentative dot parceller skildrer samlede blære celler med CD45+ immunceller låge i pink fra naiv eller inficerede mus. Grafen viser det absolutte antal CD45+ immunceller i blærer fra naiv eller 24 hr inficerede mus. Hver prik er en mus, 2 poolede eksperimenter er vist. p-værdierne bestemmes af Mann-Whitney test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transuretral instillation af mandlige mus tilbyder mange nye forskningsmuligheder i sex indflydelse på blæren mucosal disease, men også præsenterer flere udfordringer. Fremmest en begrænsning er, at instillation i første omgang kan vise sig for at være teknisk vanskeligt, hvilket resulterer i overdreven betændelse under kateter indsættelse. Forbedring af teknik kan opnås ved instillation af døde mus med en farvet løsning, såsom Evans blå farvestof. For at bekræfte at instillation er vellykket, blærer skal inspiceres visuelt og mængden af indpodet væske kan evalueres ved ekstraktion med en tuberkulin sprøjte. Vigtigheden af langsomme, blide bevægelser kan ikke overvurderes: der findes ingen modstand og ingen kraft bruges til at indsætte kateter, da dette vil resultere i overskydende betændelse og vævsskader. Når udført korrekt, vil kateteret glide ubesværet ind i urinrøret. Hvis modstand eller obstruktion er følte, er det bedst at fjerne kateteret og reattempt indsættelse.
Ved at sammenholde kvaliteten af instillation til bakteriel byrde 24 timer efter infektionen, vi viste, at en ufuldkommen teknik, hvor en lille mængde af de bakterielle inokulum går tabt i forbindelse med infektion, stadig resulterer i robuste kolonisering af den blæren. I at udnytte denne protokol, efterforsker bør sigte mod at opnå lækage-fri instillations. Men robusthed af proceduren sikrer, at ufuldkommen instillations vil stadig give nyttige data og fortolkelige resultater.
Den store fordel ved vores teknik over den eneste publicerede alternative metode til mandlige blæreinfektion er dens non-invasiv, ikke-kirurgiske tilgang. Vores tilgang, ved hjælp af transuretral instillation følger den fysiologiske rute gennem urinrøret til blæren, uden at forstyrre den strukturelle integritet af maven. Den invasive teknik, beskrevet af Olson og kolleger20, omfatter faktorer forbundet med kirurgisk procedurer, herunder betændelse, forsinket heling, og deraf følgende arvæv. Særlig relevant med hensyn til undersøgelser af immunrespons til infektion er den organismes svar på Kirurgisk traume. Dette omfatter dannelsen af en pro-inflammatoriske milieu og potentielle væv granulering samt en anti-inflammatorisk sår healing program som en del af helingsprocessen. Disse faktorer udgør uønskede påvirkninger inden for den eksperimentelle indstilling.
Endelig, formålet med denne undersøgelse var at udvikle en metode, der giver mulighed for direkte sammenligning af mandlige og kvindelige immunrespons i løbet af UTI, som kan anvendes til fremtidige undersøgelser adressering sex indflydelse på blæren mucosal disease, som infektion og kræft biologi. Som en anden klar fordel beskrevet metoden her spejle, der anvendes i hunmus for årtier19. Således kan eksperimenter udført i mandlige mus med denne teknik sammenlignes med en bred krop af eksisterende forskning. Vores forsøg har afsløret, at der findes forskelle i svar og at disse forskelle kan give et fingerpeg at forstå kønsrelaterede forskelle i respons på slimhinde infektioner, såvel som andre sygdomme i blæren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr Matthieu Rousseau for kritisk læsning af håndskriftet og laboratorium af dendritiske Immunobiology for deres nyttige indsigt under udviklingen af denne protokol og projekt. Dette arbejde blev støttet i en del af midlerne fra den Europæiske Union syvende ramme program Marie Curie-aktion (PCIG11-GA-2012-3221170, og Immuno-onkologi LabEx (MAI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long | BD Medical | 381811 or 381411* | * catalog number is country-dependent |
| inoculating loop | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Miller broth | Difco | 244620 | |
| LB Miller agar | Difco | 244520 | |
| Cuvettes | Bio-rad | 223-9955 | |
| syringes | B Braun | 9166017V | |
| Thumb (Adson) forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 5 ml tubes, polypropylene | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor disposable probes | Qiagen | 990890 | |
| 15 ml flip cap tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw |
| 100 µM MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible with 15 ml tubes, preferred |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352360 | compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available |
| 96 well plate | Falcon | 353077 | |
| Fc block | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anti-mouse CD45 antibody | BD Biosciences | 561487 | many different fluorescent conjugation options are available |
| 5 ml tubes polystyrene with filter cap | Falcon | 352235 | |
| insulin syringe | Terumo | BS05M2913 | |
| hand held homogenizer | Qiagen | 9001272 | TissueRuptor |
| flow cytometer | BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Flow cytometry software | BD Biosciences | N/A | Diva |
References
- Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11 (3), 551-581 (1997).
- Harper, M., Fowlis, G. Management of urinary tract infections in men. Trends in Urology, Gynaecology & Sexual Health. 12 (1), 30-35 (2007).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat Rev Urol. 7 (12), 653-660 (2010).
- Lipsky, B. A. Urinary tract infections in men. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis, and treatment. Ann Intern Med. 110 (2), 138-150 (1989).
- Conway, L. J., Carter, E. J., Larson, E. L. Risk Factors for Nosocomial Bacteremia Secondary to Urinary Catheter-Associated Bacteriuria: A Systematic Review. Urol Nurs. 35 (4), 191-203 (2015).
- Markle, J. G., Fish, E. N.
- Yu, C. Y., Whitacre, C. C. Sex, MHC and complement C4 in autoimmune diseases. Trends Immunol. 25 (12), 694-699 (2004).
- Castelao, J. E., et al. Gender- and smoking-related bladder cancer risk. J Natl Cancer Inst. 93 (7), 538-545 (2001).
- Donsky, H., Coyle, S., Scosyrev, E., Messing, E. M. Sex differences in incidence and mortality of bladder and kidney cancers: national estimates from 49 countries. Urol Oncol. 32 (1), 40-e31 (2014).
- Garg, T., et al. Gender Disparities in Hematuria Evaluation and Bladder Cancer Diagnosis: A Population-Based Analysis. J Urol. , (2014).
- Dobruch, J., et al. Gender and Bladder Cancer: A Collaborative Review of Etiology, Biology, and Outcomes. Eur Urol. , (2015).
- Hsu, J. W., et al. Decreased tumorigenesis and mortality from bladder cancer in mice lacking urothelial androgen receptor. Am J Pathol. 182 (5), 1811-1820 (2013).
- El Behi, M., et al. An essential role for decorin in bladder cancer invasiveness. EMBO Mol Med. 5 (12), 1835-1851 (2013).
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Am J Med. 113, Suppl 1A. 05S-13S (2002).
- Ingersoll, M. A., Kline, K. A., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. G-CSF induction early in uropathogenic Escherichia coli infection of the urinary tract modulates host immunity. Cell Microbiol. 10 (12), 2568-2578 (2008).
- Mora-Bau, G., et al. Macrophages Subvert Adaptive Immunity to Urinary Tract Infection. PLoS Pathog. 11 (7), e1005044 (2015).
- Oliveira, P. A., et al. Technical Report: Technique of Bladder Catheterization in Female Mice and Rats for Intravesical Instillation in Models of Bladder Cancer. (Conference Title)39th Scand-LAS and ICLAS Joint Meeting. 36, 5-9 (2009).
- Seager, C. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2 (12), 1008-1014 (2009).
- Hagberg, L., et al. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin). Infect Immun. 40 (1), 273-283 (1983).
- Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. J Am Soc Nephrol. , (2015).
- Knipper, J. A., et al. Interleukin-4 Receptor alpha Signaling in Myeloid Cells Controls Collagen Fibril Assembly in Skin Repair. Immunity. 43 (4), 803-816 (2015).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Development of intracellular bacterial communities of uropathogenic Escherichia coli depends on type 1 pili. Cell Microbiol. 9 (9), 2230-2241 (2007).
