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Cancer Research

कैंसर अनुसंधान में चिकित्सीय और नैदानिक एंटीबॉडी जैव वितरण के आकलन के लिए Vivo इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण में

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59810
Automatic Translation
1, 2
1Apoptosis, Cancer and Development Laboratory - Equipe labellisée 'La Ligue', LabEx DEVweCAN, Centre de Cancérologie de Lyon, INSERM U1052-CNRS UMR5286, Centre Léon Bérard, 2Department of Radiology/Molecular Imaging Program at Stanford, School of Medicine, Stanford University

Summary

इनविवो इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण (आईवीआईएल) विधि का उपयोग विवो ट्यूमर लक्ष्यीकरण और पूर्व विवो इम्यूनोस्टेनिंग में संयोजन का उपयोग करके जीवित जीवों में ऑन्कोलॉजिकल उद्देश्यों के लिए एंटीबॉडी और एंटीबॉडी संयुग्मी उद्देश्यों के विवो जैव वितरण में जांच करने के लिए किया जा सकता है। विधियों.

Abstract

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) कैंसर का पता लगाने, निदान, और उपचार में महत्वपूर्ण उपकरण हैं। वे tumorigenesis में प्रोटीन की भूमिका को जानने के लिए उपयोग किया जाता है, ट्यूमर का पता लगाने और लक्षण को सक्षम करने के कैंसर biomarkers के लिए निर्देशित किया जा सकता है, और mAbs या एंटीबॉडी दवा conzugates के रूप में कैंसर चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए, को बाधित करने के लिए संकेतन रास्ते, या सीधे विशिष्ट प्रतिजन ले जाने की कोशिकाओं को मारने. विकास और उपन्यास और अत्यधिक विशिष्ट mAbs के उत्पादन में नैदानिक प्रगति के बावजूद, नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों जटिलता और ट्यूमर microenvironment की विषमता से बिगड़ा जा सकता है. इस प्रकार, कुशल एंटीबॉडी आधारित चिकित्सा और निदान के विकास के लिए, जीवित ट्यूमर microenvironment के साथ एंटीबॉडी आधारित संयुग्मी के जैव वितरण और बातचीत का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम Vivo इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण (IVIL) में विवो शारीरिक और रोग की स्थिति में एंटीबॉडी आधारित चिकित्सकीय और निदान की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक नए दृष्टिकोण के रूप में वर्णन करते हैं। इस तकनीक में, एक चिकित्सीय या नैदानिक प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी को अलग ट्यूमर में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ विवो और स्थानीयकृत पूर्व विवो में अंतःशिरा इंजेक्शन दिया जाता है। इसलिए, आईवीआईएल एंटीबॉडी आधारित दवाओं और लक्षित एजेंटों के विवो जैव वितरण को दर्शाता है। दो IVIL अनुप्रयोगों स्तन कैंसर के आणविक इमेजिंग के लिए एंटीबॉडी आधारित विपरीत एजेंटों के biodistribution और पहुँच का आकलन वर्णित हैं. इस प्रोटोकॉल भविष्य के उपयोगकर्ताओं को अपने एंटीबॉडी आधारित अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए IVIL विधि को अनुकूलित करने की अनुमति देगा.

Introduction

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAb) बड़े ग्लाइकोप्रोटीन (लगभग 150 केडीए) इम्यूनोग्लोबुलिन सुपरफैमिली हैं जो बी कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं और प्रतिरक्षा प्रणाली में एक प्राथमिक समारोह की पहचान करने और या तो जैविक समारोह को बाधित करते हैं, या के लिए चिह्नित करते हैं विनाश, जीवाणु या वायरल रोगजनकों, और कैंसर की कोशिकाओं पर असामान्य प्रोटीन अभिव्यक्ति पहचान सकते हैं1. एंटीबॉडीज अपने विशिष्ट प्रतीक के प्रति बहुत अधिक आत्मीयता रख सकते हैं , जो उन्हें बायोमेडिसिन2में अत्यधिक आशाजनक साधन बनाते हैं . मिलस्टीन और केहलर द्वारा हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी के विकास के साथ ( 1984 में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित), mAbs का उत्पादन संभव हो गया3. बाद में, मानव mAbs phage प्रदर्शन प्रौद्योगिकी या ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों का उपयोग कर उत्पन्न किया गया और उपन्यास अनुसंधान उपकरण और चिकित्साउपकरण 4,5के रूप में उनके उपयोग में क्रांति ला दी.

कैंसर एक विश्वव्यापी स्वास्थ्य मुद्दा है और मृत्यु का एक प्रमुख कारण है जिससे रोकथाम, पता लगाने और चिकित्सा6के लिए उपन्यास दृष्टिकोण की आवश्यकता पैदा होती है। तारीख करने के लिए, mAbs ट्यूमरजनन में जीन और उनके प्रोटीन की भूमिका के extrication की अनुमति दी है और जब कैंसर biomarkers के खिलाफ निर्देशित, ट्यूमर का पता लगाने और रोगी स्तरीकरण के लिए लक्षण सक्षम कर सकते हैं. कैंसर चिकित्सा के लिए, द्विविशिष्ट mAbs, एंटीबॉडी दवा conzugates, और छोटे एंटीबॉडी टुकड़े चिकित्सकीय के रूप में विकसित किया जा रहा है, और लक्षित दवा वितरण के लिए चिकित्सीय प्रभावकारिता बढ़ाने के लिए7. इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी इस तरह के फ्लोरोसेंट निर्देशित सर्जरी, photoacoustic (पीए) इमेजिंग, अल्ट्रासाउंड (अमेरिका) आणविक इमेजिंग, और चिकित्सकीय इस्तेमाल किया positron उत्सर्जन के रूप में आणविक इमेजिंग तरीकों के लिए विपरीत एजेंटों के biomarker लक्ष्यीकरण के लिए सेवा टोमोग्राफी (पीईटी) या एकल फोटॉन उत्सर्जन परिकलित टोमोग्राफी (स्पेक्ट)8| अंत में, एंटीबॉडी भी theranostic एजेंटों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है रोगियों के स्तरीकरण और लक्षित चिकित्सा9के लिए प्रतिक्रिया निगरानी को सक्षम करने के लिए. इसलिए, उपन्यास mAbs कैंसर का पता लगाने, निदान, और उपचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए शुरू कर रहे हैं.

विकास और उपन्यास और अत्यधिक विशिष्ट mAbs के उत्पादन में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों ट्यूमर पर्यावरण की जटिलता के कारण अप्रभावी प्रदान किया जा सकता है. एंटीबॉडी अन्योन्यक्रियाएं एपिटोप के प्रकार पर निर्भर करती हैं, अर्थात्,चाहे वह रेखीय हो या संपिंडन10. प्रतिजनों की मान्यता के अलावा, एंटीबॉडी को एंटीजन व्यक्त करने वाली लक्ष्य कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए पोत की दीवारों, बेसल झिल्ली, और ट्यूमर स्ट्रोमा जैसे प्राकृतिक बाधाओं को दूर करने की आवश्यकता है। एंटीबॉडी ऊतक के साथ बातचीत न केवल चर टुकड़ा प्रतिजन बंधन (फैब) डोमेन के माध्यम से, लेकिन यह भी लगातार क्रिस्टलीय टुकड़ा (एफसी) के माध्यम से जो आगे ऑफ साइट बातचीत की ओर जाताहै 11. लक्ष्यीकरण भी ट्यूमर थोक भर में ट्यूमर मार्करों की विषम अभिव्यक्ति और ट्यूमर संवहनी और लसीका प्रणाली12,13में विषमता से जटिल है . इसके अलावा, ट्यूमर microenvironment कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स जो ट्यूमर कोशिकाओं का समर्थन से बना है, ट्यूमर प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को दबाने, और ट्यूमर endothelium जो ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के परिवहन का समर्थन करता है, के सभी जो एंटीबॉडी आधारित चिकित्सा या निदान के प्रवेश, वितरण, और उपलब्धता के साथ हस्तक्षेप करते हैं। कुल मिलाकर, इन विचारों चिकित्सकीय या नैदानिक प्रभावकारिता सीमित कर सकते हैं, उपचार प्रतिक्रिया को कम करने, और ट्यूमर प्रतिरोध में परिणाम हो सकता है.

इसलिए, कुशल एंटीबॉडी आधारित चिकित्सा और निदान के विकास के लिए, ट्यूमर microenvironment के भीतर एंटीबॉडी आधारित संयुग्मी के जैव वितरण और बातचीत का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान में, पूर्व नैदानिक अध्ययन में, ट्यूमर अनुसंधान मॉडल में मार्कर अभिव्यक्ति इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) ट्यूमर वर्गों14के धुंधला द्वारा पूर्व vivo विश्लेषण किया है। मानक IF धुंधला प्राथमिक मार्कर-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ किया जाता है जो तब माध्यमिक फ्लोरोसेंटद्वारा पूर्व विवो ट्यूमर ऊतक स्लाइस कि जानवर से अलग किया गया है पर एंटीबॉडी लेबल द्वारा प्रकाश डाला जाता है. इस तकनीक ऊतक निर्धारण के समय मार्कर के स्थिर स्थान पर प्रकाश डाला गया है और कैसे एंटीबॉडी आधारित चिकित्सकीय या निदान वितरित या शारीरिक स्थितियों में बातचीत हो सकती है में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करता है. पीईटी, स्पेक्टर, अमेरिका और पीए द्वारा आण्विक इमेजिंग पूर्व नैदानिक मॉडल 8,15में एंटीबॉडी-कंजुटेड कंट्रास्ट एजेंट वितरण के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। के रूप में इन इमेजिंग रूपरेखा गैर इनवेसिव हैं, अनुदैर्घ्य अध्ययन किया जा सकता है और समय के प्रति समूह जानवरों की एक न्यूनतम संख्या के साथ डेटा एकत्र किया जा सकता है. हालांकि, इन गैर इनवेसिव आणविक इमेजिंग दृष्टिकोण काफी संवेदनशील नहीं हैं और सेलुलर स्तर पर एंटीबॉडी वितरण के स्थानीयकरण के लिए पर्याप्त संकल्प नहीं है. इसके अतिरिक्त, प्राथमिक एंटीबॉडी की भौतिक और जैविक विशेषताओं को एक विपरीत एजेंट16के संयोजन से काफी बदल सकता है।

आदेश में vivo शारीरिक और रोग की स्थिति को ध्यान में रखने के लिए कैसे एंटीबॉडी आधारित चिकित्सकीय और निदान ट्यूमर वातावरण के भीतर बातचीत और उच्च संकल्प सेलुलर और यहां तक कि उप-कोशिक वितरण प्राप्त करने के लिए गैर-संयोजित एंटीबॉडी की प्रोफाइल, हम एक IF दृष्टिकोण का प्रस्ताव करते हैं, जिसे विवो इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण (आईवीआईएल) में समझा जाता है, जिसमें एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी को विवो में अंतःशिरा इंजेक्शन दिया जाता है। एंटीबॉडी आधारित चिकित्सकीय या नैदानिक, एक प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में कार्य, कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं में प्रसारित और अत्यधिक सटीक, रहने वाले ट्यूमर वातावरण में अपने लक्ष्य प्रोटीन को बांधता है। प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ विवो लेबल ट्यूमर के अलगाव के बाद, एक माध्यमिक एंटीबॉडी संचित स्थानीयकरण और बनाए रखा एंटीबॉडी संयुग्मी करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह दृष्टिकोण पहले से वर्णित यदि ऊतक विज्ञान दृष्टिकोण के समान है जो फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किए गए एंटीबॉडी17का इंजेक्शन लगाता है . हालांकि यहां, गैर-कंजुटेड एंटीबॉडी का उपयोग एंटीबॉडी संशोधन द्वारा प्रेरित जैव वितरण विशेषताओं में संभावित परिवर्तन से बचा जाता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के पूर्व vivo आवेदन ऊतक संग्रह और प्रसंस्करण के दौरान फ्लोरोसेंट संकेत के एक संभावित नुकसान से बचा जाता है और फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता के प्रवर्धन प्रदान करता है। हमारे लेबलिंग दृष्टिकोण एंटीबॉडी आधारित दवाओं और लक्षित एजेंटों के vivo biodistribution में दर्शाता है और उपन्यास नैदानिक और चिकित्सीय एजेंटों के विकास के लिए महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.

यहाँ, हम IVIL विधि के दो अनुप्रयोगों का वर्णन के रूप में पिछले अध्ययन में लागू किया गया है स्तन कैंसर का पता लगाने के लिए आणविक इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए एंटीबॉडी आधारित विपरीत एजेंटों की biodistribution और पहुँच की जांच. सबसे पहले, एक एंटीबॉडी के biodistribution के पास अवरक्त डाई संयुग्मी (एंटी-B7-H3 एंटीबॉडी के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट डाई, indocyanine हरे, B7-H3-ICG) और isotype नियंत्रण एजेंट (Iso-ICG) फ्लोरोसेंट और photoacoustic आणविक के लिए बाध्य इमेजिंग18का पता लगाया है. इस अनुप्रयोग की विधि प्रोटोकॉल में वर्णित है। इसके बाद, netrin-1 करने के लिए एक conformationally संवेदनशील एंटीबॉडी के biodistribution परिणाम, आम तौर पर पारंपरिक IF इमेजिंग के साथ पता लगाने योग्य नहीं, अल्ट्रासाउंड आणविक इमेजिंग के साथ प्रयोग किया जाता है, मात्रा निर्धारित है और प्रतिनिधि परिणाम में प्रस्तुत19. इस प्रोटोकॉल कागज के समापन पर, पाठकों को अपने एंटीबॉडी आधारित अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए IVIL विधि अपनाने सहज महसूस करना चाहिए.

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी तरीकों स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय की प्रयोगशाला पशु देखभाल (APLAC) पर संस्थागत प्रशासनिक पैनल द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. स्तन कैंसर के विकास के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल

  1. आगे बढ़ने से पहले palpation या कैलिपर माप के माध्यम से उपयुक्त ट्यूमर विकास के लिए वांछित कैंसर मॉडल से चूहों का निरीक्षण करें।
    नोट: यहाँ, स्तन कैंसर के विकास के ट्रांसजेनिक murine मॉडल (FVB/N-Tg (MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) का उपयोग किया गया था। ये जानवर सहज रूप से प्रत्येक स्तन ग्रंथि20में 6 से 12 सप्ताह की आयु के बीच आक्रामक स्तन कार्सिनोमा विकसित करते हैं . सामान्य स्तन ग्रंथियों transgene-नकारात्मक, उम्र मिलान littermates से नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया.

2. विशिष्ट और गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी एजेंटों का इंट्रावेनस इंजेक्शन

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए परिरक्षकों और भंडारण बफ़र्स को हटाने के लिए खरगोश विरोधी माउस B7-H3 और खरगोश आईजीजी आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी को एक desalting कॉलम (उदा., पीडी-10) पर शुद्ध करें।
    नोट: कुछ एंटीबॉडी प्रोटीन-एगारोस मोती आधारित प्रोटोकॉल21के साथ आगे शुद्धि की आवश्यकता हो सकती है।
  2. अलग-अलग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में प्रत्येक एंटीबॉडी संयुग्मी के 33 डिग्री ग्राम की अलीकोट खुराक।
    नोट: प्रशासित एजेंट की खुराक आवेदन के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और खुराकों जिस पर एंटीबॉडी संयुग्मी नियमित रूप से प्रयोग किया जाता है मेल खाता है. यदि पशु सुरक्षा के लिए मात्रा 100 डिग्री सेल्सियस से अधिक है तो एंटीबॉडी समाधानों की सांद्रता आवश्यक है।
  3. ऊतक संग्रह से पहले वांछित समय बिंदु पर, यहाँ 96 एच, 2% isoflurane 2 L/min पर ऑक्सीजन में बह के साथ ट्यूमर असर जानवर anesthetize, और एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म चरण पर जगह है। प्रक्रिया से पहले संज्ञाहरण का उचित स्तर तक पहुंच गया था सुनिश्चित करने के लिए एक अंगुली चुटकी करो.
  4. एंटीबॉडी समाधान की पूंछ नस टीका के लिए तैयार करने के लिए, एक शराब पोंछे के साथ तीन बार पोंछते द्वारा जानवर की पूंछ कीटाणुरहित। लगभग 30 s के लिए एक गर्मी पैड के साथ वार्मिंग से पूंछ नसों को दूर. पूरे जानवर हीटिंग से बचें. गर्मी पैड को हटाने के बाद एक बार फिर एक शराब पोंछ के साथ पूंछ साफ.
  5. एक 27G पूंछ नस कैथेटर का उपयोग करना, दो पार्श्व पूंछ नसों में से एक में तितली सुई डालने और ध्यान से शल्य टेप के एक टुकड़े के साथ मंच पर डाला सुई के साथ पूंछ तय.
    नोट: कैथेटर में दृश्यमान रक्त backflow पूंछ नस के भीतर सुई के उचित स्थान को इंगित करता है.
  6. कैथेटर को 25 डिग्री सेल्सियस के साथ बाँझ फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) के साथ फ्लश करें, फिर इंसुलिन सिरिंजों का उपयोग करके कैथेटर में एंटीबॉडी समाधान इंजेक्ट करें। कैथेटर को एक बार फिर 25 डिग्री सेल्सियस बाँझ पीबीएस के साथ फ्लश करें।
  7. पूंछ से सुई निकालें और किसी भी खून बह रहा रोकने के लिए दबाव लागू होते हैं।
  8. संज्ञाहरण बंद करें और संकट के किसी भी लक्षण के लिए पूरी तरह से जाग जब तक जानवर का निरीक्षण।

3. संग्रह और लक्ष्य ट्यूमर ऊतकों की तैयारी

  1. वांछित समय बिंदु पर, मानवीय रूप से स्वीकार्य संस्थागत प्रक्रिया के अनुसार पशु ethanize, यहाँ, 10-30% मात्रा / मिनट के एक कक्ष विस्थापन प्रवाह दर के साथ एक संपीड़ित गैस टैंक से 100% सीओ2 के क्रमिक साँस लेना द्वारा।
    नोट: IVIL तकनीक के कुछ अनुप्रयोगों पीबीएस के साथ हृदय perfusion द्वारा इच्छामृत्यु की आवश्यकता के लिए स्वतंत्र रूप से घूम एंटीबॉडीकोदूर करने के लिए19 ,22.
  2. श्वसन और हृदय आंदोलन की समाप्ति के माध्यम से मानवीय इच्छामृत्यु की पुष्टि के बाद, पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया की कमी, और श्लेष्म झिल्ली के ग्रेइंग, सर्जिकल कैंची और बल के उपयोग से उत्पाद ट्यूमर के ऊतकों को निम्नानुसार:
    1. चूहे को सुपाच्य स्थिति में रखें और पूंछ के सबसे करीब स्तन ग्रंथियों के सेट के बीच त्वचा की केवल बाहरी परत को पकड़ें (5वें) संदंश के साथ, सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी के साथ एक छोटा सा चीरा बनाएं।
    2. कटौती में बंद कैंची का परिचय दें और धीरे-धीरे टिप को खोलें ताकि त्वचा को अंतर्निहित पेट की दीवार झिल्ली से अलग किया जा सके, जिससे इसे बरकरार रखा जा सके।
    3. पेट के ऊपर एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाओ, भीतरी झिल्ली से त्वचा को अलग करने के लिए जारी. 3rd और 4th स्तन ग्रंथियों के बीच, त्वचा और स्तन ग्रंथियों के दृश्य को वापस लेने की अनुमति देने के लिए पेट भर में एक क्षैतिज कटौती करते हैं।
      नोट: मैमरी ट्यूमर और ग्रंथियों त्वचा के नीचे सतही स्थित हैं।
    4. संदंश के साथ प्रत्येक ट्यूमर या सामान्य ग्रंथि को कम करना, शल्य कैंची का उपयोग करके संलग्न त्वचा को सावधानी से ट्रिम करें।
  3. ऊतक डिस्पोजेबल आधार मोल्ड में excised ऊतकों प्लेस, prelabeled और इष्टतम काटने के तापमान से भरा (OCT) मध्यम embedding और सूखी बर्फ पर स्थान द्वारा जल्दी से मोल्ड फ्रीज. ऑफ-लक्ष्य वितरण का अध्ययन करने के लिए, अन्य ऊतकों या ब्याज के अंगों(उदा.,यकृत या फेफड़े) का उत्पादन करें।
    नोट: इस बिंदु पर प्रोटोकॉल को थामने के लिए, आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए ऊतक ब्लॉक स्टोर करें।
  4. एक cryostat का उपयोग करना, अनुभाग जमे हुए ऊतक ब्लॉक 10 डिग्री मीटर मोटाई पर और जगह आसन्न वर्गों prelabeled आसंजन कांच स्लाइड पर.
    नोट: इस बिंदु पर प्रोटोकॉल को थामने के लिए, आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड ्स्वट करें।

4. पूर्व vivo धुंधला प्रोटोकॉल

नोट: फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों के बीच मात्रात्मक तुलना के लिए, सभी स्लाइड एक ही तैयार समाधान के साथ एक ही समय में दाग रहे हैं.

  1. OCT को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पीबीएस के साथ जमे हुए ऊतक स्लाइड कुल्ला।
  2. धुंधला के दौरान आवश्यक समाधान की मात्रा को कम करने के लिए एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम के साथ ऊतक वर्गों का सीमांकन।
    नोट: यह या तो स्लाइड से ऊतक को हटाने या प्रभावित ऊतक भाग पर उचित धुंधला रोकने के रूप में कलम ऊतक के नमूने पर चलाने के लिए अनुमति देने के लिए नहीं सावधान रहना होगा। ऊतक वर्गों को किसी भी बिंदु पर निर्जलित करने की अनुमति न दें।
  3. 5 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde समाधान के साथ ऊतक वर्गों को ठीक करें।
  4. 5 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड कुल्ला.
  5. 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.5% Triton-X 100 के साथ ऊतक वर्गों permeabilize.
  6. 5 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड कुल्ला.
  7. 3% w/v गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) और 5% v/v बकरी सीरम के साथ ऊतकों को ब्लॉक करें, दोनों PBS में (ब्लॉकिंग समाधान) कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए।
    नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी मेजबान जानवर के लिए अवरुद्ध समाधान सीरम मैच.
  8. 5 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड कुल्ला.
  9. वांछित के रूप में रिकॉर्ड रखने प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट वर्गों, संभवतः एक आम परमाणु (जैसे, DAPI), संवहनी (जैसे, CD31), या साइटोप्लाज्मिक मार्कर (जैसे, actin). यहाँ, चूहे विरोधी माउस CD31 (संवहनी मार्कर) एक 1:100 कमजोर पड़ने पर एक स्लाइड ट्रे पर निर्जलीकरण से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में अवरुद्ध समाधान में निर्माता के निर्देशों के अनुसार इस्तेमाल किया गया था.
    नोट: अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी या एंटीबॉडी संयुग्मी न जोड़ें। संयुग्मी जिसे इंजेक्शन दिया गया था और प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में विवो अधिनियम में ऊतकों में जमा करने की अनुमति दी गई थी.
  10. 5 मिनट तीन बार के लिए पीबीएस में स्लाइड कुल्ला, PBS हर बार बदल रहा है.
  11. प्राथमिक एंटीबॉडी लेबल करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट स्लाइड। इस आवेदन के लिए, विरोधी B7-H3 एंटीबॉडी AlexaFluor-546 संयुग्मी बकरी विरोधी rabbit एंटीबॉडी (1:200 कमजोर पड़ने, निर्माता के निर्देशों के अनुसार अनुकूलित) और AlexaFluor-488 बकरी विरोधी रट माध्यमिक एंटीबॉडी (1:200) के साथ CD31 का उपयोग कल्पना हल को अवरुद्ध करने में, समाधान को अवरुद्ध करने में, कम्यूशन, कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए, एक स्लाइड ट्रे पर प्रकाश और निर्जलीकरण से सुरक्षित।
    नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी एक ही मेजबान जानवर से हैं, लेकिन संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी की समानता से मेल खाते हैं। स्लाइड इस बिंदु के बाद से प्रकाश से संरक्षित हैं.
  12. 5 मिनट तीन बार के लिए पीबीएस में स्लाइड कुल्ला, PBS हर बार बदल रहा है.
  13. ऊतक टुकड़ा के केंद्र में बढ़ते माध्यम की एक बूंद लागू करें और ध्यान से हवा के बुलबुले के जाल से बचने के एक coverslip जगह है।
  14. स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करें और सूखने दें।
    नोट: इस बिंदु पर एक सप्ताह के लिए प्रोटोकॉल को थामने के लिए, आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड ्स्स संग्रहीत करें।

5. Confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और मात्रात्मक छवि विश्लेषण

नोट: confocal माइक्रोस्कोप और इमेजिंग मापदंडों की तैयारी confocal प्रणाली का इस्तेमाल किया पर निर्भर करेगा. यहाँ इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप वाणिज्यिक रूप से खरीदा गया था (उदा., ज़ीस LSM 510 मेटा प्रणाली) और संबद्ध अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (उदा., ज़ेन 2009) इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, इन चरणों के कई किसी भी confocal माइक्रोस्कोप पर लागू होते हैं और बुनियादी confocal माइक्रोस्कोपी ज्ञान ग्रहण करेंगे.

  1. के बाद प्रणाली पर दिया गया है और गर्म, वांछित उद्देश्य का चयन करें; यहाँ एक 20x (संख्यात्मक एपर्चर - 0.8) उद्देश्य का इस्तेमाल किया गया था.
  2. एक सकारात्मक नियंत्रण स्लाइड लोड, नीचे coverslip, प्रतिभाशाली संकेत के लिए अनुकूलन की स्थापना के लिए अनुमति देने के लिए. लाल चैनल में इमेजिंग, लाइव इमेजिंग मोड में नमूने पर सिस्टम ध्यान केंद्रित.
  3. प्रत्येक लेजर चैनल के लिए इस्तेमाल किया, लेजर तीव्रता, मास्टर लाभ, और pinhole आकार का अनुकूलन के रूप में इस प्रकार है:
    1. इमेजिंग के लिए सतत मोड में स्विच करें.
    2. लेजर तीव्रता का अनुकूलन (जो लेजर शक्ति को नियंत्रित करता है) और लाभ (मास्टर) (जो photomultiplier ट्यूब के लिए वोल्टेज को नियंत्रित करता है) स्लाइड सलाखों जबकि देखो ऊपर तालिका (LUT) हिस्टोग्राम की निगरानी. इन दो सेटिंग्स को तब तक समायोजित करें जब तक कि हिस्टोग्राम की डायनेमिक श्रेणी बिना सैटरेटिंग पिक्सेल के भर दी जाए.
      नोट: लेजर तीव्रता बहुत अधिक photobleaching हो जाएगा है। यदि लाभ (मास्टर) बहुत अधिक है, छवि शोर हो जाएगा. आदर्श रूप में, लाभ (मास्टर) अपनी सीमा के बीच में होगा.
    3. पिनहोल को 1 हवादार इकाई (AU) पर सेट करें, जो उच्चतम रिज़ॉल्यूशन और thinnest z-slice देता है.
    4. एक सच्चे काले रंग की पृष्ठभूमि के लिए LUT हिस्टोग्राम पर शोर मंजिल को कम करने के लिए डिजिटल ऑफसेट बार स्लाइड.
      नोट: एक बार माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स प्रत्येक लेजर चैनल और उद्देश्य के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, उन्हें इमेजिंग सत्र भर में और सभी स्लाइड के इमेजिंग के लिए स्थिर रखने के लिए, स्लाइड के बीच मात्रात्मक तुलना के लिए अनुमति देते हैं.
  4. अधिग्रहण मोड टैब के अंतर्गत, औसतके अंतर्गत वांछित संख्या और बिट गहराईका चयन करें. इष्टतम पिक्सेल आकार सेट करने के लिए इष्टतम बटन क्लिक करें।
  5. एक उच्च गुणवत्ता छवि इकट्ठा करने के लिए स्नैप अधिग्रहण बटन का प्रयोग करें। यहाँ, देखने के यादृच्छिक क्षेत्रों ट्यूमर के भीतर से चुना गया था, लेकिन ब्याज के अन्य क्षेत्रों के विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए आवेदन कर सकते हैं (वेले, ट्यूमर मार्जिन, प्रवेश गहराई, आदि)
  6. ऑफ़लाइन प्रसंस्करण और परिमाणीकरण के लिए confocal सॉफ्टवेयर (यहाँ, ".lsm") द्वारा इस्तेमाल प्रारूप में छवि फ़ाइलों को बचाओ.
    नोट: यदि सभी स्लाइड एक ही सत्र के दौरान छवि बनाई गई हैं, तो सेटिंग्स को बचाने और उन्हें बाद के दौरे पर पुनः लोड, हालांकि एक ही स्लाइड reimaging photobleaching के कारण अनुशंसित नहीं है.
  7. मात्रात्मक फ्लोरोसेंट तीव्रता माप प्रदर्शन करते हैं। ओपन फिजी (फिजी बस ImageJ सॉफ्टवेयर है)19,23 और स्थिति पट्टी पर खींचकर एक .lsm छवि फ़ाइल लोड.
  8. रंग चैनल डेटा विभाजित करें. छवि पर जाएँ gt; ढेर gt; विभाजित चैनल|
  9. आवश्यकतानुसार फ्लोरोसेंट छवियों को पूर्व प्रक्रिया करें, अर्थात, पृष्ठभूमि संकेत को घटाना(प्रक्रिया और पृष्ठभूमि घटाना) या फ़िल्टरिंग विधि के माध्यम से शोर को कम करें।
  10. संकेत तीव्रता पर एक सीमा की स्थापना करके संदर्भ प्रोटीन (संवहनी, परमाणु, सेलुलर दाग) के लिए इसी रंग चैनल खंड(छवि और समायोजित करें gt; थ्रेशहोल्ड).
    नोट: मैनुअल दहलीज छवि विश्लेषण में परापरषण का परिचय, इसलिए, एक स्वचालित दहलीज एल्गोरिथ्म का उपयोग कर या संदर्भित छवि हिस्टोग्राम छवि विश्लेषण परिणाम कम पक्षपाती बनाता है.
  11. एक बाइनरी मास्क बनाने के लिए इस थ्रेशोल्ड का उपयोग करें(प्रक्रिया gt; बाइनरी और मास्क में कनवर्ट करें)
  12. उपाय और लेबल ROIs मुखौटा के भीतर(विश्लेषण करें ; कणों का विश्लेषण करें ] प्रबंधक में जोड़ें की जाँच करें ]gt; ठीकहै )
  13. ब्याज के एंटीबॉडी के लिए इसी रंग चैनल के लिए ROIs लागू करें (चैनल छवि पर क्लिक करें, विश्लेषण ] उपकरण gt; रॉय प्रबंधक gt; उपाय). यह एंटीबॉडी छवि के लिए मुखौटा ROIs लागू होते हैं और परिणाम विंडो में लेबल वर्गों के लिए छवि माप प्रदान करेगा। परिणाम विंडो सहेजें(फ़ाइल ]gt; सहेजें).
  14. ब्याज के वांछित आँकड़ों की गणना कीजिए, जैसे यहाँ वर्णित माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता24।
  15. स्लाइड के एक सेट के भीतर प्रत्येक छवि के लिए समान सभी संसाधन चरणों को निष्पादित करें। 23 बड़े छवि बैचों केलिए ऐसा करने के लिए कोई मैक्रो बनाएँ.
  16. मात्रात्मक माप के बाद ही छवि प्रदर्शन के लिए, सभी स्लाइड्स पर समान स्तरों के लिए न्यूनतम, अधिकतम, चमक, और इसके विपरीत समायोजित करके जैव वितरण पैटर्न के दृश्य को अनुकूलित करने के लिए गुणात्मक छवि समायोजन लागू करें(छवि और समायोजित करें) और चमक /
  17. छवि प्रकार कन्वर्ट (छवि और प्रकार gt; आरजीबी रंग) और एक lossless छवि प्रकार में फ़ाइलों को बचाने के रूप में इस तरह के .tiff(फ़ाइल और सहेजें के रूप में gt; Tiff...) प्रस्तुतियों और प्रकाशनों में उपयोग के लिए.

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Representative Results

IVIL विधि यहाँ इस्तेमाल किया गया था में vivo biodistribution और B7-H3-ICG और Iso-ICG के ऊतक बातचीत की जांच करने के लिए, एजेंटों की अनुमति देकर, एक जीवित जानवर में अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद, 96 एच के लिए लक्ष्य ऊतक के साथ बातचीत करने के लिए, और फिर एक बार ऊतकों रहे हैं काटा, पूर्व vivo इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में कार्य करने के लिए। IVIL विधि भी मानक पूर्व vivo IF B7-H3 मार्कर के लिए ऊतकों के धुंधला की तुलना में किया गया था. सामान्य murine स्तन ग्रंथियों B7-H3 मार्कर व्यक्त नहीं करते, पूर्व vivo में पुष्टि की, मानक IF धुंधला, और अन्य निष्क्रिय तंत्र के माध्यम से एंटीबॉडी जमा नहीं है, और, इसलिए, B7-H3-ICG या आईएसओ-आईसीजी का कोई संचय का पता चला था, प्रतिनिधि एक नकारात्मक परिणाम का (चित्र 1,शीर्ष पंक्ति). हालांकि, murine स्तन ट्यूमर दोनों vasculature और उपकला में B7-H3 व्यक्त करते हैं (के रूप में मानक IF धुंधला द्वारा की पुष्टि की), और IVIL B7-H3-ICG एजेंट है कि vascualture पर दृढ़ता से जमा किया था और आंशिक रूप से extravasate करने में सक्षम था पर प्रकाश डाला vasculature से कैंसर की कोशिकाओं को खुद को बाँध हालांकि ट्यूमर भर में B7-H3 मार्कर की वर्दी वितरण की तुलना में एक विषम तरीके से, यह भी चित्रा 1में दिखाया गया है, नीचे पंक्ति. इसके अलावा, भले ही आईएसओ-आईसीजी एजेंट कोई आणविक विशिष्टता है, यह अभी भी एक गैर विशिष्ट फैशन में जमा दिखाया गया था, एफसी बातचीत के कारण, गरीब अंतरालीय जल निकासी, और murine स्तन के भीतर बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण प्रभाव ट्यूमर (चित्र 1)। यह अंतर दो एजेंटों के बीच दिखाए गए biodistribution पैटर्न में प्रकाश डाला है, और आगे विशिष्ट एंटीबॉडी एजेंट के विशिष्ट बाध्यकारी परिणामों को बढ़ाता है, और एक सकारात्मक परिणाम के दो संभावित परिणामों का प्रतिनिधित्व करता है.

B7-H3-ICG प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित कैसे IVIL विधि एक गुणात्मक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है सामान्य एंटीबॉडी / हालांकि, कभी-कभी, एक अधिक मात्रात्मक व्याख्या की आवश्यकता हो सकती है, या एक एंटीबॉडी अत्यधिक संवेदनशील, रचना-विशिष्ट बाध्यकारी क्षमता हो सकती है। इन स्थितियों में, IVIL भी इच्छित जानकारी प्रदान कर सकते हैं। एक दूसरे उदाहरण में, जिसमें ट्यूमर के ऊतकों में नेट्रिन-1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति और CD31-सकारात्मक ट्यूमर एंडोथेलियम के साथ इसके सह-स्थानीयकरण का अध्ययन किया जाना था, आईवीआईएल तकनीक को भी सफलतापूर्वक19लागू किया गया था।

नेट्रिन-1 एक स्रावित 65 केडीए प्रोटीन है जो कुछ प्रकार के कैंसर जैसे मेटास्टैटिक स्तन कैंसर25,26में अधिक व्यक्त किया जाता है. नेट्रिन-1 के लिए आण्विक इमेजिंग दृष्टिकोण विकसित करने के लिए प्रोटीन की इन विवो उपलब्धता का निर्धारण19करना था। इसके अलावा, के रूप में विरोधी netrin-1 एंटीबॉडी ऊतक निर्धारण के बाद अपने प्रतिजन के लिए पर्याप्त संबंध नहीं है, शास्त्रीय इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए एक वैकल्पिक धुंधला प्रोटोकॉल या यदि धुंधला की आवश्यकता थी और IVIL लागू किया गया था. मानवीकृत एंटी-नेट्रिन-1 एंटीबॉडी और एक मानव आईजीजी आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी को हृदय भ्रम और ट्यूमर संग्रह से पहले 24 एच इंजेक्शन दिया गया था। कार्डिएक perfusion vasculature में विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने के लिए और लक्ष्य अभिव्यक्ति सीमित है जब आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी संकेत की तुलना में महत्वपूर्ण विरोधी netrin-1 एंटीबॉडी संचय का पता लगाने को बढ़ाने के लिए लागू किया गया था. ट्यूमर वर्गों vasculature के साथ पूर्व vivo लेबल थे विरोधी CD31 एंटीबॉडी पर प्रकाश डाला (रैट एंटी-माउस CD31 एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका)और फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी, Alexa 488-युग्मित बकरी विरोधी चूहा IgG, 1:500 तनुता और एलेक्सा फ्लोर 594- युग्मित बकरी विरोधी मानव आईजीजी, 1:500 कमजोर पड़ने क्रमशः) विरोधी netrin-1/isotype और विरोधी CD31 mAbs प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया. विरोधी netrin-1 और आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी की फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता CD31 के साथ सह स्थानीयता धुंधला में मतभेद निर्धारित करने के लिए परिमाणित किया गया. चित्रा 2 से पता चलता है कि विरोधी netrin-1 एंटीबॉडी विशेष रूप से MMTV-PyMT स्तन ट्यूमर (एक सकारात्मक परिणाम) के उपकला ट्यूमर डिब्बे में जमा है, जबकि सामान्य स्तन ग्रंथियों में कोई संकेत नहीं था (एक नकारात्मक परिणाम). एंटीबॉडी आगे endothelial मार्कर CD31 के साथ सह स्थानीयकृत. आइसोटाइप एंटीबॉडी-इंजेक्शन ट्यूमर और सामान्य ग्रंथियों के साथ तुलना से पता चला कि उपकला संचय ट्यूमर ऊतक के लिए विशिष्ट था। नेट्रिन-1 बाइंडिंग (ट्यूमर) और गैर-विशिष्ट एफसी बातचीत (ट्यूमर और सामान्य स्तन ग्रंथियों)11के कारण ट्यूमर और सामान्य ग्रंथियों दोनों की एंडोथेलियल कोशिकाओं में संकेत संचय था। इस प्रकार, एक CD31 आधारित द्विआधारी मुखौटा का उपयोग कर फ्लोरोसेंट संकेत परिमाणीकरण की आवश्यकता थी और प्रदर्शन किया है कि विरोधी netrin-1 एंटीबॉडी संकेत ट्यूमर ऊतक में आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी संकेत से काफी अधिक था, जो netrin-1 पता चलता है विशेष रूप से ट्यूमर एंडोथेलियम में संचित.

Figure 1
चित्र 1 : सामान्य या कार्सिनोमा ऊतकों युक्त murine स्तन ग्रंथियों में विशिष्ट B7-H3 एंटीबॉडी-आईसीजी संयुग्मी और गैर-विशिष्ट आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी-आईसीजी संयुग्मी स्थानीयकरण की तुलना के प्रतिनिधि confocal micrographs। (शीर्ष) एक जानवर से सामान्य murine स्तन ग्रंथियों अंतःशिरा Iso-ICG या B7-H3-ICG (लाल) के 33 डिग्री ग्राम के साथ इंजेक्शन और सीडी 31 (हरा) के साथ काउंटर दाग एंटीबॉडी संयुग्मी का कोई दाग दिखा. सामान्य ऊतकों को मानक पूर्व vivo IF धुंधला द्वारा B7-H3 की कोई अभिव्यक्ति नहीं दिखाया गया. (बॉटम) एक जानवर से इनवेसिव स्तन ट्यूमर अंतःशिरा B7-H3-ICG या Iso-ICG (लाल) और संवहनी काउंटर दाग CD31 (हरा) के 33 डिग्री के साथ इंजेक्शन व्यापक दिखा, विषम जातीय दाग, हालांकि विभिन्न वितरण पैटर्न के साथ, दोनों B7-H3-ICG और के लिए इसो-आईसीजी एजेंट। B7-H3-ICG दृढ़ता से vascualature, विवो में संपर्क के पहले बिंदु के लिए बांधता है, और फिर विषम ट्यूमर उपकला दाग करने के लिए vasculature से extravasate करने में सक्षम है। आईएसओ-आईसीजी ट्यूमर के ऊतकों के भीतर गैर-विशिष्ट संचय दिखाता है। मानक पूर्व vivo IF धुंधला उपकला और endothelial कोशिकाओं पर B7-H3 मार्कर की एक समान अभिव्यक्ति से पता चलता है. पीला रंग सह स्थानीयलाल और हरे चैनल संकेत इंगित करता है. स्केल बार 100 डिग्री मीटर और पैनलों के बीच संगत है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 2
चित्र 2 : MMTV-PyMT स्तन ट्यूमर में netrin-1 के vivo इम्यूनो-स्थानीयकरण में। (बाएं) murine कार्सिनोमा और सामान्य स्तन ग्रंथियों में netrin-1 अभिव्यक्ति (लाल) या आइसोटाइप नियंत्रण अभिव्यक्ति (लाल) का पता लगाने के लिए IVIL विधि के प्रतिनिधि confocal micrographs. IVIL MMTV-PyMT ट्यूमर में netrin-1 के लिए उपकला संकेत की पुष्टि करता है, लेकिन सामान्य स्तन ग्रंथियों में नहीं, और endothelial कोशिकाओं पर मजबूत netrin-1 संकेत (CD31 धुंधला, हरी) स्तन ट्यूमर में और सामान्य स्तन ग्रंथियों में नेट्रिन-1 के काफी कमजोर संकेत. पीला रंग सह स्थानीयलाल और हरे चैनल संकेत इंगित करता है. स्केल बार 20 डिग्री मीटर का संकेत देते हैं। ट्यूमर endothelium में netrin-1 प्रोटीन का पता लगाने के लिए, प्राथमिक मानवीय NET1-H-mAb या मानव आईजीजी आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी के 100 डिग्री ग्राम के 100 डिग्री ट्यूमर संग्रह से पहले नसों में इंजेक्शन थे 24 एच. स्वतंत्र रूप से घूम एंटीबॉडी पीबीएस और ट्यूमर ऊतक के साथ कार्डियक भ्रम द्वारा हटा दिया गया था अलग, फ्लैश जमे हुए, और एक cryostat पर 15 डिग्री मीटर मोटाई पर काट दिया. Endothelial कोशिकाओं प्राथमिक चूहे विरोधी माउस CD31 एंटीबॉडी माध्यमिक Alexa 488-युग्मित बकरी विरोधी rat IgG द्वारा पीछा के साथ लेबल थे. नेट्रिन-1 को लक्षित करने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी को प्रकट करने के लिए, माध्यमिक एलेक्सा फ्लोर 594-युग्मित बकरी एंटी-मानव आईजीजी का उपयोग किया गया था। बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी के विशिष्ट बातचीत से बचने के लिए, ऊतक के नमूने बकरी सीरम के साथ अवरुद्ध थे. (दाएं) बार ग्राफ विरोधी netrin-1 या आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी संकेत है कि विरोधी CD31 एंटीबॉडी संकेत के साथ colocalizes के परिमाण पर प्रकाश डाला. सामान्य ग्रंथियों के समूह प्रति एमएमटीवी-PyMT और N $7 स्तन ग्रंथियों (एक माउस के) के समूह के प्रति N$13 ट्यूमर (दो चूहों की); SEM वर्तमान त्रुटि पट्टियाँ; दो समूह तुलना छात्र टी परीक्षण के साथ प्रदर्शन किया गया. चित्रा क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) के तहत 19 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस विधि में कई महत्वपूर्ण चरण हैं और सफल कार्यान्वयन सुनिश्चित करने के लिए संभावित संशोधनों की आवश्यकता है। सबसे पहले, एंटीबॉडी की खुराक और समय / एंटीबॉडी संयुग्मी अंतःशिरा इंजेक्शन विशिष्ट आवेदन करने के लिए सिलवाया जाना चाहिए। आम तौर पर, खुराकों का उपयोग किया जाना चाहिए कि कैसे एंटीबॉडी संयुग्मी आम तौर पर इस्तेमाल किया जाएगा के साथ संगत कर रहे हैं, यानी, चिकित्सीय एंटीबॉडी या एंटीबॉडी आधारित विपरीत एजेंट के खुराकों मिलान. इसके अलावा, लक्ष्य ऊतकों के संग्रह के समय पर सावधानी से विचार किया जाना चाहिए। एंटीबॉडी और एंटीबॉडी संयुग्मी मानक दवाओं और विपरीत एजेंटों की तुलना में लंबे समय तक परिसंचरण समय है, हालांकि, ये अत्यधिक चर रहे हैं और वांछित आवेदन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, लेकिन यह कम से कम 24 एच परिसंचरण समय 27 की अनुमति देने के लिए सिफारिश की है . दूसरा, लक्ष्य ऊतक संग्रह के दौरान, यह रक्त पूल19से स्वतंत्र रूप से घूम एंटीबॉडी को दूर करने के लिए एक intracardiac perfusion तकनीक को लागू करने के लिए आवश्यक हो सकता है. जबकि B7-H3-ICG के ट्यूमर वितरण को देख, यह पर्याप्त लंबे परिसंचरण समय (96 एच) और एजेंट के अतिरिक्त संवहनी स्थानीयकरण के कारण अनावश्यक पाया गया. हालांकि, आईवीआईएल विधि के netrin-1 आवेदन के लिए, हृदय भ्रम netrin-1 और इसके अपेक्षाकृत कम अभिव्यक्ति स्तर के endothelial अभिव्यक्ति के कारण उचित माना गया था. तीसरा, पूर्व vivo ऊतक धुंधला के दौरान यह किसी भी स्लाइड है कि एक ही सत्र के दौरान मात्रात्मक तुलना की जाएगी और एक ही समाधान के साथ सामान्य अंतर बैच विविधताओं को रोकने के दाग के लिए जरूरी है. सुनिश्चित करें कि स्लाइड्स को कदमों के बीच ठीक से कुल्ला किया जाता है और हाइड्रोफोबिक पेन समाधान उपऑप्टिमल धुंधला से बचने के लिए ऊतक के संपर्क में नहीं आता है। अंत में, confocal माइक्रोस्कोपी के दौरान, रिश्तेदार परिमाणीकरण के लिए अनुमति देने के लिए स्लाइड के बीच एक ही इमेजिंग सेटिंग्स बनाए रखने और स्लाइड के photobleaching को रोकने के लिए जल्दी से काम करते हैं. इन प्रमुख बिंदुओं को एक सफल IVIL कार्यान्वयन की संभावना में वृद्धि होगी.

IVIL विधि के लिए कई लाभ हैं। सबसे पहले, जबकि विधि मानक IF तकनीकों के समान है, दो काफी अलग जानकारी प्रदान करते हैं. यदि धुंधला एक निश्चित समय बिंदु पर ऊतक के भीतर आणविक मार्करों के शारीरिक स्थान को इंगित करता है (जब ऊतक एकत्र और तय किया गया था). हालांकि, IVIL कैसे एक एंटीबॉडी या एंटीबॉडी संयुग्मी, B7-H3-ICG के स्थानीयकरण द्वारा प्रदर्शन के रूप में, वितरण और बातचीत है, चाहे वह विशिष्ट या गैर विशिष्ट संचय, internalization, या लक्ष्य में प्रतिधारण हो पर जानकारी प्रदान करता है ऊतक. यह फार्माकोकाइनेटिक/गतिशील और जैव वितरण अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, पारंपरिक IF तरीके हैं, कभी कभी, ऊतकों जो प्रतिजन विरूपण या प्राथमिक एंटीबॉडी28द्वारा बाध्यकारी रोकने मास्किंग पैदा कर सकता है के निर्धारण द्वारा सीमित. इसलिए, IVIL उपयोगी हो सकता है जब मानक यदि धुंधला या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विफल हो। IVIL तकनीक अन्यथा undetectable होगा कि vivo एंटीबॉडी गतिविधि में सत्यापित करने के लिए एक पूरक विधि माना जा सकता है. अंत में, पारंपरिक IF धुंधला तकनीक से परिचित उन विधि निष्पादन में सीधा मिल जाएगा और हाथ पर आवश्यक सामग्री के सबसे होगा.

IVIL विधि कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, लक्ष्य ऊतकों फसल के लिए पशु इच्छामृत्यु की आवश्यकता के कारण, IVIL केवल एक ही समय बिंदु पर जैविक बातचीत की जानकारी प्रदान करता है. विभिन्न जानवरों में अलग-अलग समय बिंदुओं पर प्राथमिक एंटीबॉडी या एंटीबॉडी संयुग्मी का इंजेक्शन जैव वितरण पर और विवो बातचीत में जानकारी की एक व्यापक समय खिड़की के लिए अनुमति देगा। दूसरा, यदि उपयोगकर्ता विवो पशु तकनीकों में अपरिचित हैं, जैसे अंतःशिरा पूंछ नस इंजेक्शन या संभावित इंट्राकार्डियक भ्रम, यह विधि के लिए एक सीमा हो सकती है। इन विधियों मज़बूती से प्रदर्शन करने के लिए कुशल कर्मियों की आवश्यकता है. हालांकि, पूंछ नस इंजेक्शन के दौरान एक कैथेटर का उपयोग उचित सुई स्थान इंजेक्शन से पहले की पुष्टि की जा सकती है के रूप में पूरी खुराक के प्रशासन सुनिश्चित करता है। इसके अतिरिक्त, पूंछ नस इंजेक्शन है कि विचार किया जा सकता है के लिए एक विकल्प रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन है, जो आम तौर पर कम अनुभवी कर्मियों के साथ एक उच्च सफलता दर है. दाग और छवि के लिए एक ही बैच में सभी ऊतक स्लाइड की जरूरत मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के लिए नमूने और मार्करों है कि एक ही अध्ययन में शामिल किया जा सकता है की संख्या को सीमित करता है. अध्ययन के लिए अलग अलग दिनों पर और आसन्न ऊतक स्लाइस पर सीरियल धुंधला में आयोजित करने के लिए वांछित जानकारी इकट्ठा करने की आवश्यकता हो सकती है. अंत में, प्रजातियों से मेल खाने वाले एंटीबॉडी का उपयोग, यानी, murine पूर्व नैदानिक मॉडल में murine विरोधी माउस एंटीबॉडी, माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि का एक मुद्दा उठाती है। इस प्रकार, इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रजातियों-मिसमैच्ड प्राथमिक एंटीबॉडी के उपयोग की आवश्यकता है, या फ्लोरोसेंट लेबल वाली प्रजातियों-मिलान प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करना होगा।

IVIL तकनीक कई अनुप्रयोगों के लिए नैदानिक और चिकित्सीय एंटीबॉडी के जैव वितरण विश्लेषण के लिए उपयोगी है। अंतःशिरा एंटीबॉडी या लिगेंड इंजेक्शन और पूर्व vivo ऊतक विश्लेषण के लिए विभिन्न अनुप्रयोगों पहले सूचित किया गया है और ब्याज की पुष्टि करने के लिए व्यापक रूप से इस धुंधला प्रक्रिया परिचय. रॉबर्टसन और उनके सहयोगियों ने एंडोथेलियल केशिकाओं और लाइकोपर्सिकन एस्कुलेन्टम एग्लूटिनिन (टमाटो लैक्टिन)29के अंतःशिरा इंजेक्शन के साथ बड़े जहाजों जैसे संवहनी तत्वों को लेबल किया। तकनीक हिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के साथ संगत था और संवहनी पैटर्न और कार्यात्मक पैरेन्काइमल विशेषताओं से पता चला। हालांकि, फ्लोरोसेंट लिगन्ड्स का उपयोग इंजेक्शन30पर फ्लोरोसेंट की तेजी से गिरावट तक सीमित था। IVIL प्रोटोकॉल में प्रदर्शन के रूप में, एक माध्यमिक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ पूर्व vivo लेबलिंग के बाद vivo में एक प्राथमिक एंटीबॉडी का इंजेक्शन एक और अधिक मजबूत दृष्टिकोण हो सकता है. विवो IF धुंधला के इस प्रकार का एक और दिलचस्प आवेदन के रूप में एंडरसन और उनके सहयोगियों द्वारा प्रदर्शित इंट्रावास्कुलर लिम्फोसाइटों की लेबलिंगहै 31. अंतःशिरा इंजेक्शन एंटीबॉडी रक्त वाहिकाओं में स्थानीय लिम्फोसाइटों लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जो बाद में एकत्र किए गए थे और आगे प्रतिरक्षा मार्करों के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए संसाधित. अंत में, एंटीबॉडी चिकित्सा के वितरण और हिस्टोलॉजिकल स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए जो सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNSCC) के साथ रोगियों को दिया गया था, एंटीबॉडी वितरण का पहला मानव अध्ययन व्यवस्थित रूप से किया गया था के पास प्रशासित-infrared फ्लोरोसेंटली लेबल चिकित्सकीय एंटीबॉडी cetuximab-IRDye800CW32| डेटा हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के साथ तुलना में थे और पता चला कि फ्लोरोसेंट संकेत विशिष्टता की पुष्टि ट्यूमर से दूरी के साथ कमी आई. हालांकि, चिकित्सीय एंटीबॉडी प्रतिजन अभिव्यक्ति के सभी क्षेत्रों तक नहीं पहुंची, विशेष रूप से एपिडर्मल विकास कारक रिसेप्टर (ईजीएफआर) प्रतिजन के उच्च स्तर के साथ अच्छी तरह से विभेदित ट्यूमर क्षेत्रों। कैंसर अनुसंधान के वर्तमान संदर्भ में लक्षित चिकित्सा और इम्यूनोथैरेपी जो मजबूत प्रतिरोध और प्रभावकारिता की कमी मुठभेड़ के विकास पर ध्यान केंद्रित, IVIL विधि चिकित्सीय एंटीबॉडी के वितरण का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण होगा जैसे पीडी-1/पीडी-एल-1 या HER233,34. इन परिणामों को समझने के लिए क्यों लक्षित चिकित्सा उपन्यास दृष्टिकोण के विकास को बढ़ावा देने के कुछ मामलों में प्रभावी रहे हैं अत्यंत मूल्यवान हैं. एक साथ लिया, इन उदाहरणों IVIL दृष्टिकोण के संभावित महत्व पर प्रकाश डाला.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम चर्चा और उपकरणों के उपयोग के लिए डॉ एंड्रयू ओल्सन (स्टैनफोर्ड न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी सेवा) धन्यवाद। हम डॉ Juergen के विलमैन उनकी सलाह के लिए धन्यवाद. इस अध्ययन NIH R21EB022214 अनुदान (KEW), NIH R25CA118681 प्रशिक्षण अनुदान (KEW), और NIH K99EB023279 (KEW) द्वारा समर्थित किया गया था. स्टैनफोर्ड न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी सेवा NIH NS069375 द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal Model
FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J The Jackson Laboratory 002374 Females, 4-6 weeks of age
Animal Handling Supplies
27G Catheter VisualSonics Please call to order Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit
Alcohol Wipes Fisher Scientific 22-246073
Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) Cardinal Health 2913
Heat Lamp Morganville Scientific  HL0100
Isoflurane Henry Schein Animal Health 29404
Ophthalmic Ointment Fisher Scientific NC0490117
Surgical Tape 3M 1530-1
Tissue Collection
Disposable Base Molds Fisher Scientific 22-363-556
Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium Fisher Scientific 23-730-571
Surgical London Forceps Fine Science Tools 11080-02
Surgical Scissors Fine Science Tools 14084-08
Antibodies
AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG Life Technologies A-11006
AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG Life Technologies A-11010
AlexaFluor-594 goat anti-human IgG Life Technologies A11014
Human IgG Isotype Control Novus Biologicals NBP1-97043
Humanized anti-netrin-1 antibody  Netris Pharma contact@netrispharma.com
Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) Abcam ab134161 EPNCIR122 Clone
Rat anti-Mouse CD31 BD Biosciences 550274 MEC 13.3 Clone
Reagents
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Clear Nail Polish Any local drug store
Indocyanine Green - NHS Intrace Medical ICG-NHS ester
Mounting Medium ThermoFisher Scientific TA-006-FM
Normal Goat Serum Fisher Scientific ICN19135680
Paraformaldehyde (PFA) Fisher Scientific AAJ19943K2
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 14190250
Triton-X 100 Sigma-Aldrich T8787
Supplies
Adhesion Glass Slides VWR 48311-703
Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
Glass Cover Slips Fisher Scientific 12-544G
Hydrophobic Barrier Pen Ted Pella 22311
Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-402-25
Slide Staining Tray VWR 87000-136
Software
FIJI LOCI, UW-Madison. Version 4.0 https://fiji.sc/

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References

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Wischhusen, J. C., Wilson, K. E. In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research. J. Vis. Exp. (151), e59810, doi:10.3791/59810 (2019).

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