Summary
Metoden in vivo immunofluorescenslokalisering (IVIL) kan användas för att undersöka in vivo biodistribution av antikroppar och konjugat av antikroppar för onkologiska ändamål i levande organismer med hjälp av en kombination av in vivo tumör inriktning och ex vivo immunofärgning Metoder.
Abstract
Monoklonala antikroppar (mAbs) är viktiga verktyg för att upptäcka, diagnostisera och behandla cancer. De används för att riva upp den roll som proteiner i tumorigenes, kan riktas till cancer biomarkörer som möjliggör tumör detektion och karakterisering, och kan användas för cancerbehandling som mAbs eller antikropp-läkemedel konjugat för att aktivera immun effektorceller, att hämma signalvägar, eller direkt döda celler som bär det specifika antigenet. Trots kliniska framsteg i utvecklingen och produktionen av nya och mycket specifika mAbs, diagnostiska och terapeutiska tillämpningar kan försämras av komplexiteten och heterogenitet av tumören mikromiljö. Således, för utveckling av effektiva antikroppsbaserade terapier och diagnostik, det är viktigt att bedöma biodistribution och interaktion av antikropp-baserade konjugatet med levande tumör mikromiljö. Här beskriver vi in vivo Immunofluorescenslokalisering (IVIL) som en ny metod för att studera interaktioner mellan antikroppsbaserade Therapeutics och diagnostik i in vivo fysiologiska och patologiska tillstånd. I denna teknik injiceras en terapeutisk eller diagnostisk antigen-specifik antikropp intravenöst in vivo och lokaliserad ex vivo med en sekundär antikropp i isolerade tumörer. IVIL återspeglar därför in vivo biodistribution av antikroppsbaserade läkemedel och riktade medel. Två IVIL applikationer beskrivs bedömning av biodistribution och tillgänglighet av antikroppsbaserade kontrastmedel för molekylär avbildning av bröstcancer. Detta protokoll kommer att göra det möjligt för framtida användare att anpassa IVIL-metoden för sina egna antikroppsbaserade forskningstillämpningar.
Introduction
Monoklonala antikroppar (mAb) är stora glykoproteiner (ca 150 kDa) av den immunglobulin superfamiljen som utsöndras av B-celler och har en primär funktion i immunsystemet för att identifiera och antingen hämma den biologiska funktionen av, eller mark för förstörelse, bakteriella eller virala patogener, och kan känna igen onormala proteinuttryck på cancerceller1. Antikroppar kan ha en extremt hög affinitet till sina specifika epitoper ner till femtomolar koncentrationer vilket gör dem mycket lovande verktyg i biomedicin2. Med utvecklingen av Hybridomteknik teknologi av Milstein och Köhler (tilldelat Nobel priset i 1984), blev produktionen av Mabs möjligheten3. Senare, mänskliga Mabs genererades med hjälp av fagdisplay teknik eller transgena mus stammar och revolutionerade deras användning som nya forskningsverktyg och Therapeutics4,5.
Cancer är en global hälsofråga och en viktig dödsorsak som skapar behovet av nya metoder för att förebygga, upptäcka och terapi6. Hittills har Mabs tillåtit losstagning av rollen av gener och deras proteiner i tumorigenes och när riktas mot cancer biomarkörer, kan möjliggöra tumör detektering och karakterisering för patientens stratifiering. För cancerbehandling, bispecific mAbs, antikropp-läkemedel konjugat, och mindre antikroppar fragment utvecklas som Therapeutics, och för riktade läkemedelsleverans för att förbättra terapeutisk effekt7. Dessutom används antikroppar för biomarkör inriktning av kontrastmedel för molekylära avbildningsmetoder såsom fluorescensstyrd kirurgi, Fotoakustisk (PA) avbildning, ultraljud (US) molekylär avbildning, och kliniskt använda positron emission tomografi (PET) eller singelfotonemission datortomografi (SPECT)8. Slutligen, antikroppar kan också användas som theranostic agenter möjliggör stratifiering av patienter och respons övervakning för riktade terapier9. Därför, nya mAbs börjar spela en kritisk roll i cancer upptäckt, diagnos, och behandling.
Trots kritiska framsteg i utvecklingen och produktionen av nya och mycket specifika mAbs, diagnostiska och terapeutiska tillämpningar kan göras ineffektiva på grund av komplexiteten i tumör miljön. Antikropps interaktioner är beroende av vilken typ av epitop, dvs,om det är linjär eller överensstämande10. Förutom erkännandet av antigener, antikroppar måste övervinna naturliga barriärer såsom kärlväggar, basalmembran, och tumören stroma att nå målceller som uttrycker antigen. Antikroppar interagera med vävnaden inte bara genom variabeln fragment antigen binding (fab) domän utan också genom konstant kristallint fragment (FC) som ytterligare leder till off-site interaktioner11. Inriktning kompliceras också av det heterogena uttrycket av tumörmarkörer i hela tumören bulk och heterogenitet i tumör vaskularisering och lymfkärlen systemet12,13. Dessutom, tumören mikromiljö består av cancerassocierade fibroblaster som stöder tumörceller, tumör immunceller som hämmar anti-tumör immunreaktioner, och tumörendotelet som stöder transport av syre och näringsämnen, alla av som stör penetrationen, distributionen och tillgängligheten av antikroppsbaserade Therapeutics eller diagnostik. Sammantaget kan dessa överväganden begränsa terapeutisk eller diagnostisk effekt, minska behandlingssvaret, och kan resultera i tumör resistens.
Därför, för utveckling av effektiva antikroppsbaserade terapier och diagnostik, det är viktigt att bedöma biodistribution och interaktion av antikropp-baserade konjugatet inom tumören mikromiljö. För närvarande, i prekliniska studier, är markör uttryck i tumör forskningsmodeller analyseras ex vivo av immunofluorescens (om) färgning av tumör avsnitt14. Standard om färgning utförs med primära markör-specifika antikroppar som sedan markeras med sekundär överföras märkta antikroppar på ex vivo tumörvävnad skivor som har isolerats från djuret. Denna teknik belyser den statiska placeringen av markören vid tidpunkten för vävnadfixering och ger inte insikt i hur antikroppsbaserade Therapeutics eller diagnostik kan distribuera eller interagera i fysiologiska förhållanden. Molekylär avbildning av PET, SPECT, US och pa kan ge information om den antikroppskonjugerade kontrasten agent fördelningen i levande prekliniska modeller8,15. Eftersom dessa avbildningsmetoder är icke-invasiva, kan longitudinella studier utföras och tidskänsliga data kan samlas in med ett minimalt antal djur per grupp. Dessa icke-invasiva metoder för molekylär avbildning är dock inte tillräckligt känsliga och har inte tillräcklig upplösning för lokalisering av antikropps distribution på cellnivå. Dessutom kan de fysiska och biologiska egenskaperna hos den primära antikroppen ändras drastiskt genom konjugering av ett kontrastmedel16.
För att ta in vivo fysiologiska och patologiska tillstånd i beaktande av hur antikroppsbaserade Therapeutics och diagnostik samverkar i tumör miljön och för att få högupplöst cellulära och även sub-cellulära distribution profiler av icke-konjugerade antikroppar, föreslår vi en om-metod, som bedöms i vivo Immunofluorescenslokalisering (IVIL), där den antigen-specifika antikroppen injiceras intravenöst in vivo. Den antikroppsbaserade terapeutiska eller diagnostiska, fungerar som en primär antikropp, cirkulerar i funktionella blodkärl och binder till dess målprotein i mycket noggrann, levande tumör miljö. Efter isolering av in vivo-märkta tumörer med den primära antikroppen, en sekundär antikropp används för att lokalisera ackumulerade och balanserade antikroppar konjugat. Denna metod liknar en tidigare beskrivits om histologisk metod injicera Fluorescent märkt antikroppar17. Även här, användning av icke-konjugerade antikroppar undviker en potentiell förändring i biodistribution egenskaper induceras av antikropps modifiering. Dessutom undviker ex vivo applicering av fluorescerande sekundär antikropp en möjlig förlust av fluorescenssignal vid vävnads uppsamling och-bearbetning och ger amplifiering av fluorescenssignalintensitet. Vår märkningsmetod återspeglar in vivo biodistribution av antikroppsbaserade läkemedel och riktade medel och kan ge viktiga insikter för utvecklingen av nya diagnostiska och terapeutiska agenter.
Här beskriver vi två tillämpningar av IVIL-metoden som tillämpas i tidigare studier som undersöker bio distributionen och tillgängligheten av antikroppsbaserade kontrastmedel för molekylär avbildningsmetoder för bröstcancer detektion. För det första, bio distributionen av en antikropp-nära infraröd Dye konjugat (anti-B7-H3 antikropp bunden till Near Infrared fluorescens Dye, indocyaningrönt Green, B7-H3-ICG) och isotypen kontroll agent (ISO-ICG) för fluorescens och Fotoakustisk molekylär Imaging utforskas18. Det här programmets metod beskrivs i protokollet. Därefter kvantifieras bio distributions resultaten av en överensstämningsmässigt känslig antikropp till netrin-1, som vanligtvis inte är detekterbar med traditionell om avbildning, som används med ultraljud molekylär avbildning, och presenteras i representativa resultat19. Vid avslutningen av detta protokoll papper, bör läsarna känna sig bekväma att anta IVIL-metoden för sina egna antikroppsbaserade forskningsapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella administrativa panelen för laboratoriedjur omsorg (APLAC) vid Stanford University.
1. transgen musmodell av bröstcancer utveckling
- Observera möss från önskad cancer modell för lämplig tumörtillväxt via palpation eller bromsmått innan du fortsätter.
Anmärkning: här, den transgena murina modell av bröstcancer utveckling (FVB/N-TG (MMTV-PyMT) 634Mul/J) (MMTV-PyMT) användes. Dessa djur utvecklar spontant invasiva bröst karcinom mellan 6 och 12 veckors ålder i varje bröstkörteln20. Normala bröstkörtlar användes som kontroller från Transgene-negativa, åldersmatchade littermates.
2. intravenös injektion av specifika och icke-specifika antikropps agenter
- Purify kanin anti-mus B7-H3 och kanin IgG isotypen kontroll antikroppar på en avsaltning kolumn (t. ex., PD-10) för att avlägsna konserveringsmedel och lagringsbuffertar enligt tillverkarens anvisningar.
Obs: vissa antikroppar kan behöva ytterligare rening med protein-A aguppstod pärlor baserat protokoll21. - Alikvoter på 33 μg av varje antikroppkonjugat i enskilda mikrocentrifugrör.
Anmärkning: dosering av det administrerade medlet kan variera beroende på applikation och matchar de doser vid vilka antikropps konjugatet rutinmässigt används. Koncentrationen av antikropps lösningarna krävs om volymen är mer än 100 μL för djur säkerhet. - Vid önskad tidpunkt punkt innan vävnaden insamling, här 96 h, söva tumören med djur med 2% isofluran flyter i syre vid 2 L/min, och placera på en 37 ° c uppvärmd skede. Gör en tå nypa för att se till att rätt nivå av anesthsia nåddes före ingreppet.
- För att förbereda för ympning av antikropps lösningarna, desinficera svansen på djuret genom att torka tre gånger med en sprittork. Vidga svansen vener genom att värma med en värmedyna för cirka 30 s. Undvik upphettning av hela djuret. Torka av svansen en gång med en sprit torka efter avlägsnande av värmeplattan.
- Med hjälp av en 27G svans venkateter, sätt fjärilnålen i en av de två laterala svans venerna och noggrant fastställa svansen med den insatta nålen till scenen med en bit av kirurgisk tejp.
Obs: synligt blod återflöde in i katetern indikerar korrekt placering av nålen inom svans venen. - Spola katetern med 25 μL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och injicera sedan antikroppslösningen i katetern med hjälp av insulin sprutor. Spola katetern en gång till med 25 μL steril PBS.
- Ta bort nålen från svansen och tryck på för att stoppa blödning.
- Stäng av anestesi och observera djuret tills helt vaken för eventuella tecken på ångest.
3. insamling och beredning av mål tumör vävnader
- Vid önskad tidpunkt, humant euthanize djuret enligt det acceptabla institutionella förfarandet, här, genom gradvis inandning av 100% CO2 från en komprimerad bensintank med en kammare förskjutning flöde på 10-30% volym/min.
Anmärkning: vissa tillämpningar av ivil-tekniken kräver eutanasi av hjärt perfusion med PBS för att avlägsna fritt cirkulerande antikropp19,22. - Efter bekräftelse av Human eutanasi via upphörande av andnings-och hjärt rörelse, brist på tå nypa svar, och grånande av slemhinnor, punktskatter tumör vävnader med hjälp av kirurgisk sax och pinps enligt följande:
- Lägg musen i ryggläge och greppa bara det yttre lagret av huden mellan den uppsättning av bröstkörtlar närmast svansen (5: e) med pinpett, göra ett litet snitt med ett par kirurgiska sax.
- Introducera den stängda saxen i snittet och öppna långsamt spetsen för att försiktigt separera huden från det underliggande buk Väggs membranet och hålla det intakt.
- Gör en vertikal snitt upp buken, fortsätter att separera huden från det inre membranet. Mellan3 och 4th mjölkkörtlar, gör en horisontell skära över buken för att möjliggöra indragning av huden och visualisering av mjölkkörtlar.
Obs: brösttumörer och körtlar ligger ytligt under huden. - Greppa varje tumör eller normal körtel med pinpett, försiktigt trimma bort den bifogade huden med kirurgisk sax.
- Placera exciderade vävnader i vävnad disponibel bas formar, premärkt och fylld med optimal skärtemperatur (OCT) inbäddning medium och frysa forsar snabbt genom placering på torris. För att studera off-Target leverans, punktskatter andra vävnader eller organ av intresse (t. ex.levern eller lungorna).
Anmärkning: för att pausa protokollet vid denna punkt, lagra frysta vävnads block vid-80 ° c tills redo att fortsätta. - Med hjälp av en kryostat, avsnitt frysta vävnad block på 10 μm tjocklek och placera angränsande avsnitt på förmärkta vidhäftning glas diabilder.
Obs: för att pausa protokollet vid denna punkt, förvara diabilder vid-80 ° c tills redo att fortsätta.
4. ex vivo-FÄRGNINGSPROTOKOLL
Anmärkning: för kvantitativ jämförelse mellan fluorescensmikroskopi bilder, alla bilder är färgade samtidigt med samma beredda lösningar.
- Skölj frysta vävnad diabilder med rumstemperatur PBS i 5 min för att ta bort OCT.
- Avgränsa vävnads sektioner med en hydrofoba barriär penna för att minska mängden lösningar som behövs vid färgning.
Observera: var noga med att inte låta pennan köra över vävnadsproverna eftersom den antingen kan ta bort vävnaden från bilden eller förhindra korrekt färgning på den drabbade vävnads delen. Låt inte vävnads sektionerna torka på något ställe. - Fixera vävnads sektionerna med 4% paraformaldehydlösning i 5 min.
- Skölj diabilder i PBS i 5 min.
- Permeabilize vävnad sektioner med 0,5% Triton-X 100 i PBS för 15 min.
- Skölj diabilder i PBS i 5 min.
- Blockera vävnaderna med 3% w/v bovint serum albumin (BSA) och 5% v/v get serum, både i PBS (blockerande lösning) för 1 h vid rumstemperatur.
Observera: matcha det blockerande lösnings serumet med det sekundära antikropp värddjuret. - Skölj diabilder i PBS i 5 min.
- Inkubera sektioner med journalföring primära antikroppar som önskas, möjligen en gemensam nukleär (t. ex., DAPI), vaskulär (t. ex., CD31), eller cytoplasmiska markör (t. ex., Actin). Här, råtta mot-mus CD31 (vaskulär märkaren) på en 1:100 utspädning var Använd Alt efter fabrikant ' instruktionerna i den spärrningen lösande över natten på 4 ° c beskyddat från uttorkning på en glida bricka.
Obs: Lägg inte till ytterligare primär antikropp eller antikropps konjugat. Konjugaten som injicerades och tilläts ackumuleras i vävnaderna in vivo fungerar som primär antikropp. - Skölj diabilderna i PBS i 5 min tre gånger och ändra PBS varje gång.
- Inkubera diabilder med sekundära antikroppar för att märka primära antikroppar. För denna applikation, visualisera anti-B7-H3 antikropp med hjälp av AlexaFluor-546 konjugerad get anti-kanin-antikropp (1:200 utspädning, optimerad enligt tillverkarens anvisningar) och CD31 med AlexaFluor-488 get anti-råtta sekundär antikropp (1:200 utspädning, optimerad enligt tillverkarens anvisningar) i blockerande lösning, skyddad från ljus och uttorkning på en dia bilds bricka, för 1 h vid rumstemperatur.
Anmärkning: sekundära antikroppar är från samma värd djur men matchar Affiniteten hos de sekundära antikropparna mot värd arterna för respektive primär antikropp. Bilder skyddas från ljus från denna punkt och framåt. - Skölj diabilderna i PBS i 5 min tre gånger och ändra PBS varje gång.
- Applicera en droppe av monterings mediet i mitten av vävnaden slice och försiktigt placera en täckslip undvika Entrapment av luftbubblor.
- Täta kanterna på täckslip med klart nagellack och låt torka.
Obs: för att pausa protokollet i upp till en vecka vid denna punkt, förvara diabilder vid-20 ° c tills redo att fortsätta.
5. konfokalmikroskopi Imaging och kvantitativ bildanalys
Anmärkning: förberedelse av konfokalmikroskopet och avbildnings parametrarna beror på vilket konfokalsystem som används. Mikroskop som används här köptes kommersiellt (t. ex., Zeiss LSM 510 meta system) och tillhörande förvärv programvara användes (t. ex., Zen 2009). Emellertid, många av dessa steg kommer att gälla för alla konfokala Mikroskop och förutsätter grundläggande konfokal mikroskopi kunskap.
- När systemet har aktiverats och värmts upp väljer du önskat mål. här användes en 20x (numerisk bländare = 0,8) mål.
- Ladda en positiv kontroll bild, täckglas ner, för att möjliggöra inställning av optimering för den ljusaste signalen. Imaging i den röda kanalen, fokusera systemet på provet i Live Imaging-läge.
- För varje laser kanal som används optimerar du laserintensiteten, masterförstärkningen och hålstorleken enligt följande:
- Växla till kontinuerligt läge för avbildning.
- Optimera laserintensiteten (som styr lasereffekten) och Gain (Master) (som styrspänningen för Fotomultiplikator-rör) i skjutreglagen medan du övervakar histogrammet look up Table (lut). Justera dessa två inställningar tills histogrammets dynamiska intervall fylls utan att pixlarna är mättade.
Obs: om laserintensiteten är för hög kommer foto blekning att inträffa. Om förstärkningen (Master) är för hög blir bilden bullrig. I idealfallet kommer vinsten (Master) att vara mitt i intervallet. - Ställ in hål till 1 luftig enhet (AU), vilket ger den högsta upplösningen och den tunnaste z-slice.
- Skjut den digitala offset -stapeln för att minimera brus golvet på lut-histogrammet för en sann svart bakgrund.
Obs: när mikroskopi inställningar är optimerade för varje laser kanal och mål, hålla dem konstant under hela bildbehandlings-sessionen och för avbildning av alla bilder, för att möjliggöra en kvantitativ jämförelse mellan bilderna.
- Välj önskat antal och bitdjupunder medelvärdepå fliken anskaffnings läge . Klicka på den optimala knappen för att ställa in optimal pixelstorlek.
- Använd knappen Snap Acquisition för att samla in en bild av hög kvalitet. Här, slumpmässiga fält av syn valdes inifrån tumören, men andra områden av intresse kan ansöka om olika tillämpningar (fartyg, tumör marginaler, penetration djup, etc.)
- Spara bildfiler i det format som används av konfokalmikroskopi-programvaran (här, ". lsm") för offlinebearbetning och kvantifiering.
Obs: om inte alla bilder är avbildade under samma session, spara inställningarna och ladda dem på efterföljande besök, men reimaging samma bild rekommenderas inte på grund av photoblekning. - Utföra mätningar av kvantitativ fluorescensintensitet. Open Fiji (Fiji är bara imagej programvara)19,23 och ladda en. lsm bildfil genom att dra till statusfältet.
- Dela upp färgkanal data. Gå till bild ≫ staplar ≫ delade kanaler.
- Förbearbeta fluorescensbilderna efter behov, d.v.s. subtrahera bakgrunds signalen (Process ≫ subtrahera bakgrund) eller minska bullret via en filtreringsmetod.
- Segmentera den färgkanal som motsvarar referensproteinet (vaskulär, nukleär, cellulär fläck) genom att ställa in ett tröskelvärde för signalintensiteten (bild ≫ justera ≫ tröskel).
Obs: manuell tröskelvärde introducerar subjektivitet i bildanalys, därför med hjälp av en automatiserad tröskelvärde algoritm eller refererande bild histogram gör bildanalys resultat mindre partisk. - Använd det här tröskelvärdet för att skapa en binär mask (Process ≫ binär ≫ konvertera till mask).
- Mät och märk ROIs i masken (analysera ≫ analysera partiklar ≫ kontrollera Lägg till i Manager > OK).
- Tillämpa ROIs på den färgkanal som motsvarar den antikropp som intresserar dig (klicka på kanalbild, analysera ≫ verktyg > ROI Manager ≫ åtgärd). Detta kommer att tillämpa mask ROIs på antikropps bilden och ge bild mätningar för etikett avsnitt i resultatfönstret. Spara resultat (fil ≫ Spara).
- Beräkna önskad statistik av intresse, såsom den genomsnittliga fluorescensintensiteten som beskrivs här24.
- Utför alla bearbetningssteg identiskt med varje bild i en uppsättning bilder. Skapa ett makro för att automatiskt göra detta för stora bild partier23.
- För bildvisning endast efter kvantitativa mätningar, tillämpa kvalitativa bildjusteringar för att optimera visualisering av bio fördelningsmönster genom att justera minsta, högsta, ljusstyrka och kontrast till samma nivåer på alla bilder (bild ≫ justera > Ljusstyrka/kontrast).
- Konvertera bildtyp (bild ≫ typ > RGB-färg) och spara filer i en förlustfri bildtyp som. TIFF (fil > Spara som > TIFF...) för användning i presentationer och publikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den IVIL metoden användes här för att undersöka in vivo biodistribution och vävnad interaktion av B7-H3-ICG och ISO-ICG, genom att låta agenterna, efter intravenös injektion i ett levande djur, att interagera med målvävnaden för 96 h, och sedan när vävnaderna är som primär antikroppar under ex vivo immunofärgning. Den IVIL metoden jämfördes också med standard ex vivo om färgning av vävnader för B7-H3 markör. Normala murina bröstkörtlar inte uttrycker B7-H3 markör, bekräftas i ex vivo, standard om färgning, och inte ackumuleras antikroppar genom andra passiva mekanismer, och därför ingen ackumulering av B7-H3-ICG eller ISO-ICG upptäcktes, representativa negativt resultat (figur 1, översta raden). Men, murina brösttumörer gör Express B7-H3 både i kärl och epitel (som bekräftas av standard om färgning), och IVIL kunde belysa B7-H3-ICG agent som hade samlats starkt på kärl och kunde delvis extravasate från vaskulaturen att binda till cancercellerna själva men i ett heterogena sätt jämfört med den enhetliga fördelningen av B7-H3 markören i hela tumörerna, också visas i figur 1, nedersta raden. Dessutom, även om ISO-ICG-agenten inte har någon molekylär specificitet, det var fortfarande visat sig ackumuleras i ett ospecifikt sätt, på grund av FC interaktioner, dålig interstitiell dränering, och den förbättrade permeabilitet och retention effekt inom murina bröst tumörer (figur 1). Denna skillnad framhävs i de bio fördelningsmönster som visas mellan de två agenterna och förstärker ytterligare de specifika bindnings resultaten för det specifika antikropps medlet och representerar två möjliga utfall av ett positivt resultat.
De B7-H3-ICG representativa resultaten visar hur IVIL-metoden kan användas som en kvalitativ metod för att beskriva allmän antikropps-/antikroppskontrotaturbiodistribution. Ibland kan dock en mer kvantitativ tolkning behövas, eller så kan en antikropp ha mycket känslig, kon Formations bestämd bindningsförmåga. I dessa situationer kan IVIL också ge önskad information. I ett understödjaexempel, som uttryckt av netrin-1 protein i tumor vävnader och dess Co-localization med med CD31-realitet tumörendotelet var att undersökas, IVIL-tekniken var också lyckat applicerade19.
Netrin-1 är en utsöndras 65 kDa protein som är över-uttryckt i vissa typer av cancer såsom metastaserande bröstcancer25,26. För att utveckla en molekylär avbildning för netrin-1 måste proteinernas tillgång till proteinet bestämmas19. Dessutom, eftersom anti-netrin-1-antikroppen inte har tillräcklig affinitet för dess antigen efter vävnadfixering, ett alternativt infärgnings protokoll till klassisk immunohistokemi eller om färgning krävdes och IVIL genomfördes. Humaniserad anti-netrin-1 antikropp och en human IgG isotyp kontroll antikropp var intravenöst injiceras 24 h före hjärt perfusion och tumör insamling. Hjärt perfusion tillämpades för att minska ospecifik bakgrunds färgning i vaskulaturen och för att öka detekteringen av betydande anti-netrin-1 ackumulering av antikroppar i jämförelse med isotyp kontroll antikropp signal när mål uttrycket är begränsad. Tumör sektioner märktes ex vivo med kärlteckning som belyser anti-CD31 antikropp (råtta anti-mus CD31 antikropp (tabell över material) och fluorescerande sekundära antikroppar, Alexa 488-kopplad get anti-råtta IgG, 1:500 utspädning och Alexa fluor 594- kopplad get anti-humant IgG, 1:500 spädning) användes för att avslöja anti-netrin-1/isotype och anti-CD31 mAbs. Fluorescenssignalintensiteterna för anti-netrin-1-och isotypen-kontrollantikroppar kvantifierades för att fastställa skillnader i Färgnings Co-lokaliserade med CD31. Figur 2 visar att anti-netrin-1 antikropp specifikt samlats i epitelial tumör facket av mmtv-pymt brösttumörer (ett positivt resultat), medan det inte fanns någon signal i normala bröstkörtlar (ett negativt resultat). Antikroppen ytterligare Co-lokaliserad med endotelceller markör CD31. Jämförelse med isotypen antikropp-injicerade tumörer och normala körtlar visade att epitelial ackumulering var specifik för tumörvävnad. Det fanns signal ackumulering i endotelceller av både tumörer och normala körtlar på grund av netrin-1 bindning (tumörer) och icke-specifika FC interaktioner (tumörer och normala bröstkörtlar)11. Därför krävdes fluorescenssignalkvantifiering med hjälp av en CD31-baserad binär mask och visade att anti-netrin-1-antikroppssignalen var signifikant högre än antikropps signalen för isotypen-kontroll i tumörvävnaden, vilket tyder på att netrin-1 specifikt ackumuleras i tumörendotelet.
Figur 1 : Representativa konfokalmikrografer för jämförelsen av specifika B7-H3 antikroppar-ICG konjugat och ospecifik isotyp kontroll antikropp-ICG konjugatlokalisering i murina bröstkörtlar som innehåller normal eller carcinom vävnader. (Överst) Normala murina bröstkörtlar från ett djur intravenöst injiceras med 33 μg ISO-ICG eller B7-H3-ICG (röd) och motbetsad med CD31 (grön) visar ingen färgning av antikroppen konjugat. Normala vävnader visades ha något uttryck för B7-H3 av standard ex vivo om färgning. (Nederst) Invasiva brösttumörer från ett djur intravenöst injiceras med 33 μg B7-H3-ICG eller ISO-ICG (röd) och vaskulär Counter-Stained CD31 (grön) visar omfattande, heterogena färgning, men med olika distributionsmönster, för både B7-H3-ICG och ISO-ICG-agenter. B7-H3-ICG binder starkt till kärlsystemet, den första kontaktpunkten in vivo, och sedan kan extravasate från kärlsystemet till heterogen fläcken tumören epitel. ISO-ICG visar icke-specifik ackumulering inom tumör vävnader. Standard ex vivo om färgning visar enhetliga uttryck för B7-H3 markör på epitelial och endotelceller. Gul färg indikerar Co-lokaliserad röd och grön kanal signal. Skalstapeln är 100 μm och jämn mellan panelerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : In vivo Immuno-lokalisering av netrin-1 i MMTV-PyMT brösttumörer. (Vänster) Representativa konfokalmikrografer av IVIL-metoden för att detektera netrin-1-uttryck (röd) eller isotypen-kontrolluttryck (röd) i murina carcinoma och normala bröstkörtlar. IVIL bekräftar epitelial signal för netrin-1 i MMTV-PyMT tumörer men inte i normala bröstkörtlar, och stark netrin-1 signal på endotelceller (CD31 färgning, grön) i brösttumörer och signifikant svagare signal av netrin-1 i normala bröstkörtlar. Gul färg indikerar Co-lokaliserad röd och grön kanal signal. Skalstaplar indikerar 20 μm. För detektion av netrin-1-protein i tumörendotelet injicerades 100 μg primär humaniserad NET1-H-mAb eller 100 μg humant IgG-isotyp-antikropp intravenöst 24 timmar före tumör uppsamling. Fritt cirkulerande antikropp avlägsnades genom hjärt perfusion med PBS och tumör vävnad isolerades, blixt frysta, och sektioneras vid 15 μm tjocklek på en kryostat. Endotelceller var märkta med primär råtta anti-Mouse CD31 antikropp följt av sekundära Alexa 488-kopplade get anti-råtta IgG. För att avslöja den primära antikroppen inriktning netrin-1, sekundärt Alexa fluor 594-kopplad get anti-humant IgG användes. För att undvika ospecifik interaktion mellan getens sekundära antikroppar, var vävnadsprover blockerade med Get serum. (Höger) Stapeldiagram som belyser kvantifiering av anti-netrin-1-eller isotypen-kontrollantikroppssignal som colocalizes med anti-CD31-antikroppssignal. N = 13 tumörer (av två möss) per grupp av MMTV-PyMT och N = 7 bröstkörtlar (av en mus) per grupp av normala körtlar; Felstaplar nuvarande SEM; Två grupp jämförelser utfördes med Students t-test. Figur omtryckt med tillstånd från 19 under Creative Commons License CC av 4,0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här metoden har flera kritiska steg och kräver potentiella ändringar för att säkerställa en lyckad implementering. För det första måste doseringen och tidpunkten för den intravenösa injektionen av antikroppar/antikroppar anpassas till den specifika appliceringen. Generellt, doser bör användas som är förenliga med hur antikropps konjugaten normalt kommer att användas, dvs, matchande doser av den terapeutiska antikroppen eller antikroppsbaserade kontrastmedel. Också, tidpunkten för insamlingen av målvävnaderna bör noga övervägas. Antikroppar och antikroppkonjugat har längre cirkulations tider än vanliga läkemedel och kontrastmedel, men dessa är mycket varierande och bör optimeras för önskad applikation, men det rekommenderas att tillåta minst 24 h cirkulationstid27 . För det andra, under målvävnad insamling, kan det krävas för att genomföra en intrakardiell perfusion teknik för att avlägsna fritt cirkulerande antikropp från blodet poolen19. Medan man tittar på tumör fördelning av B7-H3-ICG, det konstaterades onödigt på grund av tillräckligt långa cirkulations tider (96 h) och extravaskulär lokalisering av agenten. För netrin-1-tillämpningen av IVIL-metoden ansågs dock hjärt perfusion vara relevant på grund av det endoteliala uttrycket för netrin-1 och dess relativt låga uttrycksnivå. Tredje, under ex vivo vävnad färgning är det absolut nödvändigt att färga alla bilder som kommer att jämföras kvantitativt under samma session och med samma lösningar för att förhindra normala Inter-batch variationer. Se till att bilderna sköljs ordentligt mellan stegen och att den hydrofoba pennan lösningen inte kommer i kontakt med vävnaden för att undvika suboptimala färgning. Slutligen, under konfokalmikroskopi, bibehålla samma bildinställningar mellan bilderna för att möjliggöra relativ kvantifiering och arbeta snabbt för att förhindra photoblekning av bilderna. Dessa viktiga punkter kommer att öka sannolikheten för en lyckad IVIL genomförande.
Det finns flera fördelar med IVIL-metoden. För det första, medan metoden liknar standarden om tekniker, de två ger betydligt olika information. OM färgning indikerar den anatomiska placeringen av molekylära markörer inom vävnaden vid en given tidpunkt (när vävnaden samlades in och fixerades). Dock ger IVIL information om hur en antikropp eller antikropp konjugaten, vilket framgår av lokalisering av B7-H3-ICG, distribuerar och interagerar, oavsett om det är specifik eller icke-specifik ackumulering, internalisering, eller retention i målet Vävnad. Detta är avgörande för farmakokinetiska/dynamiska och bio distributionsstudier. För det andra, traditionella om metoder är ibland begränsas av fixering av vävnader som kan orsaka antigen förvrängning eller maskering förhindra bindning av den primära antikroppen28. Därför kan IVIL vara användbart när standard om färgning eller immunohistokemi misslyckas. IVIL-tekniken kan betraktas som en kompletterande metod för att verifiera in vivo-antikroppaktivitet som annars skulle vara omöjlig att upptäcka. Slutligen, de som är bekanta med traditionella om färgning tekniker kommer att hitta metoden enkel i utförandet och kommer att ha de flesta av de nödvändiga materialen till hands.
IVIL-metoden har några begränsningar. Först, på grund av nödvändigheten att euthanize djuret att skörda målvävnaderna, ger IVIL endast biologisk interaktion information vid en enda tidpunkt. Injektion av den primära antikroppen eller antikropp konjugaten vid varierande tidpunkter i olika djur kommer att möjliggöra en bredare tidsfönster av information om biodistribution och in vivo interaktion. För det andra, om användare är obekanta med in vivo djurtekniker, såsom intravenös svans ven injektion eller potentiell intrakardiell perfusion, detta kan vara en begränsning av metoden. Dessa metoder kräver kompetent personal för att prestera tillförlitligt. Emellertid, användning av en kateter under svans venen injektion säkerställer administrering av hela dosen som korrekt nål placering kan bekräftas före injektion. Dessutom, ett alternativ till svans venen injektion som kan övervägas är retro-orbital injektion, som vanligtvis har en högre framgång med mindre erfaren personal. Behovet av att färga och avbilda alla vävnads bilder i samma sats för att möjliggöra kvantitativ bedömning begränsar antalet prover och markörer som kan ingå i en enda studie. Studien kan behöva organiseras i seriell färgning på olika dagar och på angränsande vävnad skivor för att samla in önskad information. Slutligen väcker användningen av artmatchade antikroppar, det vill säga murina anti-Mouse-antikroppar i murina prekliniska modeller, en emission av icke-specifik bakgrunds färgning med sekundära antikroppar. Därför krävs användning av artavvikande primära antikroppar som presenteras i denna studie, eller Fluorescent märkta artmatchade primära antikroppar skulle behöva användas.
IVIL-tekniken är användbar för bio fördelnings analys av diagnostiska och terapeutiska antikroppar för många tillämpningar. Olika tillämpningar för intravenös antikropp eller ligand injektion och ex vivo vävnads analys har rapporterats tidigare och bekräfta intresset för att allmänt införa denna färgning förfarande. Robertson och kollegor märkta vaskulära element såsom endoteliala kapillärer och större fartyg med intravenösa injektioner av Lycopersicon esculentum kall (tomat lectin)29. Tekniken var kompatibel med histokemi och immunocytokemi och avslöjade vaskulära mönster och funktionella parenkymala egenskaper. Men användningen av fluorescerande ligander begränsades av den snabba nedbrytningen av fluorescens vid injektion30. Som framgår av IVIL-protokollet kan injektion av en primär antikropp in vivo följt av ex vivo-märkning med en sekundär fluorescerande antikropp vara en mer robust metod. En annan intressant tillämpning av denna typ av in vivo om färgning är märkning av intravaskulära lymfocyter som framgår av Anderson och kollegor31. Intravenöst injicerad antikropp användes för att märka lymfocyter lokaliserade i blodkärl, som därefter samlades in och vidarebearbetas för flödescytometri analys av immunologiska markörer. Slutligen, för att bedöma leverans och histologisk lokalisering av antikropps terapeutiska läkemedel som levererades till patienter med skivepitelcancer i huvud och hals (HNSCC) utfördes en första in-Human-studie av antikropps distribution med systemiskt med Fluorescent i nära infrarött märkt terapeutisk antikropp cetuximab-IRDye800CW32. Uppgifterna jämfördes med histologiska analyser och visade att den fluorescerande signalen minskade med avståndet från tumören som bekräftade specificitet. Men, den terapeutiska antikroppen nådde inte alla regioner av antigen uttryck, särskilt de väl differentierade tumör regioner med höga halter av epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) antigen. I det nuvarande sammanhanget med cancerforskning med fokus på utveckling av riktade terapier och immunoterapier som möter starkt motstånd och brist på effekt, skulle IVIL-metoden vara ett utmärkt verktyg för att studera fördelningen av terapeutiska antikroppar såsom PD-1/PD-L-1 eller HER233,34. Dessa resultat är oerhört värdefulla för att förstå varför riktade terapier är effektiva i vissa fall främja utvecklingen av nya metoder. Sammantaget belyser dessa exempel den potentiella betydelsen av IVIL-metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Andrew Olson (Stanford neurovetenskap Microscopy service) för diskussioner och utrustning användning. Vi tackar Dr. Juergen K. Willmann för hans mentorskap. Denna studie stöddes av NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA118681 Training Grant (KEW) och NIH K99EB023279 (KEW). Stanford neurovetenskap Microscopy tjänsten stöddes av NIH NS069375.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
- Forthal, D. N.
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al.
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B.
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
