Summary
本协议描述了一种改进的技术, 用于丰富的脑脊液 (CSF), 不污染血液。随着样品的收集和纯度的增加, 可以通过脑脊液进行更多的分析, 进一步了解影响大脑和脊髓的疾病。
Abstract
脑脊液 (CSF) 是一种有价值的体液, 用于分析神经科学研究。它是最接近中枢神经系统的液体之一, 因此可以用来分析大脑或脊髓的患病状态而不直接进入这些组织。然而, 小鼠由于与血管的亲近而难以从大池获得, 这通常会污染样本。小鼠的脑脊液采集面积也很难解剖, 而且通常只有小样本 (最多5-7 µL 或更少)。该协议详细描述了一种技术, 改进现有的收集方法, 以尽量减少血液污染, 并允许大量收集脑脊液 (平均10-15 µL 可以收集)。这种技术可以与其他解剖方法, 从小鼠组织收集, 因为它不会影响任何组织在脑脊液提取。因此, 大脑和脊髓不受这种技术的影响, 并保持不变。随着脑脊液样品的收集和纯度的增加, 更多的分析可以用来进一步帮助神经科学研究, 更好地了解影响大脑和脊髓的疾病。
Introduction
脑脊液是一种有价值的体液, 用于分析神经科学研究。脑脊液主要由血浆组成, 含有少量细胞 (没有红细胞, 只有少数白细胞), 几乎无蛋白质。它是与中枢神经系统 (CNS) 紧密接触的液体之一, 它可以将许多电解质从大脑和脊髓传给外围系统。在人类中, 可以收集脑脊液样本以帮助诊断疾病或临床试验中的研究目的, 因为脊椎穿刺 (或腰椎穿孔) 是一种轻微的侵入性手术: 脑脊液可以反映中枢神经系统的变化, 而无需直接访问这些组织.因此, 近年来, 为临床研究目的, 脑脊液样本已获得从神经退行性疾病的患者, 如阿尔茨海默病和其他痴呆1,2,3。有许多生物标志物的研究已经开发使用脑脊液样本, 以潜在的帮助诊断疾病的诊所2,3。然而, 对于这些化验的可靠性, 有很多争论, 以产生一致的, 敏感的结果, 专门诊断疾病4,5。因此, 有必要发展更好的检测和指标, 可以在脑脊液中找到, 以帮助生产一种标准技术, 以更大的灵敏度和特异性诊断神经变性疾病。由于人体脑脊液样本在疾病中的潜在重要性, 在神经科学研究中采集啮齿目动物的脑脊液也很有兴趣。
小鼠是生物学和医学研究中的重要动物, 在人类临床试验之前, 允许对潜在的治疗化合物和概念证明研究进行测试。然而, 在小鼠很难获得脑脊液标本由于它接近大脑在一个小动物, 因为通常的脑脊液收集方法是通过大池获得, 在小脑和延髓背表面之间的开放。这导致采集脑脊液标本困难, 因为这一地区很难解剖, 并与血管接近, 增加了血细胞污染的风险。由于这些困难, 大多数研究人员只能获得少量的脑脊液进行分析 (通常说是5-7 µL), 并且血液细胞对脑脊液样品的污染是分析6、7、8的主要关注因素。,9. 血液污染会使结果模糊不清, 并不能真正反映中枢神经系统的状态。此外, 有限样本收集可以影响研究, 因为通常的数量从小鼠是足够的只有一个测量 (重复或三个) 使用酶联免疫吸附试验 (ELISA)。因此, 脑脊液标本通常是从多个小鼠汇集, 以便有足够的样本来运行多种化验。为大量、无污染的小鼠脑脊液收集提供了一个协议, 这对改善利用啮齿动物进行神经科学研究是有益的。
在本议定书中, 详细描述了从麻醉小鼠中大量 (平均10-15 µL) 收集脑脊液的技术, 并改进了目前已知的脑脊液收集方法, 以最大限度地减少血液中的污染10。一个强健的脑脊液收集协议将有助于开发基于脑脊液的生物标志物化验, 这可以用来帮助诊断疾病, 并改进对影响中枢神经系统疾病的机制的研究。
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Protocol
所有动物实验都是按照神经科学学会 (美国) 和复旦大学 (中国上海) 伦理委员会的政策进行的。这个程序是为非生存手术。
1. 脑脊液采集装置的设置
- 使用微拉拔玻璃毛细管 (内径为0.75 毫米, 外径1.0 毫米) (如刘et所示)。10;锐毛毛细管显示在图 1中)。
- 将锐尖的玻璃毛细管放入牢固安装在机器人上的毛细管支架上 (图 1A)。
- 在解剖显微镜下用直钳折断锐毛毛细管的尖端, 使断尖的内径约为10-20 µm (图 1C)。
- 将细管和注射器连接到毛细管支架的另一端, 并用三通阀将薄壁管与注射器相连。
- 将三路阀门打开, 然后将注射器从注射器中吹出空气, 通过油管向玻璃毛细管排放, 以排出任何污染物, 并在毛细管管内产生正压。
- 重复这几次通过不连接和重新连接注射器到三路阀门, 并提请注射器100-200 µL 之前, 注射器的最后重新连接与三通阀 (图 1B)。
- 将机器人与玻璃毛细管移动到侧面以防止在小鼠解剖过程中造成损伤。
图1。显微镜, 机器人, 毛细管设置.(A) 显微镜和机器人与毛细管连接安装, 以及更近的图像 (B) 连接的注射器和三路阀门打开 (这里显示) 或关闭管道, 和 (C) 一个完整 (右) 和折断 (左)毛细管尖端准备脑脊液收集。一旦断裂, 毛细管的尖端应该有一个内径为0.75 毫米, 外径为1.0 毫米.请单击此处查看此图的较大版本.
2. 小鼠解剖
- 麻醉鼠标。
注: 对于本协议, C57BL/6 和淀粉样蛋白/早老素 1 (APP/PS1) 转基因 (阿尔茨海默病小鼠模型) 小鼠使用和麻醉4% 水合氯醛 (在dH2 0) 在10µL/克小鼠体重通过腹腔注射. - 当完全麻醉, 确保鼠标被充分麻醉。对脚趾捏的撤退反应, 稍微延长后肢和捏脚趾和观察撤退反应, 是为了确保足够的麻醉。用捏所有四只四肢检查;如果没有反应, 鼠标被适当麻醉。用解剖剪刀 (图 2A) 从眼睛上方切开和修剪鼠标头部后部的毛发, 从耳朵到颈部底部。或者, 剪刀或脱毛奶油可以用来帮助脱毛。
- 使用鼠标适配器来保护鼠标头 (头向后朝上, 鼻子指向45°,图 2A)。在鼠标的耳朵和眼睛之间固定耳条并收紧。请确保头部无法移动, 并在适配器中通过轻轻向下向下推到鼠标头部而使其牢固地固定。
- 在做手术切口前, 定期检查戒断反应, 并定时检查以保证手术面的麻醉。视觉上注意到在过程中呼吸速度的任何变化, 以表明麻醉的飞机的变化。一个干净的, 无菌的, 技术可以用于这种短期的非生存手术。使用剪刀和弯曲钳, 穿过皮肤和第一层肌肉, 直到头骨的底部暴露只有一层薄薄的肌肉。
注: 通过将老鼠的皮肤穿过颈部的背部, 然后将皮肤从头骨中间切开到老鼠的耳朵和眼睛之间。然后, 皮肤和组织可以被拉出, 并在麦格纳的范围外。 - 在解剖显微镜下观察时, 用钳子仔细解剖头骨底部的最后一层肌肉, 并将这些肌肉层移动到侧面和远离感兴趣的区域。如果有出血, 使用棉花芽去除和帮助止血。
- 一旦硬脑膜在大池被暴露 (三角形的形状与通常1-2 大血管在该地区运行; 无论是血管的一侧或之间的毛细血管插入和脑脊液收集,图 2B), 使用湿棉芽要擦拭膜清洁, 然后用干棉芽干燥该区域。
图2。鼠标和解剖设置有代表性的图像毛细管插入脑脊液收集.设置用于脑脊液提取的鼠标 (A) 将剃掉的头夹在用于解剖的地方, (B) 详细的图像 (10x 视图) 的解剖小鼠硬脑膜覆盖池麦格纳 (虚线箭头显示一个血管贯穿该地区和实心箭头显示区域最佳的毛细管插入)。详细图像 (10x 视图) (C) 锐尖的玻璃毛细管对准麦格纳的硬脑膜, (D) 毛细管几乎刺穿硬脑膜, 与一些硬脑膜的阻力, 和 (E) 毛细管尖端挖掘通过硬脑膜收集脑脊液。脑脊液应该是一个清澈的液体收集在玻璃毛细管 (虚线箭头)。每个显微镜图像右下角的所有刻度条均显示为100µm.请单击此处查看此图的较大版本.
3. 麻醉鼠脑脊液采集
- 将玻璃毛细管与鼠标头的背面对齐, 使锐化点刚好位于膜的后面30-45 °角 (图 2C)。
- 注射一次或几次, 并提请注射器100-200 µL (以确保没有污染物, 并有负压在玻璃毛细管)。
- 使用机器人, 将毛细管尖端移动到膜上, 直到能看到电阻, 但不能刺穿它 (图 2D)。
- 一旦在毛细管和膜的尖端之间出现阻力, 通过敲机器人的控制, 轻轻地敲击毛细管通过膜。用显微镜观察毛细血管穿刺到麦格纳池的锐尖点。一旦穿刺孔被刺穿 (图 2E), 脑脊液应自动被抽出到毛细管管中。
- 留下毛细血管慢慢收集脑脊液。如果脑脊液停止抽出, 抽出少量的注射器缓慢 (~ 50 µL), 以创造更多的负压毛细管, 以提取脑脊液。
注: 或者, 毛细血管可以轻轻地从大脑中缓慢拉出使用精细的机器人控制, 让脑脊液再次流入毛细血管。总金额为10-15 µL 的脑脊液 (3-4 厘米的毛细管) 采取〜10-30 分钟, 偶尔20µL 或更多的可以收集。虽然并非绝对必要, 但建议在脑脊液收集过程中使用热垫。脑脊液采集是在室温下 (摄氏23摄氏度) 进行的。 - 一旦需要的脑脊液被收集, 关闭油管通过转移三路阀门关闭 (停止绘制脑脊液)。
- 取出与油管相连的注射器, 然后打开并关闭油管 (以在毛细管、油管和毛细管外的区域产生均衡压力)。用三路阀门重新连接注射器, 但不要把注射器扎起来。
- 使用机器人轻轻地从鼠标中取出玻璃毛细管。
- 将收集管 (1.5 毫升管内与1µL 的20x 蛋白酶抑制剂) 置于玻璃毛细管的锐尖点下。
- 打开油管, 轻轻地扎进注射器: 脑脊液应该流出毛细血管, 进入收集管。
- 收集后, 快速离心机 (脉冲旋转为 5 s 以最大速度使用微型离心机) 脑脊液混合样品与蛋白酶抑制剂在底部的收集管。
注: 脑脊液样品可以 aliquoted, 然后储存以进一步分析-80 摄氏度。其余的老鼠可以解剖其他组织, 如大脑和脊髓。老鼠在这个阶段还活着, 如果需要, 也可以收集血液。
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Representative Results
使用此处概述的过程 (图 1和图 2), 立即在毛细管中收集的 CSF 应该是清晰的 (图 2E), 而不是粉红色或红色。如果在毛细管中收集的液体中有粉红色到红色的色调, 那么就会有血液污染。
以该方法采集的脑脊液样品的应用为例, 用 ELISA 法测定了蛋白质淀粉样蛋白β (Aβ) 的含量。Aβ在脑脊液中的含量在阿尔茨海默氏病研究中通常被测量为7。脑脊液主要是无蛋白的。在小鼠阿尔茨海默病 (APP/PS1 小鼠) 模型中, 人类 Aβ42的水平显著增加, 这些小鼠过度表达 tshr 人类应用。这可以观察到从12月大的老鼠收集的脑脊液样本使用这里描述的方法 (野生型 (小鼠) 脑脊液中的 0 pg/毫升与 APP/PS1 小鼠脑脊液中的 1303 pg/毫升相比,图 3)。
图3。收集的脑脊液样品的代表性结果.收集脑脊液标本的 ELISA 分析。在小鼠阿尔茨海默病 (APP/PS1) 的模型中, 脑脊液中人类 Aβ42的水平显著增加, 这些小鼠过度表达 tshr 人类Aβ 42 (1303 pg/毫升)。在野生型 (小鼠) 中, 不应检测到人类 Aβ42 (0 pg/毫升)。用未配对的t测试来测量意义, ** p < 0.01, 分别表示为 SEM、n = 3 和4小鼠的误差条。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本协议详细描述了一种技术, 它改进了现有方法10脑脊液收集, 以最大限度地减少血液污染, 并允许大量收集脑脊液 (平均约10-15 µL 可获得) 从小鼠。当打破毛细管尖端, 毛细管的尖端不应该太小 (因为然后脑脊液将被提取非常缓慢) 或太大 (将不够罚款, 以收集脑脊液和组织可以成为在毛细管)。在解剖脑脊液收集区域时应注意: 应停止任何出血, 并将玻璃毛细管的插入区域与 dH20 一起清除, 以避免样品污染。每只老鼠的解剖是不同的, 但大多数老鼠有1-2 主要的血管运行通过毛细血管需要插入的地方脑脊液收集。选择正确的插入毛细管的地方是很重要的, 因为插入太靠近主要血管会污染脑脊液与血液。如图 2所示, 一个区域明显的血管, 如在主血管的两边或两侧, 是最佳的毛细管插入, 以避免污染。如果脑脊液不以稳定的速度流出, 并在一段时间后停止, 抽取注射器少许 (~ 50 µL) 可以帮助重新启动脑脊液流向毛细血管。或者, 毛细管本身可以轻轻地和缓慢地移动或离开鼠标与机器人重新启动脑脊液提取流。在做这些步骤时必须小心, 因为血液也可以流入毛细血管中。这项技术的工作很好, 因为从大脑和玻璃毛细血管的压力不同, 从老鼠身上抽出脑脊液。因此, 鼠标只能被刺穿一次, 就像毛细管插入鼠标后取出, 大脑中有压力的损失, 如果再次插入, 脑脊液将不再被抽出到毛细管中。因此, 实践将完善这一技术, 不产生血液污染物, 并获得足够的脑脊液收集的第一次插入毛细血管进入鼠标 (从经验, 10-20 实践小鼠将足够达到这个阶段)。
该协议是一种改进和有效的方法从小鼠提取脑脊液, 如果做得正确, 最大限度地减少血液污染 (图 1,图 2,图 3)。这项技术是有限的时间为脑脊液收集。通常情况下, 在室温下收集15µL 或更多的脑脊液需要30分钟 (摄氏23摄氏度)。在这段时间里, 老鼠可以用棉绒或纸巾保暖, 但如果没有覆盖物或热垫, 脑脊液仍然可以成功收集。添加热垫或加热鼠标在程序之前, 可以通过增加脑部脑脊液的流动和减少收集所需的时间来改善这种技术, 如其他方法1011所述。但是在这里描述的协议中, 没有使用鼠标的热垫或变暖, 老鼠之间也没有任何困难, 可以收集的脑脊液量。作为应用此技术的一个例子, 人类 Aβ42的水平是用 ELISA 法测量的。Aβ被称为粘性, 可以坚持玻璃和收集管。本协议采用硼硅酸盐玻璃毛细血管和聚丙烯管从小鼠体内采集脑脊液。虽然一些 Aβ可能粘在玻璃毛细管和收集管壁, ELISA 结果表明, Aβ水平可以测量 (图 3)。尽管如此, 从该协议中采集的脑脊液中测量的 Aβ水平低于其他研究的可能性, 但是玻璃毛细血管是穿透老鼠硬脑膜以收集脑脊液的必要条件。除了测量 Aβ, 其他感兴趣的蛋白质也可以用脑脊液收集来测量。
而以前发表的脑脊液采集方法由刘et 等。10用于连续从活鼠体内收集脑脊液, 这里描述的方法是从老鼠身上收集脑脊液, 用于组织收集和分析。因此, 这项技术可以与其他解剖方法一起用于小鼠组织收集, 因为它不影响大脑和脊髓, 和脑脊液收集后 (即, 10-30 分钟后, 10-15 µL 的脑脊液), 鼠标仍然应该呼吸和麻醉下。因此, 其他组织, 如血液, 脑, 脊髓和肝脏仍然是可行的收集和生物化学分析。虽然刘等等方法收集脑脊液非常迅速 (每只10分钟为3-7 µL 的脑脊液), 这里描述的方法需要较长的时间, 但可以收集更多的脑脊液10。另一种脑脊液收集方法也被玛雅et . 描述。11刘et 。玛雅et . 方法描述了通过手持玻璃毛细血管或凝胶装载者提示采集小鼠的脑脊液, 并刺穿了麦格纳池。此处描述的方法不同于将毛细管固定在机器人上。这确保毛细血管保持不动, 减少血液中的污染, 在脑脊液收集。机器人还允许更精确和准确地刺穿大池, 以获得脑脊液。尽管玛雅et方法也能获得每只老鼠15-20 µL 的脑脊液, 但它需要用凝胶装载器提示, 用手反复穿刺池, 这可能会增加血液或组织污染的风险。此外, 玛雅的et 等方法可能会减少大脑中的压力, 每一个连续穿刺的大池, 以便有越来越少的脑脊液收集每次。这里描述的方法只涉及一个穿刺, 并留在麦格纳的毛细血管, 以进一步收集脑脊液, 因为它补充脑脊液, 而鼠标在麻醉下。因此, 这里描述的协议不断收集脑脊液和最大限度地减少可能的污染, 从反复穿刺到麦格纳池和扰乱周围组织。
随着脑脊液样品的收集和纯度的增加, 更多的分析可以用于进一步帮助神经科学研究。在研究人员中众所周知, 从老鼠那里收集脑脊液是很繁琐的, 只有有限的样本可以获得 (通常说最多5-7 µL6,7,8,9)。在文献中, 没有许多用于脑脊液提取的详细协议, 本协议改进了以前发布的方法10 , 以最大限度地减少来自血液的污染, 同时保持大量的脑脊液收集。脑脊液在神经科学研究中有许多应用, 作为中枢神经系统组织中最接近的流体之一, 它是研究的宝贵样本。以前已确定成年鼠标的总容量为40µL 的 CSF12。因此, 该协议能够获得 25%, 可能更多的脑脊液在一个成年鼠的总数量。除了近交系 C57BL/6 和 APP/PS1 小鼠外, outbred 菌株印迹控制区也被用来成功地采集脑脊液。从不同年龄的小鼠 (4 到18个月) 的脑脊液已经成功地收集使用该协议。因此, 用这种方法从不同品系或年龄的小鼠中采集脑脊液是不难的。这项详细的协议有望被许多人用来改进脑脊液化验和其他分析技术的发展, 以帮助研究了解影响大脑和脊髓的神经退行性疾病。
关键的是, 鼠标的头部被紧固, 所以它不会移动在解剖和脑脊液收集 (协议3节)。最初穿刺到麦格纳池的部位对于获得大量的无污染脑脊液非常重要。毛细血管不应插入太靠近任何血管, 以避免污染的样本收集。此外, 毛细血管的调整对脑脊液的最佳采集至关重要。使用机器人可以进行细微的调整, 而不会严重扰乱周围的组织和污染脑脊液。利用机器人的精细控制, 毛细血管可以缓慢地移入或流出, 让脑脊液从鼠标流出, 进入毛细管中收集。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金 (81650110527、81371400) 和中国国家重点基础研究项目 (2013CB530900) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
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