Summary
La méthode de localisation de l'immunofluorescence in vivo (IVIL) peut être utilisée pour examiner la biodistribution in vivo d'anticorps et d'anticorps conjugués à des fins oncologiques chez des organismes vivants à l'aide d'une combinaison de ciblage tumoral in vivo et d'immunostaining ex vivo Méthodes.
Abstract
Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des outils importants dans la détection, le diagnostic et le traitement du cancer. Ils sont utilisés pour démêler le rôle des protéines dans la tumorigénèse, peuvent être dirigés vers les biomarqueurs du cancer permettant la détection et la caractérisation des tumeurs, et peuvent être utilisés pour la thérapie contre le cancer comme mAbs ou des conjugués anticorps-médicaments pour activer les cellules effectrices immunitaires, pour inhiber voies de signalisation, ou tuer directement les cellules porteuses de l'antigène spécifique. En dépit des progrès cliniques dans le développement et la production des mAbs nouveaux et fortement spécifiques, les applications diagnostiques et thérapeutiques peuvent être altérées par la complexité et l'hétérogénéité du microenvironnement de tumeur. Ainsi, pour le développement de thérapies et de diagnostics efficaces à base d'anticorps, il est crucial d'évaluer la biodistribution et l'interaction du conjugué à base d'anticorps avec le microenvironnement tumoral vivant. Ici, nous décrivons In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) comme une nouvelle approche pour étudier les interactions des thérapies et des diagnostics basés sur les anticorps dans les conditions physiologiques et pathologiques in vivo. Dans cette technique, un anticorps thérapeutique ou diagnostique d'antigène-spécifique est injecté par voie intraveineuse in vivo et localisé ex vivo avec un anticorps secondaire dans les tumeurs isolées. IVIL reflète donc la biodistribution in vivo de médicaments à base d'anticorps et d'agents de ciblage. Deux applications IVIL sont décrites évaluant la biodistribution et l'accessibilité des agents de contraste basés sur les anticorps pour l'imagerie moléculaire du cancer du sein. Ce protocole permettra aux futurs utilisateurs d'adapter la méthode IVIL pour leurs propres applications de recherche basées sur les anticorps.
Introduction
Les anticorps monoclonaux (mAb) sont de grandes glycoprotéines (environ 150 kDa) de la superfamille d'immunoglobuline qui sont sécrétées par les cellules B et ont une fonction primaire dans le système immunitaire pour identifier et inhiber la fonction biologique de, ou marquer pour pathogènes bactériens ou viraux, et peuvent reconnaître l'expression protéique anormale sur les cellules cancéreuses1. Les anticorps peuvent avoir une affinité extrêmement élevée avec leurs épitopes spécifiques jusqu'aux concentrations femtomolaires, ce qui en fait des outils très prometteurs en biomédecine2. Avec le développement de la technologie hybridome par Milstein et Kohler (prix Nobel en 1984), la production de mAbs est devenu possible3. Plus tard, mAbs humains ont été générés en utilisant la technologie d'affichage de phage ou souches transgéniques de souris et ont révolutionné leur utilisation comme outils de recherche et thérapeutiquesnouvelles 4,5.
Le cancer est un problème de santé mondial et une cause majeure de décès, créant la nécessité de nouvelles approches pour la prévention, la détection et la thérapie6. Jusqu'ici, les mAbs ont permis l'extraction du rôle des gènes et de leurs protéines dans la tumorigénèse et une fois dirigécontre des biomarqueurs de cancer, peut permettre la détection et la caractérisation de tumeur pour la stratification patiente. Pour la thérapie de cancer, les mAbs bispécifiques, les conjugués anticorps-médicaments, et de plus petits fragments d'anticorps sont développés comme thérapeutiques, et pour l'administration ciblée de drogue pour augmenter l'efficacité thérapeutique7. En outre, les anticorps servent pour le ciblage de biomarqueurs des agents de contraste pour des modalités d'imagerie moléculaire telles que la chirurgie fluorescence-guidée, l'imagerie photoacoustique (PA), l'imagerie moléculaire d'ultrason (US), et l'émission médicalement employée de positron tomographie (PET) ou tomographie calculée par émission de photons (SPECT)8. Enfin, les anticorps peuvent également être utilisés comme agents théranostiques permettant la stratification des patients et la surveillance de la réponse pour les thérapies ciblées9. Par conséquent, les nouveaux mAbs commencent à jouer un rôle critique dans la détection, le diagnostic et le traitement du cancer.
En dépit des progrès critiques dans le développement et la production des mAbs nouveaux et fortement spécifiques, les applications diagnostiques et thérapeutiques peuvent être rendues inefficaces en raison de la complexité de l'environnement de tumeur. Les interactions entre anticorps dépendent du type d'épitopée, c'est-à-dire qu'il soit linéaire ou conformationnel10. En plus de la reconnaissance des antigènes, les anticorps doivent surmonter les barrières naturelles telles que les parois des vaisseaux, les membranes basales et le stroma tumoral pour atteindre les cellules cibles exprimant l'antigène. Les anticorps interagissent avec le tissu non seulement à travers le domaine de liaison d'antigène à fragment variable (Fab), mais aussi à travers le fragment cristallin constant (Fc) qui conduit à des interactions hors site11. Le ciblage est également compliqué par l'expression hétérogène des marqueurs de tumeur tout au long du volume de tumeur et de l'hétérogénéité dans la vascularisation de tumeur et le système lymphatique12,13. En outre, le microenvironnement de tumeur est composé des fibroblastes cancer-associés qui soutiennent des cellules de tumeur, des cellules immunitaires de tumeur qui suppriment des réactions immunitaires antitumorales, et de l'endothélium de tumeur qui soutient le transport de l'oxygène et des éléments nutritifs, tous des qui interfèrent avec la pénétration, la distribution et la disponibilité de thérapies ou de diagnostics à base d'anticorps. Dans l'ensemble, ces considérations peuvent limiter l'efficacité thérapeutique ou diagnostique, réduire la réponse au traitement, et peut entraîner une résistance tumorale.
Par conséquent, pour le développement de thérapies et de diagnostics efficaces à base d'anticorps, il est crucial d'évaluer la biodistribution et l'interaction de la conjugaison à base d'anticorps dans le microenvironnement tumoral. Actuellement, dans les études précliniques, l'expression de marqueur dans les modèles de recherche de tumeur est analysée ex vivo par la coloration d'immunofluorescence (IF) des sections de tumeur14. La coloration standard de SI est exécutée avec les anticorps marqueurs-spécifiques primaires qui sont alors accentués par les anticorps fluorescents secondaires sur des tranches de tissu de tumeur ex vivo qui ont été isolées de l'animal. Cette technique met en évidence l'emplacement statique du marqueur au moment de la fixation du tissu et ne donne pas un aperçu de la façon dont les traitements ou les diagnostics à base d'anticorps pourraient se répartir ou interagir dans des conditions physiologiques. L'imagerie moléculaire par PET, SPECT, US, et PA peut fournir des informations sur la distribution d'agent de contraste conjugué par anticorps dans les modèles précliniques vivants8,15. Comme ces modalités d'imagerie ne sont pas invasives, des études longitudinales peuvent être effectuées et des données sensibles au temps peuvent être recueillies avec un nombre minimal d'animaux par groupe. Cependant, ces approches d'imagerie moléculaire non invasives ne sont pas assez sensibles et n'ont pas une résolution suffisante pour la localisation de la distribution des anticorps au niveau cellulaire. En outre, les caractéristiques physiques et biologiques de l'anticorps primaire peuvent être radicalement modifiées par la conjugaison d'un agent de contraste16.
Afin de prendre en considération les conditions physiologiques et pathologiques in vivo de la façon dont les thérapies et les diagnostics à base d'anticorps interagissent dans l'environnement tumoral et d'obtenir une distribution cellulaire et même sous-cellulaire à haute résolution profils des anticorps non conjugués, nous proposons une approche de IF, réputée localisation d'immunofluorescence in vivo (IVIL), dans laquelle l'anticorps antigène-spécifique est injecté par voie intraveineuse in vivo. Le thérapeutique ou le diagnostic à base d'anticorps, agissant comme un anticorps primaire, circule dans les vaisseaux sanguins fonctionnels et se lie à sa protéine cible dans le cadre tumoral très précis et vivant. Après l'isolement des tumeurs in vivo-étiquetées avec l'anticorps primaire, un anticorps secondaire est employé pour localiser les conjugués accumulés et retenus d'anticorps. Cette approche est similaire à une approche d'histologie DE LA SI précédemment décrite injectant des anticorps étiquetés fluorescents17. Bien qu'ici, l'utilisation d'anticorps non conjugués évite un changement potentiel dans les caractéristiques de biodistribution induites par la modification des anticorps. En outre, l'application ex vivo d'anticorps secondaires fluorescents évite une perte possible du signal de fluorescence pendant la collecte et le traitement des tissus et fournit l'amplification de l'intensité du signal de fluorescence. Notre approche d'étiquetage reflète la biodistribution in vivo de médicaments à base d'anticorps et d'agents ciblés et peut fournir des informations importantes pour le développement de nouveaux agents diagnostiques et thérapeutiques.
Ici, nous décrivons deux applications de la méthode IVIL appliquées dans des études précédentes portant sur la biodistribution et l'accessibilité des agents de contraste à base d'anticorps pour les approches d'imagerie moléculaire pour la détection du cancer du sein. Tout d'abord, la biodistribution d'un colorant infrarouge proche de l'anticorps (anticorps-B7-H3 liés au colorant de fluorescence infrarouge proche, vert endocyanine, B7-H3-ICG) et l'agent de contrôle de l'isotype (Iso-ICG) pour la fluorescence et la photoacoustique moléculaire l'imagerie est explorée18. La méthode de cette application est décrite dans le protocole. Ensuite, les résultats de biodistribution d'un anticorps conformationnellement sensible à la netrin-1, généralement non détectable avec l'imagerie FI traditionnelle, utilisé avec l'imagerie moléculaire par ultrasons, est quantifié et présenté dans les résultats représentatifs19. À la fin de ce document de protocole, les lecteurs devraient se sentir à l'aise d'adopter la méthode IVIL pour leurs propres applications de recherche basées sur les anticorps.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité administratif institutionnel sur les soins aux animaux de laboratoire (APLAC) de l'Université Stanford.
1. Modèle de souris transgénique du développement du cancer du sein
- Observez des souris du modèle désiré de cancer pour la croissance appropriée de tumeur par l'intermédiaire de la palpation ou de la mesure d'étrier avant de procéder.
REMARQUE : Ici, le modèle murin transgénique du développement de cancer du sein (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) a été employé. Ces animaux développent spontanément des carcinomes invasifs de sein entre 6 et 12 semaines d'âge dans chaque glande mammaire20. Les glandes mammaires normales ont été employées comme contrôles des transgene-négatifs, les compagnons de litière âge-assortis.
2. Injection intraveineuse d'agents anticorps spécifiques et non spécifiques
- Purififier les anticorps anti-souris B7-H3 et igG de contrôle de l'isotype de lapin sur une colonne de dessalement (p. ex., PD-10) pour enlever les conservateurs et les tampons de stockage suivant les instructions du fabricant.
REMARQUE: Certains anticorps peuvent avoir besoin d'une purification plus poussée avec des perles de protéines-A agarose protocole basé21. - Aliquot doses de 33 g de chaque anticorps conjugué dans des tubes de microcentrifuge individuels.
REMARQUE : Le dosage de l'agent administré peut varier en fonction de l'application et correspond aux doses auxquelles le conjugué d'anticorps est couramment utilisé. La concentration des solutions d'anticorps est nécessaire si le volume est supérieur à 100 L pour la sécurité des animaux. - Au moment désiré avant la collecte des tissus, ici 96 h, anesthésier l'animal porteur de tumeur avec 2% d'isoflurane coulant dans l'oxygène à 2 L/min, et placer sur une scène chauffée à 37 oC. Faites une pincée d'orteil pour s'assurer que le niveau approprié de l'anesthsia a été atteint avant la procédure.
- Pour se préparer à l'inoculation des veines de la queue des solutions d'anticorps, désinfectez la queue de l'animal en essuyant trois fois avec une lingette d'alcool. Dilater les veines de la queue en se réchauffant à l'auto-néavech à environ 30 s. Évitez de chauffer l'animal entier. Essuyez la queue une fois de plus avec une lingette d'alcool après avoir enlevé le coussin chauffant.
- À l'aide d'un cathéter de veine de queue de 27G, insérez l'aiguille de papillon dans l'une des deux veines latérales de queue et fixez soigneusement la queue avec l'aiguille insérée à la scène avec un morceau de ruban chirurgical.
REMARQUE : Le reflux sanguin visible dans le cathéter indique l'emplacement approprié de l'aiguille dans la veine de la queue. - Rincer le cathéter avec 25 l de phosphate stérile tamponné saline (PBS), puis injecter la solution d'anticorps dans le cathéter à l'aide de seringues à insuline. Rincer le cathéter une fois de plus avec 25 l de PBS stérile.
- Retirez l'aiguille de la queue et exercez une pression pour arrêter tout saignement.
- Éteignez l'anesthésie et observez l'animal jusqu'à ce qu'il soit complètement éveillé pour déceler tout signe de détresse.
3. Collecte et préparation des tissus tumoraux cibles
- Au moment souhaité, euthanasier humainement l'animal selon la procédure institutionnelle acceptable, ici, par inhalation progressive de 100% de CO2 à partir d'un réservoir de gaz comprimé avec un débit de déplacement de chambre de 10-30% volume/min.
REMARQUE: Certaines applications de la technique IVIL nécessitent l'euthanasie par perfusion cardiaque avec PBS pour enlever les anticorps circulant librement19,22. - Après confirmation de l'euthanasie humaine par cessation du mouvement respiratoire et cardiaque, manque de réponse de pincement d'orteil, et grisonnant des muqueuses, des tissus de tumeur d'accise utilisant des ciseaux chirurgicaux et des forceps comme suit :
- Posez la souris en position de supine et ne saisissant que la couche externe de la peau entre l'ensemble des glandes mammaires les plus proches de la queue (5e) avec des forceps, faire une petite incision avec une paire de ciseaux chirurgicaux.
- Introduisez les ciseaux fermés dans la coupe et ouvrez lentement la pointe pour séparer soigneusement la peau de la membrane abdominale sous-jacente la gardant intacte.
- Faire une incision verticale jusqu'à l'abdomen, en continuant à séparer la peau de la membrane interne. Entre les glandes mammaires 3rd et 4e, faire une coupe horizontale à travers l'abdomen pour permettre la rétraction de la peau et la visualisation des glandes mammaires.
REMARQUE : Les tumeurs et les glandes mammaires sont situées superficiellement sous la peau. - Saisir chaque tumeur ou glande normale avec des forceps, couper soigneusement la peau attachée à l'aide de ciseaux chirurgicaux.
- Placer les tissus excisés dans des moules de base jetables tissulaires, préétiquetés et remplis d'une température de coupe optimale (OCT) en castré e moyen et congeler les moules rapidement en les plaçant sur de la glace sèche. Afin d'étudier l'accouchement hors cible, exciser d'autres tissus ou organes d'intérêt(p. ex., le foie ou les poumons).
REMARQUE : Pour mettre en pause le protocole à ce stade, entreposez les blocs de tissus congelés à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient prêts à aller de l'avant. - À l'aide d'un cryostat, sectiondes de blocs de tissus congelés d'une épaisseur de 10 m et placez les sections adjacentes sur des lames de verre d'adhérence préétiquetées.
REMARQUE : Pour mettre en pause le protocole à ce stade, entreposez les diapositives à -80 oC jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à aller de l'avant.
4. Protocole de coloration Ex vivo
REMARQUE : Pour la comparaison quantitative entre les images de microscopie de fluorescence, toutes les diapositives sont tachées en même temps avec les mêmes solutions préparées.
- Rincer les lames de tissu congelés avec PBS à température ambiante pendant 5 min pour enlever l'OCT.
- Délimiter les sections de tissu avec un stylo de barrière hydrophobe pour réduire le volume des solutions nécessaires pendant la coloration.
REMARQUE : Veillez à ne pas laisser le stylo courir sur les échantillons de tissus, car il peut soit enlever le tissu de la glissière ou empêcher la coloration appropriée sur la partie tissulaire affectée. Ne laissez pas les sections de tissu se déshydrater à tout moment. - Fixer les sections de tissu avec une solution de paraformaldéhyde de 4% pendant 5 min.
- Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min.
- Perméabilize sections de tissu avec 0.5% Triton-X 100 dans PBS pendant 15 min.
- Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min.
- Bloquer les tissus avec 3% w / v albumine de sérum bovin (BSA) et 5% v / v sérum de chèvre, à la fois en PBS (solution de blocage) pour 1 h à température ambiante.
REMARQUE : Associez le sérum de la solution de blocage à l'animal hôte de l'anticorps secondaire. - Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min.
- Incuber des sections avec des anticorps primaires de tenue de dossiers comme désiré, peut-être un nucléaire commun (par exemple, DAPI), vasculaire (par exemple, CD31), ou marqueur cytoplasmique (par exemple, actine). Ici, rat anti-souris CD31 (marqueur vasculaire) à une dilution 1:100 a été utilisé selon les instructions du fabricant dans la solution de blocage pendant la nuit à 4 oC protégé contre la déshydratation sur un plateau de diapositives.
REMARQUE : N'ajoutez pas d'anticorps primaires supplémentaires ou de conjugués d'anticorps. Le conjugaison qui a été injecté et a permis de s'accumuler dans les tissus in vivo agissent comme l'anticorps primaire. - Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min trois fois, en changeant le PBS à chaque fois.
- Incuber des diapositives avec des anticorps secondaires pour étiqueter les anticorps primaires. Pour cette application, visualisez l'anticorps anti-B7-H3 à l'aide d'anticorps anti-lapin de chèvre conjugués AlexaFluor-546 (1:200 dilution, optimisé selon les instructions du fabricant) et CD31 avec un anticorps secondaire antirat de chèvre AlexaFluor-488 (1:200 dilution, optimisée selon les instructions du fabricant) dans la solution de blocage, protégée de la lumière et de la déshydratation sur un plateau coulissant, pendant 1 h à température ambiante.
REMARQUE : Les anticorps secondaires proviennent du même animal hôte, mais correspondent à l'affinité des anticorps secondaires avec l'espèce hôte de l'anticorps primaire respectif. Les glissières sont protégées de la lumière à partir de ce point. - Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min trois fois, en changeant le PBS à chaque fois.
- Appliquer une goutte du milieu de montage dans le centre de la tranche de tissu et placer soigneusement un bordereau en évitant le piégeage des bulles d'air.
- Sceller les bords de la glissière avec du vernis à ongles transparent et laisser sécher.
REMARQUE : Pour mettre en pause le protocole jusqu'à une semaine à ce stade, rangez les diapositives à -20 oC jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à aller de l'avant.
5. Imagerie par microscopie confocale et analyse quantitative de l'image
REMARQUE : La préparation du microscope confocal et des paramètres d'imagerie dépendra du système confocal utilisé. Le microscope utilisé ici a été acheté commercialement (p. ex., système Zeiss LSM 510 Meta) et le logiciel d'acquisition associé a été utilisé (p. ex., Zen 2009). Cependant, beaucoup de ces étapes s'appliqueront à n'importe quel microscope confocal et assumeront la connaissance confocale de base de microscopie.
- Une fois que le système a été activé et réchauffé, sélectionnez l'objectif souhaité; ici, un objectif 20x (ouverture numérique de 0,8) a été utilisé.
- Chargez une glissière de contrôle positive, cale zona vers le bas, pour permettre de définir l'optimisation pour le signal le plus lumineux. Imagerie dans le canal rouge, concentrer le système sur l'échantillon en mode d'imagerie en direct.
- Pour chaque canal laser utilisé, optimisez l'intensité laser, le gain maître et la taille du sténopé comme suit :
- Passez au mode continu pour l'imagerie.
- Optimisez l'intensité laser (qui contrôle la puissance laser) et Gain (Master) (qui contrôle la tension pour le tube photomultiplicateur) des barres de glissière tout en surveillant l'histogramme de la table De recherche (LUT). Ajustez ces deux paramètres jusqu'à ce que la plage dynamique de l'histogramme soit remplie sans saturer les pixels.
REMARQUE : Si l'intensité laser est trop élevée, il y aura un photoblanchiment. Si le Gain (Master) est trop haut, l'image deviendra bruyante. Idéalement, le Gain (Master) sera au milieu de sa gamme. - Définir le trou d'épingle à 1 unité aérée (AU), qui donne la plus haute résolution et la plus fine z-tranche.
- Faites glisser la barre de compensation numérique pour minimiser le plancher de bruit sur l'histogramme LUT pour un vrai fond noir.
REMARQUE : Une fois que les paramètres de microscopie sont optimisés pour chaque canal laser et objectif, gardez-les constants tout au long de la séance d'imagerie et pour l'imagerie de toutes les diapositives, afin de permettre la comparaison quantitative entre les diapositives.
- Sous l'onglet Mode d'acquisition, sous La moyenne,sélectionnez le Nombre et la Profondeur Bitsouhaités. Cliquez sur le bouton Optimal pour définir la taille optimale des pixels.
- Utilisez le bouton d'acquisition Snap pour collecter une image de haute qualité. Ici, des champs de vision aléatoires ont été sélectionnés à l'intérieur de la tumeur, mais d'autres domaines d'intérêt peuvent s'appliquer à différentes applications (navires, marges tumorales, profondeur de pénétration, etc.)
- Enregistrer les fichiers d'images dans le format utilisé par le logiciel confocal (ici, ".lsm") pour le traitement hors ligne et la quantification.
REMARQUE : Si toutes les diapositives ne sont pas représentées au cours de la même session, enregistrez les paramètres et rechargez-les lors des visites ultérieures, bien que la réimagerie de la même diapositive ne soit pas recommandée en raison du photoblanchiment. - Effectuer les mesures quantitatives de l'intensité de la fluorescence. Open Fiji (Fiji Is Just ImageJ software)19,23 et charger un fichier d'image .lsm en faisant glisser sur la barre d'état.
- Divisez les données du canal couleur. Aller à l'image 'gt; Stacks 'gt; Split Channels.
- Prétraiter les images de fluorescence au besoin, c'est-à-savoir, soustraire le signal d'arrière-plan (Processus 'gt; Soustract Background)ou réduire le bruit via une méthode de filtrage.
- Segmenter le canal de couleur correspondant à la protéine de référence (vasculaire, nucléaire, tache cellulaire) en fixant un seuil sur l'intensité du signal (Image 'gt; Ajuster 'gt; Seuil).
REMARQUE : Le seuil manuel introduit la subjectivité dans l'analyse d'image, par conséquent, à l'aide d'un algorithme de seuil automatisé ou en faisant référence aux histogrammes d'image, ce qui rend les résultats de l'analyse d'image moins biaisés. - Utilisez ce seuil pour créer un masque binaire (Processus 'gt; Binaire 'gt; Convertir en Masque).
- Mesurer et étiqueter les ROI dans le masque (Analyser les particules 'gt; Check Add to Manager 'gt; OK).
- Appliquer ROIs sur le canal de couleur correspondant à l'anticorps d'intérêt (Cliquez sur l'image du canal, Analyser 'gt; Outils 'gt; GESTIONNAIRE de roi-roi 'gt; Mesure). Cela appliquera le masque ROIs à l'image de l'anticorps et fournira des mesures d'image pour les sections d'étiquette dans la fenêtre Résultats. Enregistrer la fenêtre de résultats (Fichier 'gt; Enregistrer).
- Calculer la statistique d'intérêt souhaitée, comme l'intensité moyenne de fluorescence telle que décrite ici24.
- Effectuez toutes les étapes de traitement de manière identique à chaque image dans un ensemble de diapositives. Créez une macro pour le faire automatiquement pour les lots d'images23.
- Pour l'affichage de l'image seulement après des mesures quantitatives, appliquer des ajustements d'image qualitativepour optimiser la visualisation des modèles de biodistribution en ajustant le minimum, le maximum, la luminosité et le contraste aux mêmes niveaux sur toutes les diapositives(Image 'gt; Ajuster Luminosité/contraste).
- Convertir le type d'image (Image 'gt; Type 'gt; RGB Color) et enregistrer des fichiers dans un type d'image sans perte tels que .tiff (Fichier 'gt; Enregistrer comme 'gt; Tiff ...) pour une utilisation dans les présentations et les publications.
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Representative Results
La méthode IVIL a été utilisée ici pour examiner la biodistribution in vivo et l'interaction tissulaire de B7-H3-ICG et Iso-ICG, en permettant aux agents, après injection intraveineuse dans un animal vivant, d'interagir avec le tissu cible pendant 96 h, puis une fois que les tissus sont d'agir comme les principaux anticorps pendant l'immunostaining ex vivo. La méthode IVIL a également été comparée à la coloration standard ex vivo IF des tissus pour le marqueur B7-H3. Les glandes mammaires maurines normales n'expriment pas le marqueur B7-H3, confirmé dans l'ex vivo, coloration standard DE SI, et n'accumulent pas d'anticorps par d'autres mécanismes passifs, et, par conséquent, aucune accumulation de B7-H3-ICG ou Iso-ICG n'a été détectée, représentant d'un résultat négatif (Figure 1,première rangée). Cependant, les tumeurs mammaires maurines expriment B7-H3 à la fois dans la vascularisation et l'épithélium (comme confirmé par la coloration standard SI), et IVIL a été en mesure de mettre en évidence l'agent B7-H3-ICG qui s'était accumulé fortement sur la vascularisation et a été en mesure d'extravasate partielle de la vascularisation de se lier aux cellules cancéreuses elles-mêmes mais d'une manière hétérogène par rapport à la distribution uniforme du marqueur B7-H3 dans toutes les tumeurs, également montré dans la figure 1, rangée inférieure. En outre, même si l'agent Iso-ICG n'a pas de spécificité moléculaire, il a été montré à s'accumuler d'une manière non spécifique, en raison des interactions Fc, un mauvais drainage interstitiel, et l'effet de perméabilité et de rétention améliorée dans la mammaire murine tumeurs (Figure 1). Cette différence est mise en évidence dans les modèles de biodistribution montrés entre les deux agents, et améliore encore les résultats contraignants spécifiques de l'agent d'anticorps spécifique, et représente deux résultats possibles d'un résultat positif.
Les résultats représentatifs du B7-H3-ICG démontrent comment la méthode IVIL peut être utilisée comme méthode qualitative pour décrire la biodistribution générale des anticorps et des anticorps conjugués. Cependant, parfois, une interprétation plus quantitative peut être nécessaire, ou un anticorps peut avoir une capacité de liaison très sensible et spécifique à la conformation. Dans ces situations, IVIL peut également fournir les informations souhaitées. Dans un deuxième exemple, dans lequel l'expression de la protéine de netrin-1 dans les tissus de tumeur et sa co-localisation avec l'endothelium cD31-positif de tumeur devait être étudiée, la technique d'IVIL a été également avec succès appliquée19.
Netrin-1 est une protéine sécrétée 65 kDa qui est sur-exprimée dans certains types de cancer tels que le cancer du sein métastatique25,26. Afin de développer une approche d'imagerie moléculaire pour netrin-1, la disponibilité in vivo de la protéine a dû être déterminée19. En outre, comme l'anticorps anti-netrin-1 n'a pas suffisamment d'affinité pour son antigène après fixation de tissu, un protocole alternatif de coloration à l'immunohistochimie classique ou à la coloration de SI a été exigé et IVIL a été mis en œuvre. L'anticorps humanisé d'anti-netrin-1 et un anticorps humain de contrôle d'isotype d'IgG ont été injectés par voie intraveineuse 24 h avant la perfusion cardiaque et la collecte de tumeur. La perfusion cardiaque a été appliquée pour réduire la coloration de fond non spécifique dans la vascularisation et pour améliorer la détection de l'accumulation significative d'anticorps anti-netrin-1 par rapport au signal d'anticorps de contrôle d'isotype quand l'expression de cible est limitée. Les sections de tumeur ont été étiquetées ex vivo avec la vascularisation mettant en évidence l'anticorps anti-CD31 (anticorps anti-souris CD31 de rat (table des matériaux) et les anticorps secondaires fluorescents, Alexa 488-couplé chèvre anti-rat IgG, 1:500 dilution et Alexa Fluor 594- igG anti-humain couplé de chèvre, 1:500 dilution respectivement) ont été employés pour indiquer l'anti-netrin-1/isotype et anti-CD31 mAbs. Les intensités de signal de fluorescence de l'anticorps anti-nétrin-1 et de contrôle d'isotype ont été quantifiées pour déterminer des différences dans la coloration colocalisée avec CD31. La figure 2 montre que l'anticorps anti-netrin-1 s'est spécifiquement accumulé dans le compartiment de tumeur épithéliale des tumeurs mammaires de MMTV-PyMT (un résultat positif), alors qu'il n'y avait aucun signal dans les glandes mammaires normales (un résultat négatif). L'anticorps a également co-localisé avec le marqueur endothélial CD31. La comparaison avec les tumeurs isotype-injectées d'anticorps et les glandes normales a prouvé que l'accumulation épithéliale était spécifique pour le tissu de tumeur. Il y avait accumulation de signal dans les cellules endothéliales des deux tumeurs et glandes normales dues à la liaison de netrin-1 (tumeurs) et aux interactions non spécifiques de Fc (tumeurs et glandes mammaires normales)11. Ainsi, la quantification du signal de fluorescence à l'aide d'un masque binaire à base de CD31 a été nécessaire et a démontré que le signal d'anticorps anti-netrin-1 était significativement plus élevé que le signal d'anticorps de contrôle de l'isotype dans le tissu tumoral, ce qui suggère la netrin-1 spécifiquement accumulé dans l'endothélium de tumeur.
Figure 1 : Micrographies confocales représentatives de la comparaison de l'anticorps spécifique B7-H3-ICG conjugué et non spécifique d'anticorps d'isotype-ICG conjugués dans les glandes mammaires murines contenant des tissus normaux ou carcinomes. (En haut) Les glandes mammaires maurines normales d'un animal injecté par voie intraveineuse avec 33 g d'Iso-ICG ou de B7-H3-ICG (rouge) et contre-tachées de CD31 (vert) ne montrant aucune coloration des conjugués d'anticorps. Les tissus normaux n'ont montré aucune expression de B7-H3 par la coloration ex vivo STANDARD de SI. (En bas) Tumeurs mammaires invasives d'un animal injecté par voie intraveineuse avec 33 g de B7-H3-ICG ou Iso-ICG (rouge) et vasculaire souillant CD31 (vert) montrant une coloration étendue et hétérogène, mais avec des modèles de distribution différents, pour le B7-H3-ICG et Agents Iso-ICG. B7-H3-ICG se lie fortement à la vascularisation, le premier point de contact in vivo, puis est capable d'extravasate de la vascularisation pour tacher hétérogènement l'épithélium tumoral. Iso-ICG montre l'accumulation non spécifique dans les tissus tumoraux. La coloration standard ex vivo IF montre l'expression uniforme du marqueur B7-H3 sur les cellules épithéliales et endothéliales. La couleur jaune indique le signal de canal rouge et vert colocalisé. La barre d'échelle est de 100 m et est cohérente entre les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : immuno-localisation in vivo de netrin-1 dans les tumeurs mammaires de MMTV-PyMT. (Gauche) Micrographies confocales représentatives de la méthode IVIL pour détecter l'expression de netrin-1 (rouge) ou l'expression de contrôle d'isotype (rouge) dans le carcinome murine et les glandes mammaires normales. IVIL confirme le signal épithélial pour le netrin-1 dans les tumeurs de MMTV-PyMT mais pas dans les glandes mammaires normales, et le signal netrin-1 fort sur des cellules endothéliales (cD31 tacher, vert) dans des tumeurs de sein et le signal sensiblement plus faible de netrin-1 dans les glandes mammaires normales. La couleur jaune indique le signal de canal rouge et vert colocalisé. Les barres d'échelle indiquent 20 m. Pour la détection de la protéine de netrin-1 dans l'endothélium de tumeur, 100 'g de NET1-H-mAb humanisé primaire ou 100 'g d'anticorps humains de contrôle d'isotype d'IgG ont été injectés par voie intraveineuse 24 h avant la collecte de tumeur. L'anticorps circulant librement a été enlevé par perfusion cardiaque avec PBS et le tissu de tumeur a été isolé, flash congelé, et sectionné à l'épaisseur de 15 m sur un cryostat. Les cellules endothéliales ont été étiquetées avec l'anticorps cD31 primaire d'anti-souris de rat suivi de l'IgG anti-rat de chèvre 488-couplé secondaire d'Alexa 488-couplé. Pour révéler l'anticorps primaire ciblant netrin-1, Alexa Fluor secondaire 594-couplé chèvre anti-humain IgG a été utilisé. Pour éviter l'interaction non spécifique des anticorps secondaires de chèvre, des échantillons de tissu ont été bloqués avec le sérum de chèvre. (Droite) Graphique de barre soulignant la quantification du signal d'anticorps de contrôle d'anti-netrin-1 ou d'isotype qui colocalise avec le signal d'anticorps anti-CD31. Tumeurs de N-13 (de deux souris) par groupe de glandes mammaires MMTV-PyMT et N-7 (d'une souris) par groupe de glandes normales ; Les barres d'erreur présentent SEM; Des comparaisons en deux groupes ont été effectuées avec le test t de l'étudiant. Figure réimprimée avec la permission de 19 sous la licence creative commons CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Cette méthode comporte plusieurs étapes critiques et nécessite des modifications potentielles pour assurer une mise en œuvre réussie. Tout d'abord, la posologie et le moment de l'injection intraveineuse d'anticorps/anticorps conjugués doivent être adaptés à l'application spécifique. En général, des doses doivent être utilisées qui sont compatibles avec la façon dont le conjugaison d'anticorps sera généralement utilisé, c'est-à-dire, des doses assorties de l'anticorps thérapeutique ou de l'agent de contraste à base d'anticorps. En outre, le moment de la collecte des tissus cibles doit être soigneusement considéré. Les anticorps et les conjugues d'anticorps ont des temps de circulation plus longs que les médicaments standard et les agents de contraste, cependant, ceux-ci sont fortement variables et devraient être optimisés pour l'application désirée, mais il est recommandé de permettre au moins 24 h temps de circulation27 . Deuxièmement, au cours de la collecte des tissus cibles, il peut être nécessaire de mettre en œuvre une technique de perfusion intracardiaque pour enlever les anticorps circulant librement de la piscine de sang19. Tout en regardant la distribution de tumeur de B7-H3-ICG, il a été trouvé inutile dû aux temps de circulation suffisamment longs (96 h) et à la localisation extravasculaire de l'agent. Cependant, pour l'application de netrin-1 de la méthode IVIL, la perfusion cardiaque a été considérée pertinente en raison de l'expression endothéliale de netrin-1 et de son niveau d'expression relativement bas. Troisièmement, lors de la coloration des tissus ex vivo, il est impératif de tacher les diapositives qui seront comparées quantitativement au cours de la même session et avec les mêmes solutions pour prévenir les variations normales entre les lots. Assurez-vous que les glissières sont bien rincées entre les étapes et que la solution de stylo hydrophobe n'entre pas en contact avec le tissu pour éviter les taches sous-optimales. Enfin, pendant la microscopie confocale, maintenir les mêmes réglages d'imagerie entre les diapositives pour permettre une quantification relative et travailler rapidement pour empêcher le photoblanchiment des diapositives. Ces points clés augmenteront la probabilité d'une mise en œuvre réussie de l'IVIL.
La méthode IVIL présente plusieurs avantages. Tout d'abord, bien que la méthode soit similaire aux techniques STANDARD de LA FI, les deux fournissent des informations significativement différentes. La coloration SI indique l'emplacement anatomique des marqueurs moléculaires dans les tissus à un moment donné (lorsque le tissu a été recueilli et fixé). Cependant, IVIL fournit des informations sur la façon dont un anticorps ou un anticorps conjugué, comme démontré par la localisation de B7-H3-ICG, est la distribution et l'interaction, qu'il s'agisse d'accumulation spécifique ou non spécifique, l'internalisation ou la rétention dans la cible mouchoir. Ceci est essentiel aux études pharmacocinétiques/dynamiques et biodistribution. Deuxièmement, les méthodes TRADITIONNELLEs de FI sont, parfois, limitées par la fixation des tissus qui peuvent causer la distorsion d'antigène ou le masquage empêchant la liaison par l'anticorps primaire28. Par conséquent, IVIL peut être utile lorsque la coloration standard IF ou immunohistochemistry échouer. La technique IVIL peut être considérée comme une méthode complémentaire pour vérifier l'activité des anticorps in vivo qui serait autrement indétectable. Enfin, ceux qui connaissent les techniques traditionnelles de coloration IF trouveront la méthode simple dans l'exécution et auront la plupart des matériaux requis à portée de main.
La méthode IVIL a quelques limites. Tout d'abord, en raison de la nécessité d'euthanasier l'animal pour récolter les tissus cibles, IVIL ne fournit des informations d'interaction biologique qu'à un seul moment. L'injection de l'anticorps primaire ou de l'anticorps conjugué à différents moments dans différents animaux permettra une fenêtre de temps plus large de l'information sur la biodistribution et l'interaction in vivo. Deuxièmement, si les utilisateurs ne sont pas familiers avec les techniques animales in vivo, telles que l'injection intraveineuse de veine de queue ou la perfusion intracardiaque potentielle, ceci peut être une limitation à la méthode. Ces méthodes exigent du personnel qualifié pour effectuer de façon fiable. Cependant, l'utilisation d'un cathéter pendant l'injection de veine de queue assure l'administration de la dose entière pendant que le placement approprié d'aiguille peut être confirmé avant l'injection. En outre, une alternative à l'injection de veine de queue qui pourrait être considérée est l'injection rétro-orbitale, qui a typiquement un taux de succès plus élevé avec le personnel moins expérimenté. La nécessité de tacher et d'imager toutes les diapositives de tissus dans le même lot pour permettre une évaluation quantitative limite le nombre d'échantillons et de marqueurs qui peuvent être inclus dans une seule étude. L'étude pourrait avoir besoin d'être organisée en taches en série à différents jours et sur les tranches de tissu adjacentes pour recueillir les informations désirées. Enfin, l'utilisation d'anticorps appariés à l'espèce, c'est-à-dire d'anticorps antisouris murins dans des modèles précliniques murins, soulève une question de coloration de fond non spécifique avec des anticorps secondaires. Ainsi, l'utilisation d'anticorps primaires inadaptés aux espèces est nécessaire tel que présenté dans la présente étude, ou des anticorps primaires appariés à l'espèce fluorescente devraient être utilisés.
La technique IVIL est utile pour l'analyse de biodistribution des anticorps diagnostiques et thérapeutiques pour de nombreuses applications. Différentes applications pour l'anticorps intraveineux ou l'injection de ligand et l'analyse de tissu ex vivo ont été rapportées précédemment et confirment l'intérêt d'introduire largement cette procédure de coloration. Robertson et ses collègues ont étiqueté des éléments vasculaires tels que des capillaires endothéliaux et des vaisseaux plus grands avec des injections intraveineuses de Lycopersicon esculentum agglutinin (lectine de tomate)29. La technique était compatible avec l'histochimie et l'immunocytochemistry et a indiqué des modèles vasculaires et des caractéristiques parenchymales fonctionnelles. Bien que, l'utilisation de ligands fluorescents a été limitée par la dégradation rapide de la fluorescence lors de l'injection30. Comme démontré dans le protocole IVIL, l'injection d'un anticorps primaire in vivo suivie d'un étiquetage ex vivo avec un anticorps fluorescent secondaire pourrait être une approche plus robuste. Une autre application intéressante de ce type de coloration in vivo IF est l'étiquetage des lymphocytes intravasculaires comme l'ont démontré Anderson et ses collègues31. L'anticorps injecté par voie intraveineuse a été utilisé pour étiqueter les lymphocytes localisés dans les vaisseaux sanguins, qui ont ensuite été recueillis et traités pour l'analyse de cytométrie du débit des marqueurs immunologiques. Enfin, pour évaluer la livraison et la localisation histologique des thérapies d'anticorps qui ont été livrées aux patients présentant le carcinome squamous de cellules de tête et de cou (HNSCC), une première étude humaine de la distribution d'anticorps a été exécutée utilisant systémiquement anticorps thérapeutiques étiquetés à infrarouge proche cetuximab-IRDye800CW32. Les données ont été comparées aux analyses histologiques et ont prouvé que le signal fluorescent a diminué avec la distance de la tumeur confirmant la spécificité. Bien que, l'anticorps thérapeutique n'a pas atteint toutes les régions de l'expression d'antigène, particulièrement les régions bien différenciées de tumeur avec des niveaux élevés de l'antigène épidermique de facteur de facteur de croissance (EGFR). Dans le contexte actuel de la recherche sur le cancer axée sur le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies qui rencontrent une forte résistance et un manque d'efficacité, la méthode IVIL serait un excellent outil pour étudier la distribution d'anticorps thérapeutiques comme PD-1/PD-L-1 ou HER233,34. Ces résultats sont extrêmement précieux pour comprendre pourquoi les thérapies ciblées sont efficaces dans certains cas favorisant le développement de nouvelles approches. Pris ensemble, ces exemples soulignent l'importance potentielle de l'approche IVIL.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) pour les discussions et l'utilisation de l'équipement. Nous remercions le Dr Juergen K. Willmann pour son mentorat. Cette étude a été appuyée par la subvention du NIH R21EB022214 (KEW), la subvention de formation NIH R25CA118681 (KEW) et le NIH K99EB023279 (KEW). Le Stanford Neuroscience Microscopy Service a été soutenu par NIH NS069375.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
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