Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

في فيفو الفلورة المناعية توطين لتقييم التوزيع الحيوي للجسم المضاد العلاجي والتشخيصي في أبحاث السرطان

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59810
Automatic Translation
1, 2
1Apoptosis, Cancer and Development Laboratory - Equipe labellisée 'La Ligue', LabEx DEVweCAN, Centre de Cancérologie de Lyon, INSERM U1052-CNRS UMR5286, Centre Léon Bérard, 2Department of Radiology/Molecular Imaging Program at Stanford, School of Medicine, Stanford University

Summary

يمكن استخدام طريقة توطين المناعة في الجسم الحي (IVIL) لفحص في التوزيع البيولوجي في الجسم الحي للأجسام المضادة وكدمات الأجسام المضادة لأغراض الأورام في الكائنات الحية باستخدام مزيج من استهداف الورم في الجسم الحي وتلطيخ المناعة في الجسم الحي اساليب.

Abstract

الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) هي أدوات هامة في الكشف عن السرطان وتشخيصه وعلاجه. وهي تستخدم لكشف دور البروتينات في تكوين الأورام، ويمكن توجيهها إلى العلامات الحيوية للسرطان تمكين الكشف عن الورم والتوصيف، ويمكن استخدامها لعلاج السرطان كما mAbs أو الأجسام المضادة للأدوية المتقارنة لتنشيط الخلايا المُنفِّذة المناعية، لمنع إشارات مسارات، أو قتل مباشرة الخلايا التي تحمل مستضد معين. على الرغم من التقدم السريري في تطوير وإنتاج mAbs جديدة ومحددة للغاية، يمكن أن تضعف التطبيقات التشخيصية والعلاجية من تعقيد وعدم تجانس البيئة الدقيقة الورم. وهكذا، لتطوير العلاجات والتشخيصات الفعالة القائمة على الأجسام المضادة، من الأهمية بمكان تقييم التوزيع الحيوي والتفاعل بين المتقارن القائم على الأجسام المضادة مع البيئة الدقيقة للورم الحي. هنا، ونحن نصف في فيفو الفلورة توطين (IVIL) كنهج جديد لدراسة تفاعلات العلاجات القائمة على الأجسام المضادة والتشخيص في الظروف الفسيولوجية والمرضية في الجسم الحي. في هذه التقنية، يتم حقن جسم مضاد علاجي أو تشخيصي خاص بالمستضد عن طريق الوريد في الجسم الحي والجسم الحي السابق المترجم مع جسم مضاد ثانوي في أورام معزولة. وبالتالي، فإن IVIL يعكس التوزيع البيولوجي في الجسم الحي للأدوية المضادة وعوامل الاستهداف. ويرد وصف اثنين من تطبيقات IVIL تقييم التوزيع البيولوجي وإمكانية الوصول إلى عوامل التباين المستندة إلى الأجسام المضادة للتصوير الجزيئي لسرطان الثدي. سيسمح هذا البروتوكول للمستخدمين المستقبليين بتكييف طريقة IVIL لتطبيقات البحوث المستندة إلى الأجسام المضادة الخاصة بهم.

Introduction

الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAb) هي بروتينات سكرية كبيرة (حوالي 150 كيلودا) من الأسرة الفائقة المناعية التي تفرزها الخلايا B ولها وظيفة أولية في الجهاز المناعي لتحديد وتمنع إما الوظيفة البيولوجية، أو علامة ل تدمير، ومسببات الأمراض البكتيرية أو الفيروسية، ويمكن التعرف على التعبير البروتين غير طبيعي على الخلايا السرطانية1. الأجسام المضادة يمكن أن يكون لها تقارب عالية للغاية إلى epitopes محددة وصولا الى تركيزات femtomolar مما يجعلها أدوات واعدة للغاية في الطب الحيوي2. مع تطوير تكنولوجيا الهجن من قبل ميلشتاين وKöhler (منحت جائزة نوبل في عام 1984)، أصبح إنتاج mAbs ممكن3. في وقت لاحق، تم إنشاء mAbs الإنسان باستخدام تكنولوجيا عرض phage أو سلالات الماوس المعدلة وراثيا وأحدثت ثورة في استخدامها كأدوات بحثية جديدة والعلاج4،5.

السرطان هو قضية صحية في جميع أنحاء العالم وسبب رئيسي للوفاة خلق الحاجة إلى نهج جديدة للوقاية والكشف والعلاج6. وحتى الآن، سمح الـ mAbs باستخراج دور الجينات وبروتيناتها في تكوين الأورام، وعندما تكون موجهة ضد العلامات الحيوية للسرطان، يمكن أن تمكن من الكشف عن الأورام وتحديد خصائص طبقات المريض. لعلاج السرطان، يتم تطوير mAbs ثنائية محددة، وكدمات الأجسام المضادة للمخدرات، وشظايا الأجسام المضادة أصغر كعلاجات، ولتسليم المخدرات المستهدفة لتعزيز الفعالية العلاجية7. بالإضافة إلى ذلك، تعمل الأجسام المضادة لاستهداف العلامات الحيوية لعوامل التباين لطرائق التصوير الجزيئي مثل الجراحة الموجهة بالفلورة، والتصوير الصوتي الضوئي (PA)، والتصوير الجزيئي بالموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة)، وانبعاث البوزيترون المستخدم سريرياً التصوير المقطعي (PET) أو انبعاث فوتون واحد التصوير المقطعي المحوسب (SPECT)8. وأخيرا، يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة كعوامل ثيرانوستيك تمكين الطبقية من المرضى ورصد الاستجابة للعلاجات المستهدفة9. ولذلك، بدأت mAbs رواية تلعب دورا حاسما في الكشف عن السرطان، والتشخيص، والعلاج.

على الرغم من التقدم الحاسم في تطوير وإنتاج mAbs جديدة ومحددة للغاية، يمكن أن تصبح التطبيقات التشخيصية والعلاجية غير فعالة بسبب تعقيد بيئة الورم. تفاعلات الأجسام المضادة تعتمد على نوع الظهارة،أي، سواء كان خطيًا أو توافقيًا10. بالإضافة إلى الاعتراف بالمستضدات ، تحتاج الأجسام المضادة إلى التغلب على الحواجز الطبيعية مثل جدران الأوعية ، والأغشية القاعدية ، والورم ستروما للوصول إلى الخلايا المستهدفة التي تعبر عن المستضد. الأجسام المضادة تتفاعل مع الأنسجة ليس فقط من خلال متغير جزء مستضد ملزم (فاب) المجال ولكن أيضا من خلال جزء بلوري ثابت (Fc) مما يؤدي كذلك إلى التفاعلات خارج الموقع11. كما أن الاستهداف معقد بسبب التعبير غير المتجانس لعلامات الورم في جميع أنحاء الجزء الأكبر من الورم وعدم التجانس في الأوعية الدموية الورم ية ونظام اللمفاويات12،13. وبالإضافة إلى ذلك، يتكون الورم microenvironment من الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان التي تدعم الخلايا السرطانية، والخلايا المناعية الورم التي تقمع ردود الفعل المناعية المضادة للورم، والبطانة الورم الذي يدعم نقل الأكسجين والمواد الغذائية، وجميع التي تتداخل مع اختراق وتوزيع وتوافر العلاجات القائمة على الأجسام المضادة أو التشخيص. بشكل عام، يمكن أن تحد هذه الاعتبارات من الفعالية العلاجية أو التشخيصية، والحد من استجابة العلاج، وقد تؤدي إلى مقاومة الورم.

لذلك، لتطوير العلاجات والتشخيصات الفعالة القائمة على الأجسام المضادة، من الأهمية بمكان تقييم التوزيع الحيوي والتفاعل بين المتقارن القائم على الأجسام المضادة داخل البيئة الدقيقة للورم. حاليا، في الدراسات ما قبل السريرية، يتم تحليل التعبير علامة في نماذج البحوث الورم في الجسم الحي السابق عن طريق الفلورة المناعية (IF) تلطيخ أقسام الورم14. يتم تنفيذ تلطيخ IF القياسية مع الأجسام المضادة الأولية محددة علامة والتي يتم تسليط الضوء عليها بعد ذلك من قبل الأجسام المضادة الثانوية وصفت الفلورسنت على شرائح الأنسجة الورم ية في الجسم الحي السابق التي تم عزلها عن الحيوان. تسلط هذه التقنية الضوء على الموقع الثابت للعلامة في وقت تثبيت الأنسجة ولا توفر نظرة ثاقبة حول كيفية توزيع أو تفاعل العلاجات أو التشخيصات المستندة إلى الأجسام المضادة في الظروف الفسيولوجية. التصوير الجزيئي من قبل PET، SPECT، الولايات المتحدة، والسلطة الفلسطينية يمكن أن توفر معلومات حول توزيع عامل التباين الأجسام المضادة المترافقة في النماذج الحية قبل السريرية8،15. وبما أن طرائق التصوير هذه غير غازية، يمكن إجراء دراسات طولية، كما يمكن جمع بيانات حساسة للوقت مع الحد الأدنى من عدد الحيوانات لكل مجموعة. ومع ذلك، هذه النهج التصوير الجزيئي غير الغازية ليست حساسة بما فيه الكفاية وليس لديها ما يكفي من القرار لتوطين توزيع الأجسام المضادة على المستوى الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم تغيير الخصائص الفيزيائية والبيولوجية للجسم المضاد الأولي بشكل جذري عن طريق اقتران عامل التباين16.

من أجل أخذ الظروف الفسيولوجية والمرضية في الجسم الحي في الاعتبار كيفية تفاعل العلاجات والتشخيصات القائمة على الأجسام المضادة داخل بيئة الورم والحصول على توزيع خلوي عالي الدقة وحتى دون الخلوية ملامح الأجسام المضادة غير المترافقة، نقترح نهج IF، يعتبر في توطين المناعة في الجسم الحي (IVIL)، الذي يتم حقن الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد عن طريق الوريد في الجسم الحي. وينتقل العلاج أو التشخيص القائم على الأجسام المضادة، الذي يعمل كجسم مضاد أساسي، في الأوعية الدموية الوظيفية ويربط بالبروتين المستهدف في بيئة الورم الحية الدقيقة للغاية. بعد عزل الأورام التي تحمل اسم الجسم الحي مع الأجسام المضادة الأولية، يتم استخدام جسم مضاد ثانوي لتوطين الكدمات المتراكمة والاحتفاظ بها. هذا النهج يشبه نهج علم الأنسجة IF وصفها سابقا حقن الأجسام المضادة المسمى الفلورسنت17. على الرغم من هنا، فإن استخدام الأجسام المضادة غير المترافقة يتجنب التغيير المحتمل في خصائص التوزيع البيولوجي الناجم عن تعديل الأجسام المضادة. وعلاوة على ذلك، فإن تطبيق الجسم الحي السابق للجسم المضاد الثانوي الفلورسنت يتجنب احتمال فقدان إشارة الفلورة أثناء جمع الأنسجة ومعالجتها ويوفر تضخيم كثافة إشارة الفلورة. يعكس نهج وضع العلامات لدينا في التوزيع البيولوجي في الجسم الحي للأدوية المستندة إلى الأجسام المضادة والعوامل المستهدفة ويمكن أن يوفر رؤى هامة لتطوير عوامل تشخيصية وعلاجية جديدة.

هنا، نقوم بوصف تطبيقين لطريقة IVIL كما تم تطبيقها في الدراسات السابقة التي تحقق في التوزيع البيولوجي وإمكانية الوصول إلى عوامل التباين المستندة إلى الأجسام المضادة لطرق التصوير الجزيئي للكشف عن سرطان الثدي. أولاً، التوزيع الحيوي لصبغة الأشعة تحت الحمراء القريبة من الأجسام المضادة (الأجسام المضادة للأشعة تحت الحمراء- H3 المرتبطة بصبغة الفلورة بالأشعة تحت الحمراء القريبة، والأخضر الإندوذيانين، وB7-H3-ICG) وعامل التحكم في نوع الإيزوتايب (Iso-ICG) للفلورة والجزيئية الصوتية الضوئية يتم استكشاف التصوير18. يتم وصف أسلوب هذا التطبيق في البروتوكول. بعد ذلك، يتم تحديد نتائج التوزيع الحيوي لجسم مضاد حساس بشكل متزامن إلى netrin-1، عادة لا يمكن الكشف عنها مع التصوير IF التقليدي، المستخدم مع التصوير الجزيئي بالموجات فوق الصوتية، ويتم عرضها في النتائج التمثيلية19. في ختام هذه الورقة البروتوكول، يجب أن يشعر القراء بالراحة اعتماد طريقة IVIL لتطبيقات البحوث المستندة إلى الأجسام المضادة الخاصة بهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل الفريق الإداري المؤسسي المعني بالعناية بالحيوانات المختبرية (APLAC) من جامعة ستانفورد.

1. نموذج الماوس المعدلة وراثيا لتطوير سرطان الثدي

  1. مراقبة الفئران من نموذج السرطان المطلوب لنمو الورم المناسب عن طريق قياس الجس أو الفرجار قبل المضي قدما.
    ملاحظة: هنا، تم استخدام نموذج المورين المعدلة وراثيا من تطوير سرطان الثدي (FVB / N-Tg (MMTV-PyMT) 634Mul/J) (MMTV-PyMT). هذه الحيوانات تلقائيا تطوير سرطان الثدي الغازية بين 6 و 12 أسبوعا من العمر في كل غدة الثدي20. وقد استخدمت الغدد الثديية الطبيعية كضوابط من القمامة عبر الجينات السلبية، ومطابقة العمر.

2. الحقن الوريدي لعوامل الأجسام المضادة محددة وغير محددة

  1. تنقية الأرنب المضادة للماوس B7-H3 والأرنب IgG الأجسام المضادة للتحكم isotype على عمود إزالة الأملاح (على سبيل المثال، PD-10) لإزالة المواد الحافظة ومخازن التخزين المؤقتة بعد تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: قد تحتاج بعض الأجسام المضادة إلى مزيد من التنقية مع الخرز البروتين-A أغاروز على أساس بروتوكول21.
  2. جرعات Aliquot من 33 ميكروغرام من كل جسم مضاد متقارن في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة الفردية.
    ملاحظة: الجرعة من وكيل تدار قد تختلف اعتماداً على التطبيق ويطابق الجرعات التي يتم استخدام conjugate الأجسام المضادة بشكل روتيني. مطلوب تركيز حلول الأجسام المضادة إذا كان حجم أكثر من 100 درجة مئوية لسلامة الحيوان.
  3. في النقطة الزمنية المطلوبة قبل جمع الأنسجة، هنا 96 ح، التخدير الحيوان تحمل الورم مع 2٪ isoflurane تتدفق في الأكسجين في 2 L / دقيقة، ووضع على مرحلة ساخنة 37 درجة مئوية. قم بقرصة اصبع القدم للتأكد من الوصول إلى المستوى المناسب من التخدير قبل الإجراء.
  4. للتحضير لتلقيح الوريد الذيل من حلول الأجسام المضادة، وتطهير ذيل الحيوان عن طريق مسح ثلاث مرات مع مسح الكحول. تمدد الأوردة التيل عن طريق الاحترار مع وسادة الحرارة لمدة 30 s. تجنب تسخين الحيوان بأكمله. مسح الذيل مرة أخرى مع مسح الكحول بعد إزالة وسادة الحرارة.
  5. باستخدام قسطرة الوريد الذيل 27G، أدخل إبرة الفراشة في واحدة من الأوردة ذيل الجانبية اثنين وإصلاح بعناية الذيل مع إبرة إدراجها إلى المرحلة مع قطعة من الشريط الجراحي.
    ملاحظة: يشير تدفق الدم المرئي إلى القسطرة إلى الموقع الصحيح للإبرة داخل الوريد الذيل.
  6. اغسل القسطرة بـ 25 ميكرولتر من محلول ملحي معقم من الفوسفات (PBS)، ثم قم بحقن محلول الأجسام المضادة في القسطرة باستخدام محاقن الأنسولين. اغسل القسطرة مرة أخرى بـ 25 ميكرولتر من PBS المعقمة.
  7. إزالة الإبرة من الذيل وتطبيق الضغط لوقف أي نزيف.
  8. إيقاف التخدير ومراقبة الحيوان حتى مستيقظا تماما عن أي علامات الشدة.

3. جمع وإعداد أنسجة الورم المستهدفة

  1. في النقطة الزمنية المطلوبة، قتل الحيوان إنسانيا وفقا للإجراء المؤسسي المقبول، هنا، عن طريق الاستنشاق التدريجي ل100٪ من ثاني أكسيد الكربون2 من خزان غاز مضغوط مع معدل تدفق الإزاحة غرفة من 10-30٪ حجم / دقيقة.
    ملاحظة: تتطلب بعض تطبيقات تقنية IVIL القتل الرحيم عن طريق التسريب القلبي مع PBS لإزالة الأجسام المضادة المتداولة بحرية19،22.
  2. بعد تأكيد القتل الرحيم الإنساني عن طريق وقف الحركة التنفسية والقلبية، وعدم استجابة قرصة اصبع القدم، والرمادي من الأغشية المخاطية، وأنسجة الورم المكوس باستخدام مقص الجراحية والملقط على النحو التالي:
    1. وضع الماوس في موقف supine واستيعاب فقط الطبقة الخارجية من الجلد بين مجموعة من الغدد الثديية الأقرب إلى الذيل (5ال)مع ملقط، وجعل شق صغير مع زوج من مقص الجراحية.
    2. إدخال مقص مغلق في قطع وفتح ببطء غيض لفصل الجلد بعناية من غشاء جدار البطن الكامنة الحفاظ على سليمة.
    3. إجراء شق عمودي في البطن، والاستمرار في فصل الجلد عن الغشاء الداخلي. بينالغدد الثديية الثالثة والرابعة، قم بإجراء قطع أفقي عبر البطن للسماح بتراجع الجلد وتصور الغدد الثديية.
      ملاحظة: تقع الأورام والغدد الثديية بشكل سطحي تحت الجلد.
    4. فهم كل ورم أو غدة طبيعية مع ملقط، وتقليم بعناية بعيدا الجلد المرفقة باستخدام مقص الجراحية.
  3. وضع الأنسجة المقتطعة في قوالب قاعدة الأنسجة القابل للتصرف، والمسمى مسبقا ومليئة درجة الحرارة القطع الأمثل (OCT) تضمين المتوسطة وتجميد القوالب بسرعة عن طريق وضع على الجليد الجاف. من أجل دراسة التسليم خارج الهدف، استئصال الأنسجة الأخرى أو الأجهزة ذات الأهمية(علىسبيل المثال، الكبد أو الرئتين).
    ملاحظة: لإيقاف البروتوكول مؤقتاً عند هذه النقطة تخزين كتل الأنسجة المجمدة في -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة.
  4. باستخدام cryostat، قسم كتل الأنسجة المجمدة في سمك 10 درجة مئوية ووضع المقاطع المجاورة على الشرائح الزجاج التصاق المسمى مسبقا.
    ملاحظة: لإيقاف البروتوكول مؤقتاً عند هذه النقطة تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للمتابعة.

4. السابقين بروتوكول تلطيخ الجسم الحي

ملاحظة: للمقارنة الكمية بين الصور المجهرية الفلورية، يتم تلوين كافة الشرائح في نفس الوقت مع نفس الحلول المعدة.

  1. شطف الشرائح الأنسجة المجمدة مع درجة حرارة الغرفة PBS لمدة 5 دقائق لإزالة OCT.
  2. إزالة حدود أقسام الأنسجة مع قلم حاجز كاره للماء للحد من حجم الحلول اللازمة أثناء تلطيخ.
    ملاحظة: يجب الحرص على عدم السماح للقلم لتشغيل أكثر من عينات الأنسجة كما أنه قد إما إزالة الأنسجة من الشريحة أو منع تلطيخ السليم على جزء الأنسجة المتأثرة. لا تسمح لأقسام الأنسجة بالجفاف في أي وقت.
  3. إصلاح أقسام الأنسجة مع 4٪ حل بارافورمالدهايد لمدة 5 دقائق.
  4. شطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق.
  5. أقسام الأنسجة نفاذية مع 0.5٪ تريتون-X 100 في PBS لمدة 15 دقيقة.
  6. شطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق.
  7. سد الأنسجة مع 3٪ ث / الخامس الزلال المصل البقري (BSA) و 5٪ الخامس / الخامس مصل الماعز، وكلاهما في PBS (حل حجب) لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تطابق المصل حل حظر إلى الحيوان المضيف الأجسام المضادة الثانوية.
  8. شطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق.
  9. احتضان الأقسام مع الأجسام المضادة الأولية لحفظ السجلات على النحو المطلوب، وربما النووية المشتركة (على سبيل المثال، DAPI)، والأوعية الدموية (على سبيل المثال، CD31)، أو علامة السيتوبلازمية (على سبيل المثال، أكتين). هنا، تم استخدام الفئران CD31 المضادة للماوس (علامة الأوعية الدموية) في تخفيف 1:100 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في حل حظر بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية محمية من الجفاف على علبة الشرائح.
    ملاحظة: لا تقم بإضافة جسم مضاد أساسي إضافي أو متقارن الأجسام المضادة. المتقارنة التي تم حقنها وسمح لها أن تتراكم في الأنسجة في الجسم الحي بمثابة الأجسام المضادة الأولية.
  10. شطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق ثلاث مرات، وتغيير PBS في كل مرة.
  11. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الثانوية لتسمية الأجسام المضادة الأولية. لهذا التطبيق، تصور المضادة للB7-H3 الأجسام المضادة باستخدام AlexaFluor-546 المترافقة الماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة (1:200 تخفيف، الأمثل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) وCD31 مع AlexaFluor-488 الماعز المضادة للفئران الأجسام المضادة للفئران الثانوية (1:200 تخفيف، الأمثل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) في حل حجب، محمية من الضوء والجفاف على علبة الشريحة، لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية هي من نفس الحيوان المضيف ولكن تطابق تقارب الأجسام المضادة الثانوية إلى الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي المعني. الشرائح محمية من الضوء من هذه النقطة فصاعدا.
  12. شطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق ثلاث مرات، وتغيير PBS في كل مرة.
  13. تطبيق قطرة واحدة من المتوسطة تصاعد في وسط شريحة الأنسجة ووضع بعناية غطاء تجنب فخ فقاعات الهواء.
  14. ختم حواف غطاء مع طلاء الأظافر واضحة والسماح لتجف.
    ملاحظة: لإيقاف البروتوكول مؤقتاً لمدة تصل إلى أسبوع عند هذه النقطة، قم بتخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة.

5. التصوير المجهري البؤري وتحليل الصور الكمية

ملاحظة: يعتمد إعداد المجهر البؤري ومعلمات التصوير على نظام البؤرة المستخدمة. تم شراء المجهر المستخدم هنا تجارياً (على سبيل المثال، نظام Zeiss LSM 510 Meta) واستخدم برنامج الاقتناء المرتبط به (على سبيل المثال، Zen 2009). ومع ذلك، فإن العديد من هذه الخطوات تنطبق على أي مجهر البؤري وتفترض المعرفة المجهرية البؤرية الأساسية.

  1. بعد تشغيل النظام وتسخينه، حدد الهدف المطلوب؛ هنا تم استخدام هدف 20x (الفتحة العددية = 0.8).
  2. قم بتحميل شريحة تحكم إيجابية، والانزلاق على الغطاء لأسفل، للسماح بوضع التحسين لألمع إشارة. التصوير في القناة الحمراء، تركيز النظام على العينة في وضع التصوير المباشر.
  3. لكل قناة ليزر المستخدمة، وتحسين كثافة الليزر، ومكاسب رئيسية، وحجم الثقب على النحو التالي:
    1. قم بالتبديل إلى الوضع المستمر للتصوير.
    2. تحسين كثافة الليزر (الذي يتحكم في قوة الليزر) وكسب (ماجستير) (الذي يتحكم في الجهد لأنبوب المضاعف الضوئي) أشرطة الشريحة أثناء مراقبة البحث عن الجدول (LUT) الرسم البياني. اضبط هذين الإعدادات حتى يتم تعبئة النطاق الديناميكي للرسم البياني دون تشبع وحدات البكسل.
      ملاحظة: إذا كانت كثافة الليزر عالية جداً سوف يحدث تبييض الصور. إذا كان الكسب (الرئيسي) مرتفعًا جدًا، ستصبح الصورة صاخبة. من الناحية المثالية، فإن الربح (ماجستير) يكون في منتصف نطاقها.
    3. تعيين الثقب إلى 1 وحدة متجدد الهواء (AU)، والذي يعطي أعلى دقة وأنحف z-شريحة.
    4. حرك شريط الإزاحة الرقمية لتقليل أرضية الضوضاء على الرسم البياني LUT للحصول على خلفية سوداء حقيقية.
      ملاحظة: بمجرد تحسين إعدادات الفحص المجهري لكل قناة ليزر والهدف، والحفاظ عليها ثابتة طوال جلسة التصوير وتصوير جميع الشرائح، للسماح للمقارنة الكمية بين الشرائح.
  4. ضمن علامة التبويب وضع الاكتساب، ضمن متوسط، حدد الرقم المطلوب وعمق البت. انقر فوق الزر الأمثل لتعيين حجم البكسل الأمثل.
  5. استخدم زر الحصول على انطباق لجمع صورة عالية الجودة. هنا، تم اختيار مجالات رؤية عشوائية من داخل الورم، ولكن قد تنطبق مجالات أخرى ذات أهمية على تطبيقات مختلفة (الأوعية، هوامش الورم، عمق الاختراق، وما إلى ذلك)
  6. حفظ ملفات الصور بالتنسيق المستخدم من قبل برنامج confocal (هنا، ".lsm") للمعالجة دون اتصال والقياس الكمي.
    ملاحظة: إذا لم يتم تصوير كافة الشرائح أثناء نفس جلسة العمل حفظ الإعدادات وإعادة تحميلها في الزيارات اللاحقة على الرغم من أن إعادة تصوير نفس الشريحة غير مستحسن بسبب تبييض الصور.
  7. إجراء قياسات كثافة الفلورة الكمية. فتح فيجي (فيجي هو مجرد ImageJ البرمجيات)19،23 وتحميل ملف صورة .lsm عن طريق سحب إلى شريط المعلومات.
  8. تقسيم بيانات قناة اللون. انتقل إلى الصورة > مكدسات > قنوات سبليت.
  9. قم بالمعالجة المسبقة للصور الفلورية حسب الحاجة، أي طرح إشارة الخلفية(عملية > طرح الخلفية)أو تقليل الضوضاء عبر طريقة التصفية.
  10. تقسيم قناة اللون المقابلة للبروتين المرجعي (الأوعية الدموية، النووية، وصمة عار الخلوية) عن طريق وضع عتبة على كثافة إشارة (صورة > ضبط > عتبة).
    ملاحظة: العتبات اليدوية يدخل الذاتية في تحليل الصورة، وبالتالي، باستخدام خوارزمية عتبة تلقائية أو الرجوع إلى الرسم التخطيطي للصور يجعل نتائج تحليل الصورة أقل تحيزاً.
  11. استخدم هذه العتبة لإنشاء قناع ثنائي (عملية > ثنائي > تحويل إلى قناع).
  12. قياس وتسمية ROIs داخل القناع(تحليل > تحليل الجسيمات > التحقق من إضافة إلى مدير > موافق).
  13. تطبيق عائد الفائدة على قناة الألوان المقابلة للجسم المضاد للاهتمام (انقر فوق صورة القناة، تحليل > أدوات > مدير عائد الاستثمار > قياس). سيؤدي هذا إلى تطبيق ROIs القناع على صورة الأجسام المضادة وتوفير قياسات الصورة لمقاطع التسمية في إطار النتائج. حفظ نافذة النتائج (ملف > حفظ).
  14. حساب الإحصاء المطلوب من الفائدة، مثل متوسط كثافة الفلورة كما هو موضح هنا24.
  15. تنفيذ كافة خطوات المعالجة بشكل متطابق مع كل صورة ضمن مجموعة من الشرائح. إنشاء ماكرو للقيام بذلك تلقائياً لدفعات صورة كبيرة23.
  16. لعرض الصورة فقط بعد القياسات الكمية، وتطبيق تعديلات الصورة النوعية لتحسين التصور من أنماط التوزيع البيولوجي عن طريق ضبط الحد الأدنى، والحد الأقصى، والسطوع، والتباين مع نفس المستويات على جميع الشرائح(صورة > ضبط > السطوع / التباين).
  17. حوّل نوع الصورة (صورة > نوع > RGB Color)واحفظ الملفات في نوع صورة بدون فقدان مثل .tiff (ملف > حفظ باسم > Tiff...) لاستخدامها في العروض التقديمية والمنشورات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام طريقة IVIL هنا لفحص التوزيع البيولوجي في الجسم الحي وتفاعل الأنسجة من B7-H3-ICG وIso-ICG، من خلال السماح للعوامل، بعد الحقن الوريدي في الحيوان الحي، للتفاعل مع الأنسجة المستهدفة لمدة 96 ساعة، وبعد ذلك مرة واحدة هي الأنسجة حصادها ، لتكون بمثابة الأجسام المضادة الأولية خلال التلطيخ المناعي في الجسم الحي السابق. كما تمت مقارنة طريقة IVIL مع معيار الجسم الحي السابق IF تلطيخ الأنسجة لعلامة B7-H3. الغدد الثديية المورين العادية لا تعبر عن علامة B7-H3، وأكد في الجسم الحي السابق، معيار IF تلطيخ، ولا تتراكم الأجسام المضادة من خلال آليات سلبية أخرى، وبالتالي، لم يتم الكشف عن تراكم B7-H3-ICG أو Iso-ICG، ممثل نتيجة سلبية(الشكل 1،الصف العلوي). ومع ذلك، فإن الأورام الثديية المروية لا تعبر عن B7-H3 على حد سواء في الأوعية الدموية وظهارة (كما أكد معيار IF تلطيخ)، وكان IVIL قادرة على تسليط الضوء على عامل B7-H3-ICG التي تراكمت بقوة على الأوعية الدموية وكان قادرا على خارج جزئيا من الأوعية الدموية لربط الخلايا السرطانية نفسها على الرغم من بطريقة غير متجانسة بالمقارنة مع التوزيع الموحد للعلامة B7-H3 في جميع أنحاء الأورام، كما هو مبين في الشكل 1، الصف السفلي. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن عامل Iso-ICG ليس له خصوصية جزيئية، إلا أنه لا يزال يُظهر أنه يتراكم بطريقة غير محددة، بسبب تفاعلات Fc، وسوء الصرف الخلالي، وتعزيز نفاذية وتأثير الاحتفاظ داخل الثدي المورين الأورام ( الشكل1). ويسلط الضوء على هذا الاختلاف في أنماط التوزيع البيولوجي المبينة بين العاملين، ويزيد من تعزيز النتائج الملزمة المحددة لوكيل الأجسام المضادة المحدد، ويمثل نتيجتين محتملتين لنتيجة إيجابية.

وتبين النتائج التمثيلية للجنة الدولية للأجسام المضادة B7-H3-ICG كيف يمكن استخدام طريقة IVIL كطريقة نوعية لوصف التوزيع البيولوجي المترافق للأجسام المضادة/الأجسام المضادة العامة. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة في بعض الأحيان إلى تفسير كمي أكثر، أو قد يكون لجسم مضاد قدرة ملزمة حساسة للغاية ومحددة للمطابقة. في هذه الحالات، يمكن أيضا IVIL توفير المعلومات المطلوبة. في مثال ثان، حيث كان التعبير عن بروتين netrin-1 في أنسجة الورم وتوطينه المشترك مع بطانة الورم إيجابية CD31 أن يدرس، كما تم تطبيق تقنية IVIL بنجاح19.

Netrin-1 هو بروتين 65 كيلودا مفرز وهو مبالغ فيه في أنواع معينة من السرطان مثل سرطان الثدي النقيلي25،26. من أجل تطوير نهج التصوير الجزيئي للnetrin-1 ، كان لا بد من تحديد توافر البروتين في الجسم الحي19. أيضا، كما أن الأجسام المضادة للnetrin-1 ليس لديها تقارب كاف لمضدته بعد تثبيت الأنسجة، وكان مطلوبا بروتوكول تلطيخ بديل لالكيمياء المناعية الكلاسيكية أو تلطيخ IF وتم تنفيذ IVIL. تم حقن الأجسام المضادة للنيتيرين-1 والأجسام المضادة للتحكم في نوع IgG Isotype عن طريق الوريد 24 ساعة قبل ضخ القلب وجمع الورم. تم تطبيق التسريب القلبي للحد من تلطيخ الخلفية غير المحددة في الأوعية الدموية وتعزيز الكشف عن تراكم الأجسام المضادة للنيتيرين-1 كبيرة بالمقارنة مع إشارة الأجسام المضادة التحكم isotype عندما يكون التعبير المستهدف محدودا. وقد وصفت أقسام الورم السابقين فيالجسم الحي مع الأوعية الدموية تسليط الضوء على الأجسام المضادة للCD31 (الفئران المضادة للماوس CD31 الأجسام المضادة(جدول المواد)والأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت، اليكسا 488 يقترن الماعز المضادة للفئران IgG، 1:500 تخفيف واليكسا فلور 594- جنبا إلى جنب الماعز المضادة للبشرية IgG، 1:500 تخفيف على التوالي) واستخدمت للكشف عن المضادة للنيتيرين-1/isotype ومكافحة CD31 mAbs. تم تحديد كثافة إشارة الفلورة للجسم المضاد للتحكم في النيتيرين-1 وisotype لتحديد الاختلافات في تلطيخ الخصائص المشتركة مع CD31. ويبين الشكل 2 أن الأجسام المضادة للنيرين-1 المتراكمة على وجه التحديد في حجرة الورم الظهاري من الأورام الثديية MMTV-PyMT (نتيجة إيجابية)، في حين لم يكن هناك إشارة في الغدد الثديية العادية (نتيجة سلبية). كما شارك الجسم المضاد في ترجمة علامة البطانة CD31. أظهرت المقارنة مع الأورام التي حقنها الأجسام المضادة isotype والغدد الطبيعية أن تراكم الظهارية كان محدداً لأنسجة الورم. كان هناك تراكم إشارة في الخلايا البطانية لكل من الأورام والغدد الطبيعية بسبب netrin-1 ملزمة (الأورام) والتفاعلات FC غير محددة (الأورام والغدد الثديية العادية)11. وهكذا، كان مطلوبا ً تحديد كمية إشارة الفلورة باستخدام قناع ثنائي يستند إلى CD31 وأثبت أن إشارة الأجسام المضادة للنيرين-1 كانت أعلى بكثير من إشارة الأجسام المضادة للتحكم في نوع isotype في أنسجة الورم، مما يشير إلى netrin-1 تراكمت على وجه التحديد في بطانة الورم.

Figure 1
الشكل 1 : الصور المجهرية البؤرية التمثيلية للمقارنة بين الأجسام المضادة B7-H3 محددة-ICG متقارنة وغير محددة التحكم isotype الأجسام المضادة-ICG التعريب المترافق في الغدد الثديية المورين التي تحتوي على أنسجة طبيعية أو سرطانية. (أعلى) الغدد الثديية المورين العادية من الحيوان حقن عن طريق الوريد مع 33 ميكروغرام من Iso-ICG أو B7-H3-ICG (أحمر) ومضادة ملطخة CD31 (الأخضر) لا تظهر تلطيخ من الكدمات الأجسام المضادة. وقد تبين أن الأنسجة العادية ليس لديها أي تعبير عن B7-H3 من قبل معيار السابقين الجسم الحي IF تلطيخ. (أسفل) الأورام الثديية الغازية من الحيوان عن طريق الوريد حقن مع 33 ميكروغرام من B7-H3-ICG أو Iso-ICG (الأحمر) والأوعية الدموية المضادة الملطخة CD31 (الأخضر) تظهر واسعة النطاق، تلطيخ غير متجانسة، على الرغم من أن مع أنماط توزيع مختلفة، لكل من B7-H3-ICG و وكلاء اللجنة الدولية للايزو. B7-H3-ICG يرتبط بقوة إلى الأوعية الدموية، نقطة الاتصال الأولى في الجسم الحي، ومن ثم هو قادر على خارج من الأوعية الدموية لوصمة عار غير متجانسة ظهارة الورم. Iso-ICG يظهر تراكم غير محدد داخل أنسجة الورم. معيار السابقين فيفيفو IF تلطيخ يظهر التعبير الموحد للعلامة B7-H3 على الخلايا الظهارية والبطانية. يشير اللون الأصفر إلى إشارة القناة الحمراء والخضراء المترجمة بشكل مشترك. شريط مقياس هو 100 درجة مئوية ومتسقة بين لوحات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Figure 2
الشكل 2 في الجسم الحي المناعي توطين netrin-1 في الأورام الثديية MMTV-PyMT. (يسار) الميكروغرافيا البؤرية التمثيلية لطريقة IVIL للكشف عن تعبير netrin-1 (الأحمر) أو تعبير التحكم isotype (الأحمر) في سرطان المورين والغدد الثديية الطبيعية. يؤكد IVIL إشارة الظهارية للنفرين-1 في أورام MMTV-PyMT ولكن ليس في الغدد الثديية العادية، وإشارة netrin-1 قوية على الخلايا البطانية (CD31 تلطيخ، الأخضر) في أورام الثدي وإشارة أضعف بكثير من netrin-1 في الغدد الثديية العادية. يشير اللون الأصفر إلى إشارة القناة الحمراء والخضراء المترجمة بشكل مشترك. أشرطة مقياس تشير إلى 20 ميكرومتر. للكشف عن بروتين netrin-1 في بطانة الورم، تم حقن 100 ميكروغرام من NET1-H-mAb الأولية أنسنة NET1-H-mAb أو 100 ميكروغرام من الأجسام المضادة للتحكم في نوع الأيإيغ وايستايب البشرية عن طريق الوريد 24 ساعة قبل جمع الورم. تمت إزالة الأجسام المضادة المتداولة بحرية عن طريق التسريب القلبي مع PBS وتم عزل أنسجة الورم، وفلاش المجمدة، وقسمت في سمك 15 ميكروستات على cryostat. تم تسمية الخلايا البطانية مع الفئران الأولية المضادة للماوس CD31 الأجسام المضادة تليها الثانوية اليكسا 488 المقترنة الماعز المضادة للفئران IgG. للكشف عن الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف netrin-1، تم استخدام الثانوية اليكسا فلور 594 الماعز المقترنة المضادة للبشرية IgG. لتجنب التفاعل غير المحدد للأجسام المضادة الثانوية الماعز، تم حظر عينات الأنسجة مع مصل الماعز. (يمين) الرسم البياني الشريطي تسليط الضوء على التحديد الكمي للإشارة المضادة للnetrin-1 أو isotype التحكم الأجسام المضادة التي تتشارك مع إشارة الأجسام المضادة لمكافحة CD31. N = 13 الأورام (من اثنين من الفئران) لكل مجموعة من MMTV-PyMT و N = 7 الغدد الثديية (من فأر واحد) لكل مجموعة من الغدد العادية. أشرطة الخطأ تقديم SEM; تم إجراء مقارنات بين مجموعتين مع اختبار t للطلاب. إعادة طبع الشكل بإذن من 19 بموجب رخصة المشاع الإبداعي CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ولهذا الأسلوب عدة خطوات حاسمة ويتطلب تعديلات محتملة لضمان التنفيذ الناجح. أولاً، يجب أن تكون الجرعة وتوقيت الأجسام المضادة / الأجسام المضادة المترافقة الحقن الوريدي مصممة لتطبيق معين. عموما, يجب استخدام جرعات التي تتفق مع كيفية استخدام conjugate الأجسام المضادة عادة, أي مطابقة جرعات من الأجسام المضادة العلاجية أو عامل التباين القائم على الأجسام المضادة. كما ينبغي النظر بعناية في توقيت جمع الأنسجة المستهدفة. الأجسام المضادة والأجسام المضادة conjugates لها أوقات دوران أطول من الأدوية القياسية وعوامل التباين، ومع ذلك، هذه هي متغيرة للغاية وينبغي أن تكون الأمثل للتطبيق المطلوب، ولكن من المستحسن أن تسمح على الأقل 24 ساعة وقت الدورةالدموية 27 . ثانيا، خلال جمع الأنسجة المستهدفة، قد يكون مطلوبا لتنفيذ تقنية التسريب داخل القلب لإزالة الأجسام المضادة المتداولة بحرية من بركة الدم19. أثناء النظر في توزيع الورم من B7-H3-ICG، وجد أنه غير ضروري بسبب أوقات الدورة الدموية الطويلة بما فيه الكفاية (96 ساعة) وتوطين خارج الأوعية الدموية للعامل. ومع ذلك، لتطبيق netrin-1 من طريقة IVIL، واعتبر التسريب القلبي ذات الصلة بسبب التعبير البطانية من netrin-1 ومستوى التعبير منخفضة نسبيا. ثالثا، خلال تلطيخ الأنسجة الحية السابقة لا بد من وصمة عار أي الشرائح التي سيتم مقارنتها كميا خلال نفس الدورة ومع نفس الحلول لمنع الاختلافات العادية بين دفعات. تأكد من شطف الشرائح بشكل صحيح بين الخطوات ولا يأتي محلول القلم الكاره للماء في اتصال مع الأنسجة لتجنب تلطيخ دون المستوى الأمثل. وأخيراً، أثناء الفحص المجهري البؤري، حافظ على نفس إعدادات التصوير بين الشرائح للسماح للقياس الكمي النسبي والعمل بسرعة لمنع تبييض الصور من الشرائح. وستزيد هذه النقاط الرئيسية من احتمال نجاح تنفيذ الـ IVIL.

هناك العديد من المزايا لأسلوب IVIL. أولاً، في حين أن الأسلوب مشابه لتقنيات IF القياسية، فإن الاثنين يوفران معلومات مختلفة بشكل ملحوظ. إذا كان تلطيخ يشير إلى الموقع التشريحي للعلامات الجزيئية داخل الأنسجة في نقطة زمنية معينة (عندما تم جمع الأنسجة وثابتة). ومع ذلك، يوفر IVIL معلومات عن كيفية توزيع جسم مضاد أو جسم مضاد مترافق، كما يتضح من تعريب B7-H3-ICG، والتفاعل، سواء كان ذلك تراكمًا محددًا أو غير محدد، أو استيعابًا، أو الاحتفاظ في الهدف الانسجه. وهذا أمر بالغ الأهمية لدراسات الدوائية/الديناميكية والتوزيع البيولوجي. ثانيا، أساليب IF التقليدية هي، في بعض الأحيان، محدودة بتثبيت الأنسجة التي يمكن أن تسبب تشويه مستضد أو اخفاء منع الربط من قبل الأجسام المضادة الأولية28. لذلك، قد يكون IVIL مفيدًا عند فشل تلطيخ المعايير أو الكيمياء المناعية. ويمكن اعتبار تقنية IVIL طريقة تكميلية للتحقق في نشاط الأجسام المضادة في الجسم الحي التي من شأنها أن تكون غير قابلة للكشف. وأخيرا، فإن أولئك الذين يعرفون تقنيات تلطيخ IF التقليدية تجد طريقة مباشرة في التنفيذ، وسوف يكون معظم المواد المطلوبة في متناول اليد.

الأسلوب IVIL يحتوي على بعض القيود. أولا، نظرا لضرورة قتل الحيوان لحصاد الأنسجة المستهدفة، IVIL يوفر فقط معلومات التفاعل البيولوجي في نقطة زمنية واحدة. حقن الأجسام المضادة الأولية أو الجسم المضاد المترافق في نقاط زمنية متفاوتة في الحيوانات المختلفة سوف تسمح لنافذة زمنية أوسع من المعلومات عن التوزيع البيولوجي والتفاعل في الجسم الحي. ثانيا، إذا كان المستخدمون غير مألوفين في تقنيات الحيوانات الحية، مثل حقن الوريد الذيل أو التسريب داخل القلب المحتمل، وهذا يمكن أن يكون قيدا على هذه الطريقة. وتتطلب هذه الأساليب موظفين مهرة لأداء موثوق به. ومع ذلك، فإن استخدام القسطرة أثناء حقن الوريد الذيل يضمن إعطاء الجرعة بأكملها كما يمكن تأكيد وضع إبرة السليم قبل الحقن. وبالإضافة إلى ذلك، فإن أحد البدائل لحقن الوريد الذيل الذي يمكن النظر فيه هو الحقن المداري الرجعي، الذي عادة ما يكون معدل نجاحه أعلى مع موظفين أقل خبرة. الحاجة إلى وصمة عار وصورة جميع الشرائح الأنسجة في نفس الدفعة للسماح للتقييم الكمي يحد من عدد العينات وعلامات التي يمكن تضمينها في دراسة واحدة. قد تحتاج الدراسة إلى تنظيمها في تلطيخ تسلسلي في أيام مختلفة وعلى شرائح الأنسجة المجاورة لجمع المعلومات المطلوبة. وأخيراً، فإن استخدام الأجسام المضادة المتطابقة بين الأنواع، أي الأجسام المضادة للفئران في نماذج ما قبل السريرية، يثير مسألة تلطيخ الخلفية غير المحددة بالأجسام المضادة الثانوية. وبالتالي، فإن استخدام الأجسام المضادة الأولية غير المتطابقة بين الأنواع مطلوب كما هو معروض في هذه الدراسة، أو يجب استخدام الأجسام المضادة الأولية المتطابقة بالأنواع الفلورية.

تقنية IVIL مفيدة لتحليل التوزيع الحيوي للأجسام المضادة التشخيصية والعلاجية للعديد من التطبيقات. وقد تم الإبلاغ عن تطبيقات مختلفة للجسم المضاد الوريدي أو حقن الرباط وتحليل الأنسجة الحية السابقة في وقت سابق، وتؤكد الاهتمام بإدخال هذا الإجراء تلطيخ على نطاق واسع. روبرتسون وزملاؤه وصفت عناصر الأوعية الدموية مثل الشعيرات الدموية البطانية والأوعية أكبر مع الحقن الوريدي من الليكوبرسيكون ايسكولينتنوم agglutinin (الطماطم ليكتين)29. كانت هذه التقنية متوافقة مع الكيمياء النسيجية والكيمياء المناعية وكشفت عن أنماط الأوعية الدموية والخصائص الوظيفية. على الرغم من ذلك ، كان استخدام الأربطة الفلورية محدودة من التدهور السريع للفلورة عند الحقن30. كما هو مبين في بروتوكول IVIL، حقن جسم مضاد أساسي في الجسم الحي متبوعاً بتسمية الجسم الحي السابق مع جسم مضاد فلورسنت ثانوي قد يكون نهجاً أكثر قوة. تطبيق آخر للاهتمام من هذا النوع من في الجسم الحي IF تلطيخ هو وضع العلامات من الخلايا الليمفاوية داخل الأوعية الدموية كما هو مبين من قبل أندرسون والزملاء31. تم استخدام الأجسام المضادة عن طريق الحقن عن طريق الوريد لتسمية الخلايا الليمفاوية المترجمة في الأوعية الدموية، والتي تم جمعها في وقت لاحق ومعالجتها لمزيد من تحليل قياس التدفق الخلوي للعلامات المناعية. وأخيرا، لتقييم التسليم والتوطين النسيجي من العلاجات الأجسام المضادة التي تم تسليمها للمرضى الذين يعانون من سرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة (HNSCC)، أجريت أول دراسة في الإنسان لتوزيع الأجسام المضادة باستخدام منهجي تدار بالقرب من الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت المسمى الجسم المضاد العلاجي cetuximab-IRDye800CW32. تمت مقارنة البيانات مع التحليلات النسيجية وأظهرت أن إشارة الفلورسنت انخفضت مع المسافة من الورم مما يؤكد خصوصية. على الرغم من ذلك, الأجسام المضادة العلاجية لم تصل إلى جميع المناطق من التعبير مستضد, لا سيما مناطق الورم المتمايزة جيدا مع مستويات عالية من مستقبلات عامل النمو البشرة (EGFR) مستضد. في السياق الحالي لبحوث السرطان التي تركز على تطوير العلاجات المستهدفة والعلاجات المناعية التي تواجه مقاومة قوية وعدم فعالية، فإن طريقة IVIL تكون أداة ممتازة لدراسة توزيع الأجسام المضادة العلاجية مثل PD-1/PD-L-1 أو HER233،34. هذه النتائج هي قيمة للغاية لفهم لماذا العلاجات المستهدفة فعالة في بعض الحالات تعزيز تطوير نهج جديدة. وتبرز هذه الأمثلة مجتمعة الأهمية المحتملة لنهج الـ IVIL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر الدكتور أندرو أولسون (خدمة الفحص المجهري لعلوم الأعصاب في ستانفورد) على المناقشات واستخدام المعدات. نشكر الدكتور يورغن ك. ويلمان على توجيهه. وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل NIH R21EB022214 منحة (KEW)، NIH R25CA118681 منحة التدريب (KEW)، وNIH K99EB023279 (KEW). تم دعم خدمة الفحص المجهري لعلوم الأعصاب في ستانفورد من قبل NIH NS069375.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal Model
FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J The Jackson Laboratory 002374 Females, 4-6 weeks of age
Animal Handling Supplies
27G Catheter VisualSonics Please call to order Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit
Alcohol Wipes Fisher Scientific 22-246073
Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) Cardinal Health 2913
Heat Lamp Morganville Scientific  HL0100
Isoflurane Henry Schein Animal Health 29404
Ophthalmic Ointment Fisher Scientific NC0490117
Surgical Tape 3M 1530-1
Tissue Collection
Disposable Base Molds Fisher Scientific 22-363-556
Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium Fisher Scientific 23-730-571
Surgical London Forceps Fine Science Tools 11080-02
Surgical Scissors Fine Science Tools 14084-08
Antibodies
AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG Life Technologies A-11006
AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG Life Technologies A-11010
AlexaFluor-594 goat anti-human IgG Life Technologies A11014
Human IgG Isotype Control Novus Biologicals NBP1-97043
Humanized anti-netrin-1 antibody  Netris Pharma contact@netrispharma.com
Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) Abcam ab134161 EPNCIR122 Clone
Rat anti-Mouse CD31 BD Biosciences 550274 MEC 13.3 Clone
Reagents
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Clear Nail Polish Any local drug store
Indocyanine Green - NHS Intrace Medical ICG-NHS ester
Mounting Medium ThermoFisher Scientific TA-006-FM
Normal Goat Serum Fisher Scientific ICN19135680
Paraformaldehyde (PFA) Fisher Scientific AAJ19943K2
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 14190250
Triton-X 100 Sigma-Aldrich T8787
Supplies
Adhesion Glass Slides VWR 48311-703
Desalting Columns Fisher Scientific 45-000-148
Glass Cover Slips Fisher Scientific 12-544G
Hydrophobic Barrier Pen Ted Pella 22311
Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-402-25
Slide Staining Tray VWR 87000-136
Software
FIJI LOCI, UW-Madison. Version 4.0 https://fiji.sc/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
  2. Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
  3. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
  5. McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
  6. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
  7. Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
  8. Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
  9. Fleuren, E. D. G., et al. Theranostic applications of antibodies in oncology. Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).
  10. Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  11. Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
  12. Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
  13. Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
  14. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  15. Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
  16. Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
  17. Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
  18. Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
  19. Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
  20. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  21. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
  25. Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
  26. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  27. Ryman, J. T., Meibohm, B. Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).
  28. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
  29. Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
  30. Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
  31. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  32. de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
  33. Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
  34. Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).

Tags

أبحاث السرطان الإصدار 151 الأجسام المضادة جسم مضاد متقارن توزيع حيوي الدوائية الدوائية في الجسم الحي علم الأورام تلطيخ الفلورة المناعية توطين الأجسام المضادة سرطان الثدي
في فيفو الفلورة المناعية توطين لتقييم التوزيع الحيوي للجسم المضاد العلاجي والتشخيصي في أبحاث السرطان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wischhusen, J. C., Wilson, K. E. In… More

Wischhusen, J. C., Wilson, K. E. In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research. J. Vis. Exp. (151), e59810, doi:10.3791/59810 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter