Summary
De in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL)-methode kan worden gebruikt om in vivo biodistributie van antilichamen en antilichaam conjugaten voor oncologische doeleinden in levende organismen te onderzoeken met behulp van een combinatie van in vivo tumor targeting en ex vivo-immunokleuring Methoden.
Abstract
Monoklonale antilichamen (mAbs) zijn belangrijke instrumenten voor de opsporing, diagnose en behandeling van kanker. Ze worden gebruikt om de rol van eiwitten in tumorigenesis ontrafelen, kan worden gericht aan kanker biomarkers waardoor tumor detectie en karakterisering, en kan worden gebruikt voor kankertherapie als mAbs of antilichaam-drug conjugaten te activeren immune Effector cellen, remmen signalering van trajecten, of direct dodencellen die het specifieke antigeen dragen. Ondanks klinische ontwikkelingen in de ontwikkeling en productie van nieuwe en zeer specifieke mAbs, diagnostische en therapeutische toepassingen kunnen worden aangetast door de complexiteit en heterogeniteit van de tumor micro omgeving. Voor de ontwikkeling van efficiënte therapieën en diagnostiek op basis van antilichamen is het dus cruciaal om de biodistributie en interactie van het op antilichamen gebaseerde geconjugeerde met de levende tumor microomgeving te beoordelen. Hier beschrijven we in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL) als een nieuwe benadering om interacties van op antilichamen gebaseerde therapieën en diagnostiek in de in vivo fysiologische en pathologische omstandigheden te bestuderen. In deze techniek wordt een therapeutisch of diagnostisch antigeen-specifiek antilichaam intraveneus geïnjecteerd in vivo en gelokaliseerde ex vivo met een secundair antilichaam in geïsoleerde tumoren. IVIL weerspiegelt daarom de in vivo biodistributie van op antilichamen gebaseerde geneesmiddelen en doelstoffen. Twee IVIL-toepassingen worden beschreven bij het beoordelen van de biodistributie en de toegankelijkheid van contrastmiddelen op basis van antilichamen voor moleculaire beeldvorming van borstkanker. Dit protocol stelt toekomstige gebruikers in staat om de IVIL-methode aan te passen voor hun eigen op antilichamen gebaseerde onderzoekstoepassingen.
Introduction
Monoklonale antilichamen (mAb) zijn grote glycoproteïnen (ongeveer 150 kDa) van de immunoglobuline superfamilie die worden uitgescheiden door B-cellen en die een primaire functie in het immuunsysteem hebben om de biologische functie van, of markeren voor vernietiging, bacteriële of virale pathogenen, en kan abnormale eiwit expressie op kankercellen herkennen1. Antilichamen kunnen een extreem hoge affiniteit hebben met hun specifieke epitopen tot en met femtomollaire concentraties, waardoor ze veelbelovend zijn in biogeneeskunde2. Met de ontwikkeling van hybridoma-technologie door Milstein en Köhler (bekroond met de Nobel prijs in 1984), werd de productie van mAbs mogelijk3. Later werden menselijke MABS gegenereerd met behulp van de faag display technologie of transgene muis stammen en revolutioneerden hun gebruik als nieuwe research tools en Therapeutics4,5.
Kanker is een wereldwijd gezondheidsprobleem en een belangrijke doodsoorzaak die de behoefte aan nieuwe benaderingen voor preventie, opsporing en therapie6creëert. Tot nu toe, MABS hebben toegestaan verdrievoudiging van de rol van genen en hun eiwitten in tumorvorming en wanneer gericht tegen kanker biomarkers, kan tumor detectie en karakterisering voor patiënt stratificatie. Voor kankertherapie, bispecifieke mAbs, antilichaam-drug conjugaten, en kleinere antilichaam fragmenten worden ontwikkeld als Therapeutics, en voor de beoogde drug delivery ter verbetering van de therapeutische werkzaamheid7. Daarnaast dienen antilichamen voor de biomarker-targeting van contrastmiddelen voor moleculaire beeldvormings modaliteiten zoals fluorescentie geleide chirurgie, photoacoustic (PA) beeldvorming, echografie (VS) moleculaire beeldvorming en klinisch gebruikte positron-emissie tomografie (PET) of enkelvoudige foton emissie computertomografie (SPECT)8. Tot slot kunnen antilichamen ook worden gebruikt als theranostische middelen die stratificatie van patiënten mogelijk maken en respons monitoring voor gerichte therapieën9. Daarom beginnen nieuwe mAbs een cruciale rol te spelen bij de opsporing, diagnose en behandeling van kanker.
Ondanks kritische vooruitgang in de ontwikkeling en productie van nieuwe en zeer specifieke mAbs, diagnostische en therapeutische toepassingen kunnen worden weergegeven ineffectief als gevolg van de complexiteit van de tumor omgeving. Interacties tussen antilichamen zijn afhankelijk van het type epitope,d.w.z. ofhet lineair of conformationeel10is. Naast de herkenning van antigenen moeten antilichamen natuurlijke barrières overwinnen, zoals de wanden van het vat, basale membranen en de tumor stroma om doelcellen te bereiken die het antigeen uitdrukken. Antilichamen communiceren niet alleen met het weefsel via het variabele fragment antigen binding (FAB) domein, maar ook via het constant kristallijne fragment (FC) dat verder leidt tot off-site interacties11. Targeting wordt ook bemoeilijkt door de heterogene expressie van tumormarkers in de tumor bulk en heterogeniteit in tumor vascularisatie en het lymfestelsel12,13. Bovendien, de tumor micro omgeving is samengesteld uit kanker-geassocieerde fibroblasten die tumorcellen ondersteunen, tumor immune cellen die anti-tumor immuunreacties onderdrukken, en de tumor endotheel die het transport van zuurstof en voedingsstoffen ondersteunt, alle van die interfereren met de penetratie, distributie en beschikbaarheid van op antilichamen gebaseerde therapieën of diagnostiek. Algemene, deze overwegingen kunnen beperken therapeutische of diagnostische werkzaamheid, vermindering van de behandeling reactie, en kan resulteren in tumor resistentie.
Daarom is het voor de ontwikkeling van efficiënte op antilichamen gebaseerde therapieën en diagnostiek cruciaal om de biodistributie en interactie van het op antilichamen gebaseerde geconjugeerde in de tumor micro omgeving te beoordelen. Momenteel, in preklinische studies, marker expressie in tumor Research modellen wordt geanalyseerd ex vivo door immunofluorescentie (indien) kleuring van tumor secties14. Standaard indien kleuring wordt uitgevoerd met primaire marker-specifieke antilichamen die vervolgens worden gemarkeerd door secundaire fluorescently gelabelde antilichamen op ex vivo tumorweefsel segmenten die zijn geïsoleerd van het dier. Deze techniek benadrukt de statische locatie van de marker op het moment van weefsel fixatie en geeft geen inzicht in hoe de op antilichamen gebaseerde therapieën of diagnostiek in fysiologische omstandigheden kunnen verspreiden of ermee omgaan. Moleculaire beeldvorming door Pet, SPECT, US en PA kan informatie verschaffen over de verdeling van antilichamen-geconjugeerde contrast agenten in levende preklinische modellen8,15. Aangezien deze beeldvormings modaliteiten niet-invasief zijn, kunnen longitudinale onderzoeken worden uitgevoerd en kunnen tijdgevoelige gegevens worden verzameld met een minimaal aantal dieren per groep. Deze niet-invasieve moleculaire beeldvormings benaderingen zijn echter niet gevoelig genoeg en hebben onvoldoende resolutie voor de lokalisatie van antilichaam distributie op cellulair niveau. Bovendien kunnen de fysische en biologische kenmerken van het primaire antilichaam drastisch worden gewijzigd door de conjugatie van een contrastmiddel16.
Om de in vivo fysiologische en pathologische omstandigheden rekening te houden met de interactie van op antilichamen gebaseerde therapieën en diagnostiek binnen de tumor omgeving en om cellulaire en zelfs sub-cellulaire distributie met een hoge resolutie te verkrijgen profielen van niet-geconjugeerde antilichamen, stellen wij een IF-benadering voor, die wordt geacht in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL), waarbij het antigeen-specifieke antilichaam in vivo intraveneus wordt geïnjecteerd. De op antilichamen gebaseerde therapeutische of diagnostische, optredend als primair antilichaam, circuleert in functionele bloedvaten en bindt zich aan zijn doel proteïne in de uiterst nauwkeurige, levende tumor omgeving. Na isolatie van in vivo-gelabelde tumoren met het primaire antilichaam, wordt een secundair antilichaam gebruikt om geaccumuleerde en bewaarde antilichaam conjugaten te lokaliseren. Deze benadering is vergelijkbaar met een eerder beschreven als histologie benadering die fluorescently gelabelde antilichamen17injecteert. Hoewel hier, het gebruik van niet-geconjugeerde antilichamen vermijdt een mogelijke verandering in bioverdelings kenmerken veroorzaakt door modificatie van antilichamen. Bovendien vermijdt ex vivo toepassing van fluorescerende secundair antilichaam een mogelijk verlies van fluorescentie signaal tijdens het verzamelen en verwerken van weefsels en biedt versterking van de intensiteit van het fluorescentie signaal. Onze etiketterings aanpak weerspiegelt in vivo biodistributie van op antilichamen gebaseerde geneesmiddelen en doelstoffen en kan belangrijke inzichten bieden voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische en therapeutische middelen.
Hier beschrijven we twee toepassingen van de IVIL-methode zoals toegepast in eerdere studies die de biodistributie onderzoeken en de toegankelijkheid van antilichamen-gebaseerde contrastmiddelen voor moleculaire beeldvormings benaderingen voor borstkanker detectie. Ten eerste is de biodistributie van een antilichaam-near infrarood kleur conjugaat (anti-B7-H3-antilichaam gebonden aan de Near Infrared fluorescentie Dye, indocyanine Green, B7-H3-ICG) en het Isotype-controlemiddel (ISO-ICG) voor fluorescentie en fotoakoestisch moleculair beeldvorming is verkend18. De methode van deze toepassing wordt beschreven in het protocol. Vervolgens wordt de bioverdelings resultaten van een conformatief gevoelig antilichaam tegen netrin-1, meestal niet detecteerbaar met traditionele als beeldvorming, gebruikt met echografie moleculaire beeldvorming, gekwantificeerd en gepresenteerd in de representatieve resultaten19. Aan het einde van dit protocol papier moeten lezers zich comfortabel voelen bij het aannemen van de IVIL-methode voor hun eigen op antilichamen gebaseerde onderzoekstoepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel administratief panel voor laboratorium Animal Care (APLAC) van Stanford University.
1. transgene muismodel van borstkanker ontwikkeling
- Observeer muizen van het gewenste kanker model voor de juiste tumorgroei via palpatie of remklauw-meting voordat u doorgaat.
Opmerking: hier werd het transgene Murine model van borstkanker ontwikkeling (FVB/N-TG (MMTV-PyMT) 634Mul/J) (MMTV-PyMT) gebruikt. Deze dieren ontwikkelen spontaan invasieve borst carcinomen tussen 6 en 12 weken oud in elke borstklier20. Normale borstklieren werden gebruikt als controle van de transgene-negatieve, leeftijd overeenkomende littermates.
2. intraveneuze injectie van specifieke en niet-specifieke antilichaam middelen
- Purify Rabbit anti-Mouse B7-H3 en Rabbit IgG Isotype-antilichamen op een ontzuigerkolom (bijv. PD-10) om conserveringsmiddelen en opslag buffers te verwijderen volgens de instructies van de fabrikant.
Opmerking: Sommige antilichamen hebben mogelijk verdere zuivering nodig met eiwit-A agarose kralen gebaseerd protocol21. - Aliquot doseringen van 33 μg van elk antilichaam geconjugeerd in individuele microcentrifuge buizen.
Opmerking: de dosering van de toegediende agent kan variëren afhankelijk van de toepassing en overeenkomt met de doseringen waarbij het antilichaam conjugaat routinematig wordt gebruikt. De concentratie van de antilichaam oplossingen is vereist als het volume meer dan 100 μL voor de veiligheid van dieren is. - Op het gewenste tijdstip vóór de weefsel verzameling, hier 96 h, anesthetiseer de tumor lager dier met 2% Isofluraan stroomt in zuurstof op 2 L/min, en plaats op een 37 ° c verwarmd podium. Doe een teen knijpen om ervoor te zorgen dat het juiste niveau van anesthsia werd bereikt vóór de procedure.
- Ter voorbereiding op de staart ader inoculatie van de antilichaam oplossingen Desinfecteer de staart van het dier door drie keer te vegen met een alcoholdoekje. Laat de staart aders verwijden door te verwarmen met een warmte pad voor ongeveer 30 s. Vermijd het verwarmen van het hele dier. Veeg de staart opnieuw met een alcoholdoekje na het verwijderen van de Heat pad.
- Steek de vlindernaald in een van de twee laterale staart aders met behulp van een 27G staart ader katheter en bevestig de staart met de ingebracht naald op het podium met een stukje chirurgische tape.
Opmerking: zichtbare bloed terugstroming in de katheter geeft de juiste plaats van de naald in de staart ader aan. - Spoel de katheter met 25 μL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en Injecteer vervolgens de antilichaam vloeistof in de katheter met behulp van insuline spuiten. Spoel de katheter nogmaals met 25 μL steriele PBS.
- Verwijder de naald van de staart en druk op om eventuele bloedingen te stoppen.
- Schakel anesthesie uit en observeer het dier totdat het volledig wakker is voor tekenen van nood.
3. verzameling en bereiding van doel tumorweefsels
- Op het gewenste moment, humaan euthanaëren het dier volgens de aanvaardbare institutionele procedure, hier, door geleidelijke inademing van 100% CO2 uit een gecomprimeerde gastank met een kamer verplaatsing debiet van 10-30% volume/min.
Opmerking: sommige toepassingen van de ivil-techniek vereisen euthanasie door cardiale perfusie met PBS om vrij Circulerend antilichaam te verwijderen19,22. - Na bevestiging van humane euthanasie via stopzetting van de Ademhalings-en cardiale beweging, gebrek aan teen knijpen reactie, en vergrijzing van de slijmvliezen, accijnzen tumorweefsels met behulp van chirurgische schaar en Tang als volgt:
- Leg de muis in de liggende positie en grijp alleen de buitenste laag van de huid tussen de set van borstklieren die het dichtst bij de staart (5th) met een tang, maak een kleine incisie met een paar chirurgische schaar.
- Introduceer de gesloten schaar in de snede en open de punt langzaam om de huid van de onderliggende buikwand membraan zorgvuldig te scheiden en intact te houden.
- Maak een verticale incisie van de buik, blijven scheiden van de huid van het binnenste membraan. Tussen de 3RD en 4th borstklieren, maak een horizontale snede over de buik om terugtrekking van de huid en visualisatie van de borstklieren toe te staan.
Opmerking: borsttumoren en klieren bevinden zich oppervlakkig onder de huid. - Door elke tumor of normale klier met een tang te grijpen, de bijgevoegde huid zorgvuldig af te knippen met behulp van een chirurgische schaar.
- Plaats uitgesneden weefsels in weefsel wegwerp basis mallen, prelabeled en gevuld met optimale snijtemperatuur (OCT) insluitings medium en Vries de mallen snel door plaatsing op droogijs. Om af-doel levering te bestuderen, accijnzen andere weefsels of organen van belang(bijvoorbeeld delever of de longen).
Opmerking: om het protocol op dit punt te onderbreken, bewaart u bevroren weefsel blokken bij-80 °C totdat u klaar bent om verder te gaan. - Met behulp van een cryostat, sectie bevroren weefsel blokken op 10 μm dikte en plaats aangrenzende secties op prelabeled adhesieve glas dia's.
Opmerking: om het protocol op dit punt te onderbreken, slaat u dia's op-80 °C totdat u klaar bent om verder te gaan.
4. ex vivo-kleurings Protocol
Opmerking: voor de kwantitatieve vergelijking tussen fluorescentiemicroscopie beelden worden alle dia's tegelijkertijd gekleurd met dezelfde bereide oplossingen.
- Spoel bevroren weefsel dia's met kamertemperatuur PBS gedurende 5 minuten om OCT te verwijderen.
- Afbakenen van weefsel secties met een hydrofobe barrière pen om het volume van de tijdens de kleuring benodigde oplossingen te verminderen.
Opmerking: Zorg ervoor dat de pen niet over de weefselmonsters loopt omdat deze het weefsel van de glijbaan kan verwijderen of de juiste kleuring op het aangetaste weefsel gedeelte voorkomt. Laat de weefsel secties op geen enkel moment dehydraat. - Fixeer de weefsel secties met 4% Paraformaldehyde oplossing gedurende 5 min.
- Spoel de dia's in PBS gedurende 5 minuten.
- Permeabilize weefsel secties met 0,5% Triton-X 100 in PBS gedurende 15 min.
- Spoel de dia's in PBS gedurende 5 minuten.
- Blokkeer de weefsels met 3% w/v boviene serumalbumine (BSA) en 5% v/v geit serum, beide in PBS (blokkerende oplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: overeenkomen met de blokkerende oplossing serum aan de secundaire antilichaam host dier. - Spoel de dia's in PBS gedurende 5 minuten.
- Inbroed secties met primaire antilichamen met record behoud zoals gewenst, mogelijk een gemeenschappelijk nucleair (bijv. DAPI), vasculaire (bijv. CD31) of cytoplasma marker (bijv. actin). Hier werd rat anti-muis CD31 (vasculaire marker) bij een verdunning 1:100 gebruikt volgens de instructies van de fabrikant in de blokkerende oplossing 's nachts bij 4 °C beschermd tegen uitdroging op een diapresentatie.
Opmerking: Voeg geen aanvullend primair antilichaam of antilichaam conjugaat toe. Het geconjugeerde dat werd geïnjecteerd en toegestaan om zich te accumuleren in de weefsels in vivo fungeren als primair antilichaam. - Spoel dia's in PBS gedurende 5 minuten driemaal, waarbij elke keer de PBS wordt gewijzigd.
- Incuberen dia's met secundaire antilichamen om primaire antilichamen te labelen. Visualiseer voor deze toepassing anti-B7-H3-antilichamen met AlexaFluor-546 geconjugeerd geit anti-konijnen antilichaam (1:200 verdunning, geoptimaliseerd volgens de instructies van de fabrikant) en CD31 met AlexaFluor-488 geitenanti-rat secundair antilichaam (1:200 verdunning, geoptimaliseerd volgens de instructies van de fabrikant) in blokkerende oplossing, beschermd tegen licht en uitdroging op een diaplade, voor 1 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: secundaire antilichamen zijn afkomstig van hetzelfde gastheer dier, maar komen overeen met de affiniteit van de secundaire antilichamen tegen de hostsoorten van het respectieve primaire antilichaam. Dia's zijn vanaf dit punt beschermd tegen licht. - Spoel dia's in PBS gedurende 5 minuten driemaal, waarbij elke keer de PBS wordt gewijzigd.
- Breng één druppel van het afdekmedium in het midden van het weefsel segment en plaats voorzichtig een dekslip om het inbouwen van luchtbellen te vermijden.
- Sluit de randen van de Afdeklijst af met blanke nagellak en laat drogen.
Opmerking: om het protocol voor maximaal een week op dit punt te onderbreken, slaat u dia's op-20 °C op totdat u klaar bent om verder te gaan.
5. confocale microscopie beeldvorming en kwantitatieve beeldanalyse
Opmerking: de voorbereiding van de confocale Microscoop en de beeldvormings parameters is afhankelijk van het gebruikte confocale systeem. De hier gebruikte Microscoop werd commercieel aangekocht (bijv. Zeiss LSM 510 meta systeem) en de bijbehorende acquisitie software werd gebruikt (bijv. Zen 2009). Veel van deze stappen zijn echter van toepassing op elke confocale Microscoop en veronderstellen elementaire confocale microscopie kennis.
- Nadat het systeem is ingeschakeld en opgewarmd, selecteert u de gewenste doelstelling; Hier werd een 20x-doelstelling (numeriek diafragma = 0,8) gebruikt.
- Laad een positieve controle-Slide, dekslip naar beneden, om de optimalisatie voor het helderste signaal in te stellen. Imaging in het rode kanaal, focus het systeem op het voorbeeld in Live Imaging mode.
- Optimaliseer voor elk gebruikte laser kanaal de laserintensiteit, de Master Gain en de pinhole grootte als volgt:
- Overschakelen naar continue modus voor Imaging.
- Optimaliseer de laserintensiteit (die de laser stroom regelt) en Gain (Master) (die de spanning regelt voor fotomultiplicator-buis) schuifbalken terwijl het Lut-histogram (look up Table) wordt bewaakt. Pas deze twee instellingen aan totdat het dynamische bereik van het histogram is opgevuld zonder de pixels te verzaveren.
Opmerking: als de laserintensiteit te hoog fotobleaching zal optreden. Als de versterking (Master) te hoog is, zal de afbeelding luidruchtig worden. Idealiter wordt de versterking (Master) in het midden van het bereik. - Stel de pinhole in op 1 Airy Unit (AU), die de hoogste resolutie en de dunste z-slice geeft.
- Schuif de digitale offset balk om de ruisvloer op het Lut-histogram te minimaliseren voor een echte zwarte achtergrond.
Opmerking: zodra de microscopie-instellingen zijn geoptimaliseerd voor elk Laser kanaal en elke doelstelling, houd ze constant gedurende de Imaging sessie en voorbeeld vorming van alle dia's, om de kwantitatieve vergelijking tussen dia's mogelijk te maken.
- Selecteer onder het tabblad acquisitie modus onder gemiddeldehet gewenste aantal en de bitdiepte. Klik op de knop optimaal om de optimale pixelgrootte in te stellen.
- Gebruik de knop aankoop magnetisch om een afbeelding van hoge kwaliteit te verzamelen. Hier, willekeurige velden van uitzicht werden geselecteerd uit binnen de tumor, maar andere gebieden van belang kunnen gelden voor verschillende toepassingen (vaten, tumor marges, penetratie diepte, enz.)
- Sla afbeeldingsbestanden op in het formaat dat wordt gebruikt door de confocale software (hier, ". lsm") voor offline verwerking en kwantificering.
Opmerking: als niet alle dia's tijdens dezelfde sessie worden afgebeeld, slaat u de instellingen op en laadt u ze opnieuw op bij volgende bezoeken, hoewel reimaging van dezelfde dia niet wordt aanbevolen vanwege fotobleaching. - De kwantitatieve metingen van de fluorescentie intensiteit uitvoeren. Open Fiji (Fiji is gewoon imagej-software)19,23 en laad een. lsm-afbeeldingsbestand door naar de statusbalk te slepen.
- Splits de gegevens van het kleurkanaal. Ga naar afbeelding ≫ stapels ≫ gesplitste kanalen.
- Voorverwerken van de fluorescentie beelden indien nodig, d.w.z. aftrekken van het achtergrond signaal (proces ≫ achtergrond aftrekken) of verminder het geluid via een filtermethode.
- Segmenteer het kleurkanaal dat overeenkomt met het referentie-eiwit (vasculaire, nucleaire, cellulaire vlek) door een drempelwaarde op de signaalintensiteit in te stellen (afbeelding > ≫ drempel aan te passen).
Opmerking: handmatige drempelmethode introduceert subjectiviteit in de beeldanalyse, daarom, met behulp van een geautomatiseerde drempel-algoritme of verwijzen naar afbeelding histogrammen maakt beeldanalyse resultaten minder bevooroordeeld. - Gebruik deze drempelwaarde voor het maken van een binair masker (proces ≫ binaire ≫ converteren naar masker).
- Meet en label ROIs binnen het masker (analyseer ≫ deeltjes analyseren ≫ Controleer toevoegen aan Manager > OK).
- Breng ROIs aan op het kleurkanaal dat overeenkomt met het antilichaam van belang (Klik op kanaalafbeelding, analyseer ≫ Tools > ROI Manager ≫ meting). Dit zal het masker ROIs toepassen op de antilichaam afbeelding en bieden beeld metingen voor label secties in de resultatenvenster. Venster resultaten opslaan (bestand ≫ opslaan).
- Bereken de gewenste rente statistiek, zoals de gemiddelde fluorescentie intensiteit zoals hier beschreven24.
- Alle verwerkingsstappen identiek uitvoeren aan elke afbeelding in een set dia's. Maak een macro om dit automatisch te doen voor grote afbeeldings batches23.
- Pas bij beeldweergave na kwantitatieve metingen kwalitatieve beeldaanpassingen toe om visualisatie van bioverdelings patronen te optimaliseren door de minimale, maximale, helderheid en het contrast aan te passen op dezelfde niveaus op alle dia's (afbeelding ≫ aanpassen > Helderheid/contrast).
- Converteer het afbeeldingstype (afbeelding ≫ type > RGB-kleur) en sla bestanden op in een verliesloos afbeeldingstype zoals. TIFF (bestand > opslaan als > TIFF...) voor gebruik in presentaties en publicaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De IVIL-methode werd hier gebruikt om de in vivo biodistributie en weefsel interactie van B7-H3-ICG en ISO-ICG te onderzoeken, door de agentia, na intraveneuze injectie in een levend dier, toe te staan om met het doelweefsel te communiceren voor 96 h, en vervolgens zodra de weefsels als primaire antilichamen tijdens ex vivo-immunokleuring. De IVIL-methode werd ook vergeleken met de standaard ex vivo als kleuring van de weefsels voor de markering B7-H3. Normale muriene borstklieren niet uitdrukken de B7-H3 marker, bevestigd in de ex vivo, standaard bij kleuring, en niet accumuleren antilichamen via andere passieve mechanismen, en daarom geen accumulatie van B7-H3-ICG of ISO-ICG werd gedetecteerd, representatieve van een negatief resultaat (Figuur 1, bovenste rij). Echter, Murine borsttumoren Express B7-H3 zowel in de vasculatuur en epitheel (zoals bevestigd door standaard bij kleuring), en IVIL was in staat om de B7-H3-ICG agent die sterk had opgebouwd op de vasculatuur te markeren en was in staat om gedeeltelijk extravasate van de vasculatuur te binden aan de kankercellen zelf hoewel op een heterogene manier in vergelijking met de uniforme verdeling van de B7-H3 marker door de tumoren, ook weergegeven in Figuur 1, onderste rij. Bovendien, ook al heeft de ISO-ICG agent geen moleculaire specificiteit, het bleek nog steeds op een niet-specifieke manier accumuleren, als gevolg van FC interacties, slechte interstitiële drainage, en de verbeterde permeabiliteit en retentie-effect binnen Murine borst tumoren (Figuur 1). Dit verschil wordt benadrukt in de bioverdelings patronen die tussen de twee agenten worden weergegeven, en versterkt de specifieke bindende resultaten van het specifieke antilichaam middel en vertegenwoordigt twee mogelijke uitkomsten van een positief resultaat.
De representatieve resultaten van de B7-H3-ICG tonen aan hoe de IVIL-methode kan worden gebruikt als een kwalitatieve methode om algemene biodistributie van antilichamen/antilichamen te beschrijven. Soms kan echter een meer kwantitatieve interpretatie nodig zijn, of een antilichaam kan een zeer gevoelige, conformatiespecifieke bindingscapaciteit hebben. In deze situaties kan IVIL ook de gewenste informatie verschaffen. In een tweede voorbeeld, waarin de uitdrukking van netrin-1 eiwit in tumorweefsels en de co-lokalisatie met CD31-positieve tumor endotheel moest worden bestudeerd, werd de ivil-techniek ook met succes toegepast19.
Netrin-1 is een uitgescheiden 65 kDa-eiwit dat overdreven wordt uitgedrukt in bepaalde soorten kanker, zoals gemetastaseerde borstkanker25,26. Om een moleculaire beeldvormings benadering voor netrin-1 te ontwikkelen, moest de in vivo beschikbaarheid van het eiwit worden bepaald19. Ook, omdat het anti-netrin-1 antilichaam niet voldoende affiniteit heeft voor zijn antigeen na weefsel fixatie, een alternatief kleurings protocol voor klassieke Immunohistochemie of als kleuring nodig was en IVIL werd geïmplementeerd. Gehumaniseerd anti-netrin-1 antilichaam en een humaan IgG Isotype Control antilichaam werden intraveneus geïnjecteerd 24 h voorafgaand aan cardiale perfusie en tumor verzameling. Cardiale perfusie werd toegepast om niet-specifieke achtergrondkleuring in de vasculatuur te verminderen en om de detectie van significante anti-netrine-1-antilichaam accumulatie in vergelijking met het Isotype-controle-antilichaam signaal te verbeteren wanneer de doel uitdrukking beperkt is. Tumor secties waren gelabeld ex vivo met vasculatuur highlighting anti-CD31 antilichaam (rat anti-muis CD31 antilichaam (tabel van de materialen) en fluorescerende secundaire antilichamen, Alexa 488-gekoppelde geit anti-rat igg, 1:500 verdunning en Alexa Fluor 594- gekoppelde geit anti-menselijke IgG, 1:500 verdunning respectievelijk) werden gebruikt om te onthullen anti-netrin-1/Isotype en anti-CD31 mAbs. De fluorescentie-signaal intensiteiten van het anti-netrin-1-en Isotype-controle-antilichaam werden gekwantificeerd om de verschillen in kleuring te bepalen die co-gelokaliseerd waren met CD31. Figuur 2 toont aan dat de anti-netrin-1 antilichaam specifiek verzameld in het epitheel tumor compartiment van Mmtv-PyMT borstkanker tumoren (een positief resultaat), terwijl er geen signaal in normale borstklieren (een negatief resultaat). Het antilichaam verder co-gelokaliseerd met de endotheliale marker CD31. Vergelijking met Isotype-antilichamen-geïnjecteerde tumoren en normale klieren toonden aan dat epitheliale accumulatie specifiek was voor het tumorweefsel. Er was signaal accumulatie in de endotheliale cellen van zowel tumoren en normale klieren als gevolg van netrin-1 binding (tumoren) en niet-specifieke FC interacties (tumoren en normale borstklieren)11. Zo was het fluorescentie signaal kwantificering met behulp van een CD31-gebaseerd binair masker vereist en toonde aan dat het anti-netrin-1-antilichaam signaal significant hoger was dan het signaal van het Isotype-controle-antilichaam in het tumorweefsel, wat suggereert dat netrin-1 specifiek verzameld in het tumor endotheel.
Figuur 1 : Representatieve confocale micro foto's van de vergelijking van specifieke B7-H3 antilichamen-ICG geconjugeerde en niet-specifieke Isotype-controle antilichamen-ICG conjugaat lokalisatie in muriene borstklieren die normale of carcinoom weefsels bevatten. (Boven) Normale muriene borstklieren van een dier intraveneus geïnjecteerd met 33 μg ISO-ICG of B7-H3-ICG (rood) en contra gekleurd met CD31 (groen) die geen kleuring van de antilichaam conjugaten vertonen. Normale weefsels bleken geen uitdrukking te hebben van B7-H3 bij standaard ex vivo bij kleuring. (Onder) Invasieve borsttumoren van een dier intraveneus geïnjecteerd met 33 μg B7-H3-ICG of ISO-ICG (rood) en vasculaire contra-gekleurd CD31 (groen) met uitgebreide, heterogene kleuring, hoewel met verschillende distributiepatronen, voor zowel de B7-H3-ICG en ISO-ICG-agenten. B7-H3-ICG bindt sterk aan de vasculatuur, het eerste aanspreekpunt in vivo, en kan vervolgens extravaseren van de vasculatuur naar heterogene vlek het tumor epitheel. ISO-ICG toont niet-specifieke accumulatie binnen de tumorweefsels. Standaard ex vivo als vlekken een uniforme uitdrukking van de B7-H3 marker op epitheliale en endotheliale cellen vertoont. Gele kleur duidt op co-gelokaliseerd rood en groen kanaal signaal. Schaalbalk is 100 μm en consistent tussen panelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : In vivo immuno-lokalisatie van netrin-1 in MMTV-PyMT borsttumoren. (Links) Representatieve confocale micro foto's van de ivil-methode om netrin-1-expressie (rood) of Isotype-controle-expressie (rood) in muriene carcinoom en normale borstklieren te detecteren. IVIL bevestigt epitheel signaal voor netrin-1 in MMTV-PyMT tumoren maar niet in normale borstklieren, en sterke netrin-1 signaal op endotheliale cellen (CD31 kleuring, groen) in borsttumoren en significant zwakker signaal van netrin-1 in normale borstklieren. Gele kleur duidt op co-gelokaliseerd rood en groen kanaal signaal. Schaal staven geven 20 μm aan. Voor de detectie van netrin-1 eiwit in het tumor endotheel, 100 μg primair gehumaniseerd NET1-H-mAb of 100 μg humaan IgG Isotype controle antilichaam werden intraveneus geïnjecteerd 24 H voorafgaand aan de tumor verzameling. Vrij Circulerend antilichaam werd verwijderd door cardiale perfusie met PBS en tumorweefsel werd geïsoleerd, Flash bevroren, en gesectioneerd bij 15 μm dikte op een cryostat. Endotheliale cellen werden gelabeld met primaire rat anti-muis CD31 antilichaam gevolgd door secundaire Alexa 488-gekoppelde geit anti-rat IgG. Om het primaire antilichaam te onthullen gericht op netrin-1, secundaire Alexa Fluor 594-gekoppelde geit anti-menselijke IgG werd gebruikt. Om een onspecifieke interactie van secundaire antilichamen van de geit te voorkomen, werden weefselmonsters geblokkeerd met geiten serum. (Rechts) Staafdiagram dat de kwantificering van anti-netrin-1 of Isotype-controle antilichaam signaal markeert dat colocaliseert met anti-CD31 antilichaam signaal. N = 13 tumoren (van twee muizen) per groep MMTV-PyMT en N = 7 borstklieren (van één muis) per groep van normale klieren; Foutbalken aanwezig SEM; Vergelijkingen met twee groepen werden uitgevoerd met de t-toets van de student. Afbeelding herdrukt met toestemming van 19 onder de Creative Commons licentie CC door 4,0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode heeft verschillende kritieke stappen en vereist mogelijke wijzigingen om te zorgen voor een geslaagde implementatie. Ten eerste moet de dosering en timing van de intraveneuze injectie van antilichaam/antilichaam conjugaat worden afgestemd op de specifieke toepassing. In het algemeen moeten doseringen worden gebruikt die consistent zijn met hoe het antilichaam conjugaat meestal zal worden gebruikt, d.w.z. overeenkomende doseringen van het therapeutische antilichaam of contrastmiddel op basis van antilichamen. Ook moet de timing van de verzameling van doelweefsels zorgvuldig worden overwogen. Antilichamen en antilichaamconjugaten hebben langere omlooptijden dan standaard medicijnen en contrastmiddelen, maar deze zijn zeer variabel en moeten worden geoptimaliseerd voor de gewenste toepassing, maar het wordt aanbevolen om ten minste 24 uur circulatie tijd toe te staan27 . Ten tweede, tijdens de doelweefsel verzameling, kan het nodig zijn om een intracardiale perfusie techniek te implementeren om vrij Circulerend antilichaam uit het bloed zwembad te verwijderen19. Tijdens het kijken naar tumor verdeling van B7-H3-ICG, het werd onnodig gevonden als gevolg van voldoende lange omlooptijden (96 h) en de extravasculaire lokalisatie van de agent. Voor de netrin-1 toepassing van de IVIL-methode werd cardiale perfusie echter als relevant beschouwd vanwege de endotheliale expressie van netrin-1 en het relatief lage expressie niveau. Ten derde is het tijdens de weefsel kleuring van ex vivo van essentieel belang om dia's te vlekken die tijdens dezelfde sessie kwantitatief worden vergeleken en met dezelfde oplossingen om normale variaties tussen batches te voorkomen. Zorg ervoor dat de dia's goed worden gespoeld tussen de stappen en de hydrofobe pen oplossing komt niet in aanraking met het weefsel om suboptimale kleuring te voorkomen. Tot slot, tijdens confocale microscopie, Handhaaf dezelfde Imaging-instellingen tussen dia's om relatieve kwantificering mogelijk te maken en snel te werken om fotobleking van de dia's te voorkomen. Deze belangrijke punten zullen de kans op een succesvolle IVIL-implementatie vergroten.
De IVIL-methode heeft verschillende voordelen. Ten eerste, terwijl de methode is vergelijkbaar met de standaard als technieken, de twee bieden aanzienlijk verschillende informatie. Als kleuring de anatomische locatie van moleculaire markers in weefsel aangeeft op een bepaald tijdstip (toen het weefsel werd verzameld en gefixeerd). IVIL verschaft echter informatie over hoe een antilichaam of antilichaam conjugaat, zoals blijkt uit de lokalisatie van B7-H3-ICG, de distributie en interactie, of dat nu specifieke of niet-specifieke accumulatie, internalisering of retentie in de doel Weefsel. Dit is van cruciaal belang voor farmacokinetische/dynamische en biodistributie studies. Ten tweede zijn traditionele IF-methoden soms beperkt door fixatie van de weefsels die antigeen vervorming of afscherming kunnen veroorzaken die de binding door het primaire antilichaam28kan verhinderen. Daarom kan IVIL nuttig zijn als standaard als vlekken of immunohistochemie falen. De IVIL-techniek kan worden beschouwd als een aanvullende methode om in vivo activiteit van antilichamen te verifiëren die anders niet detecteerbaar zou zijn. Ten slotte zullen degenen die vertrouwd zijn met traditionele als kleurings technieken de methode eenvoudig in uitvoering vinden en de meeste vereiste materialen bij de hand hebben.
De IVIL-methode heeft een aantal beperkingen. Ten eerste, vanwege de noodzaak om het dier te euthaniteren om de doelweefsels te oogsten, verschaft IVIL alleen biologische interactie-informatie op een enkel tijdstip. Injectie van het primaire antilichaam of antilichaam geconjugeerde op verschillende tijdstippen in verschillende dieren zal een breder tijdvenster van informatie over de biodistributie en in vivo interactie mogelijk maken. Ten tweede, als gebruikers niet bekend zijn met in vivo dier technieken, zoals intraveneuze staart ader injectie of potentiële intracardiale perfusie, kan dit een beperking van de methode zijn. Deze methoden vereisen bekwaam personeel om betrouwbaar te presteren. Echter, gebruik van een katheter tijdens de injectie van de staart ader zorgt ervoor dat de toediening van de volledige dosis als juiste naald plaatsing kan worden bevestigd voor injectie. Bovendien, een alternatief voor de staart ader injectie die kan worden overwogen is retro-orbitale injectie, die meestal een hoger slagingspercentage met minder ervaren personeel. De noodzaak om alle weefsel glaasjes in dezelfde partij te vlekken en te maken om kwantitatieve beoordeling mogelijk te maken, beperkt het aantal monsters en markers dat in een enkele studie kan worden opgenomen. De studie moet mogelijk worden georganiseerd in seriële kleuring op verschillende dagen en op aangrenzende weefsel segmenten om de gewenste informatie te verzamelen. Ten slotte werpt het gebruik van soort-gecompenseerde antilichamen, d.w.z. muriene anti-muis antilichamen in muriene preklinische modellen, een probleem op van niet-specifieke achtergrondkleuring met secundaire antilichamen. Zo is het gebruik van soorten-niet-overeenkomende primaire antilichamen vereist zoals aangegeven in dit onderzoek, of moeten fluorescently gelabelde soorten primaire antilichamen worden gebruikt.
De IVIL-techniek is nuttig voor de analyse van de biodistributie van diagnostische en therapeutische antilichamen voor veel toepassingen. Verschillende toepassingen voor de intraveneuze antilichamen of ligand injectie en ex vivo weefsel analyse zijn eerder gerapporteerd en bevestigen de belangstelling om deze kleurings procedure op grote schaal in te voeren. Robertson en collega's gelabeld vasculaire elementen zoals endotheel capillairen en grotere vaten met intraveneuze injecties van Lycopersicon esculentum agglutinine (tomaat lectine)29. De techniek was compatibel met histochemie en immunocytochemie en toonde vasculaire patronen en functionele parenchymale kenmerken. Het gebruik van fluorescerende liganden werd echter beperkt door de snelle afbraak van fluorescentie bij injectie30. Zoals blijkt uit het IVIL-protocol, kan de injectie van een primair antilichaam in vivo, gevolgd door ex-vivo-labeling met een secundair fluorescerende antilichaam, een robuustere benadering zijn. Een andere interessante toepassing van dit type in vivo als kleuring is de labeling van intravasculaire lymfocyten zoals aangetoond door Anderson en collega's31. Intraveneus geïnjecteerd antilichaam werd gebruikt voor het labelen van lymfocyten gelokaliseerd in bloedvaten, die vervolgens werden verzameld en verder verwerkt voor Flowcytometrie analyse van immunologische markers. Tot slot, om de levering en histologische lokalisatie van antilichaam therapieën te beoordelen die werden geleverd aan patiënten met plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en de nek (HNSCC), werd een eerste in-menselijke studie van antilichaam distributie uitgevoerd met systemisch toegediend in de buurt van-infrarood fluorescently gelabeld therapeutisch antilichaam cetuximab-IRDye800CW32. De gegevens werden vergeleken met histologische analyses en toonden aan dat het fluorescerende signaal daalde met afstand van de tumor die specificiteit bevestigt. Hoewel, het therapeutische antilichaam niet alle gebieden van antigeen expressie bereikt, met name de goed gedifferentieerde tumor gebieden met hoge niveaus van de epidermale groeifactor receptor (EGFR) antigeen. In de huidige context van kankeronderzoek gericht op de ontwikkeling van gerichte therapieën en immunotherapieën die sterke weerstand en gebrek aan werkzaamheid tegenkomen, zou de IVIL-methode een uitstekend hulpmiddel zijn om de verdeling van therapeutische antilichamen te bestuderen zoals PD-1/PD-L-1 of HER233,34. Deze resultaten zijn zeer waardevol om te begrijpen waarom gerichte therapieën effectief zijn in bepaalde gevallen die de ontwikkeling van nieuwe benaderingen bevorderen. Samen met deze voorbeelden wordt het potentiële belang van de IVIL-benadering belicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy service) voor discussies en het gebruik van apparatuur. We danken Dr. Juergen K. Willmann voor zijn mentorschap. Deze studie werd ondersteund door NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA118681 training Grant (KEW) en NIH K99EB023279 (KEW). De Stanford Neuroscience microscopie service werd ondersteund door NIH NS069375.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
- Forthal, D. N.
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al.
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B.
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
