Summary
インビボ免疫蛍光局在化(IVIL)法は、生体内腫瘍標的化とexvivo免疫染色の組み合わせを用いて、生体内の腫瘍学的目的のための抗体および抗体コンジュゲートの生体内生分解を調べるために使用することができる。メソッド。
Abstract
モノクローナル抗体(mAbs)は、がんの検出、診断、治療において重要なツールです。それらは、腫瘍形成におけるタンパク質の役割を解明するために使用され、腫瘍の検出および特徴付けを可能にする癌バイオマーカーに向けられ、免疫エフェクター細胞を活性化するためにmAbsまたは抗体薬物コンジュゲートとして癌治療に使用することができ、阻害するシグナル伝達経路、または特定の抗原を運ぶ細胞を直接殺す。新規および非常に特異的なmAbsの開発および生産の臨床的進歩にもかかわらず、診断および治療の適用は腫瘍微小環境の複雑さおよび不均一性によって損なわれる。したがって、効率的な抗体ベースの治療および診断の開発のためには、生体腫瘍微小環境との抗体ベースコンジュゲートの生体分布および相互作用を評価することが重要である。ここでは、生体内生理的および病理学的条件における抗体ベースの治療薬および診断の相互作用を研究するための新しいアプローチとして、生体内免疫蛍光局所化(IVIL)について説明する。この技術では、治療または診断抗原特異的抗体を生体内に静脈内注射し、単離腫瘍中の二次抗体を用いて局所的なex vivoを投与する。したがって、IVILは、抗体ベースの薬剤および標的剤の生体内生体分布を反映する。2つのIVILアプリケーションは、乳癌の分子イメージングのための抗体ベースの造影剤の生体分布およびアクセシビリティを評価する記載されている。このプロトコルは、将来のユーザーが独自の抗体ベースの研究アプリケーションにIVIL法を適応することを可能にします。
Introduction
モノクローナル抗体(mAb)は、B細胞によって分泌され、免疫系の主要な機能を有する免疫グロブリンスーパーファミリーの大きな糖タンパク質(約150 kDa)であり、生物学的機能を同定し阻害するか、または破壊、細菌またはウイルス病原体、および癌細胞1上の異常なタンパク質発現を認識することができる。抗体は、その特異的なエピトープからフェムトモラー濃度まで非常に高い親和性を有し、生物医学2において非常に有望なツールを作ることができる。ミルシュタインとケーラー(1984年にノーベル賞を受賞)によるハイブリドーマ技術の開発により、mAbsの生産が可能になりました3.その後、ヒトmAbsはファージディスプレイ技術またはトランスジェニックマウス株を用いて生成され、新規研究ツールおよび治療薬としての使用に革命を起こし、4,5.
がんは世界的な健康問題であり、予防、検出、治療のための新しいアプローチの必要性を生み出す主な死因6である。現在までに、mAbsは腫瘍形成における遺伝子およびそのタンパク質の役割の駆除を可能にし、癌バイオマーカーに対して指示された場合、患者の層形成のための腫瘍検出および特徴付けを可能にすることができる。がん治療では、二重特異性mAbs、抗体薬物コンジュゲート、およびより小さな抗体断片が治療薬として開発され、および治療有効性を高める標的薬物送達のために7.さらに、抗体は、蛍光誘導手術、光音響(PA)イメージング、超音波(米国)分子イメージング、臨床的に使用される陽電子放出などの分子イメージングモダリティに対する造影剤のバイオマーカーターゲティングに役立ちます。断層撮影(PET)または単一光子発光体コンピュータ断層撮影(SPECT)8.最後に、抗体は、標的治療9に対する患者の階層化および応答モニタリングを可能にするセラノスティック剤としても使用することができる。したがって、新しいmAbsは、がんの検出、診断、および治療において重要な役割を果たし始めています。
新規および非常に特異的なmAbsの開発および生産の重要な進歩にもかかわらず、診断および治療の適用は腫瘍環境の複雑さのために無効にすることができる。抗体相互作用は、エピトープの種類、すなわち、線形か立体構造10のいずれに依存する。抗原の認識に加えて、抗体は、抗原を発現する標的細胞に到達するために、血管壁、基底膜、腫瘍間質などの自然な障壁を克服する必要があります。抗体は、可変フラグメントメント抗原結合(Fab)ドメインを介してだけでなく、さらにオフサイト相互作用につながる一定結晶性断片(Fc)を介して組織と相互作用する11。標的化はまた、腫瘍血管化およびリンパ系12、13における腫瘍バルクおよび不均一性全体の腫瘍マーカーの不均一発現によっても複雑である。さらに、腫瘍微小環境は、腫瘍細胞を支えるがん関連線維芽細胞、抗腫瘍免疫反応を抑制する腫瘍免疫細胞、酸素や栄養素の輸送をサポートする腫瘍内皮で構成されています。抗体ベースの治療薬または診断の浸透、分布、および入手可能性を妨げる。全体的に、これらの考慮事項は、治療または診断の有効性を制限し、治療応答を減少させることができ、腫瘍抵抗性をもたらす可能性があります。
したがって、効率的な抗体ベースの治療および診断の開発のためには、腫瘍微小環境内における抗体ベースのコンジュゲートの生体分布および相互作用を評価することが重要である。現在、前臨床試験において、腫瘍研究モデルにおけるマーカー発現は、腫瘍セクション14の免疫蛍光(IF)染色によりexvivoを分析する。標準的なIF染色は、一次マーカー特異的抗体で行われ、その後、動物から単離された生体内腫瘍組織スライス上の二次蛍光標識抗体によって強調表示される。この技術は、組織固定時のマーカーの静的位置を強調し、抗体ベースの治療薬または診断が生理学的条件でどのように分配または相互作用するかについての洞察を提供しない。PET、SPECT、米国、およびPAによる分子イメージングは、生きている前臨床モデル8、15における抗体共役造影剤分布に関する情報を提供することができる。これらのイメージングモダリティは非侵襲的なので、縦方向の研究を行うことができ、時間に敏感なデータをグループあたり最小限の数の動物で収集することができます。しかし、これらの非侵襲的な分子イメージングアプローチは十分に敏感ではなく、細胞レベルでの抗体分布の局在化のための十分な分解能を有していない。さらに、一次抗体の物理的および生物学的特性は、造影剤16の結合によって劇的に変化してもよい。
抗体ベースの治療と診断が腫瘍環境内でどのように相互作用するかを考慮し、高分解能細胞および細胞下分布を得るために、生体内の生理的および病理学的状態を考慮するために非共役抗体のプロファイルは、抗原特異的抗体が生体内に静脈内に注入される生体内免疫蛍光局在化(IVIL)とみなされるIFアプローチを提案する。抗体ベースの治療または診断は、一次抗体として作用し、機能性血管内を循環し、高精度で生きている腫瘍環境で標的タンパク質に結合する。一次抗体を用いて生体内の腫瘍を単離した後、二次抗体を用いて蓄積および保持された抗体コンジュゲートを局所化する。このアプローチは、蛍光標識抗体17を注入する前述のIF機関学アプローチに類似している。しかし、ここで、非共役抗体の使用は、抗体修飾によって誘導される生体分布特性の潜在的な変化を回避する。さらに、蛍光二次抗体のex vivoアプリケーションは、組織の収集および処理中に蛍光シグナルの損失の可能性を回避し、蛍光シグナル強度の増幅を提供する。当社のラベリングアプローチは、抗体ベースの薬剤および標的剤の生体内生分解に反映され、新規診断および治療薬の開発に重要な洞察を提供することができます。
ここでは、乳癌検出のための分子イメージングアプローチに対する抗体ベースの造影剤の生体分布とアクセシビリティを研究する前の研究で適用されたIVIL法の2つの応用例について述べた。まず、抗体近赤外色素コンジュゲート(近赤外蛍光色素に結合した抗B7-H3抗体、indocyanine green、B7-H3-ICG)および蛍光および光音響分子に対するアイソタイプ制御剤(Iso-ICG)の生体分布イメージングは18を探索される。このアプリケーションのメソッドは、プロトコルで説明されています。次に、netrin-1に対する立体構造に敏感な抗体の生体分布結果は、典型的には従来のIFイメージングでは検出できない、超音波分子イメージングと共に使用され、代表的な結果19に定量され、提示される。このプロトコルペーパーの結論では、読者は、独自の抗体ベースの研究アプリケーションにIVIL法を採用して快適に感じるべきです。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、スタンフォード大学の実験室動物ケア(APLAC)に関する機関行政委員会によって承認されています。
乳癌発症のトランスジェニックマウスモデル
- 先に進む前に触診またはキャリパー測定を介して適切な腫瘍増殖のための所望の癌モデルからマウスを観察する。
注:ここでは、乳癌発症のトランスジェニックマウスモデル(FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J)(MMTV-PyMT)を用いた。これらの動物は、各乳腺20の生後6~12週の間に自発的に浸潤性乳癌を発症する。正常な乳腺は、トランスジーン陰性、年齢に一致したリターメイトからのコントロールとして使用された。
2. 特異的および非特異的抗体剤の静脈内注射
- 脱塩カラム(例えば、PD-10)上のウサギの抗マウスB7-H3およびウサギIgGアイソタイプコントロール抗体を精製し、製造元の指示に従って防腐剤および貯蔵バッファーを除去する。
注:一部の抗体は、タンパク質Aアガロースビーズベースのプロトコル21でさらなる精製を必要とする場合があります。 - 個々のマイクロ遠心管における各抗体共重ゲートの33μgのアリコト用量。
注:投与剤の投与量は、用途に応じて変化し、抗体コンジュゲートが日常的に使用される用量と一致する。体積が動物の安全性のために100 μLを超える場合は、抗体溶液の濃度が必要です。 - 組織採取前の所望の時点で、ここで96時間、2%のイソファルランで腫瘍ベアリング動物を麻酔し、2L/minで酸素中に流れるイソムランを、37°C加熱ステージ上に置く。手順の前に麻酔の適切なレベルに達していることを確認するためにつま先のピンチを行います。
- 抗体溶液の尾静脈接種に備え、アルコール拭きで3回拭き取って動物の尾を消毒する。約30sのヒートパッドで加熱することにより、尾静脈を拡張し、動物全体を加熱しないようにします。ヒートパッドを取り外した後、アルコール拭きでもう一度尾を拭きます。
- 27G尾静脈カテーテルを使用して、2つの横尾静脈のいずれかに蝶の針を挿入し、慎重に外科テープの一部でステージに挿入された針で尾を固定します。
注:カテーテルへの目に見える血流は尾静脈内の針の適切な位置を示す。 - 無菌リン酸緩衝生理食生(PBS)の25μLでカテーテルをフラッシュし、インスリン注射器を使用してカテーテルに抗体溶液を注入する。無菌PBSの25 μLでカテーテルをもう一度洗い流します。
- 尾から針を取り出し、出血を止めるために圧力をかけます。
- 麻酔をオフにし、苦痛の兆候のために完全に目を覚ますまで動物を観察します。
3. 標的腫瘍組織の採取と調製
- 所望の時点で、許容される制度的手順に従って動物を人道的に安楽死させ、ここでは、室内変位流量10〜30%の圧縮ガスタンクから100%CO2を徐々に吸入することによって、体積/分の室変位流量を有する。
注:IVIL技術の一部のアプリケーションは、自由に循環する抗体19、22を除去するためにPBSとの心臓灌流による安楽死を必要とする。 - 呼吸および心臓運動の停止、つま先のつまみ応答の欠如、粘膜の灰色化を通じて人道的安楽死を確認した後、外科用はさみと鉗子を用いて腫瘍組織を切除する。
- マウスを上皮の位置に置き、尾に最も近い乳腺のセット(5番目)の間の皮膚の外側の層だけを鉗子でつかみ、外科はさみで小さな切開を行う。
- カットに閉じたはさみを導入し、ゆっくりと先端を開き、皮膚を下層の腹壁膜から慎重に分離し、そのままにします。
- 腹部を上に垂直切開し、皮膚を内膜から分離し続ける。第3および第4の乳腺の間で、皮膚の引き込みと乳腺の視覚化を可能にするために腹部を横切って水平方向のカットを行う。
注:乳腺腫瘍および腺は皮膚の下に表面的に位置する。 - 鉗子で各腫瘍または正常腺をつかむ, 慎重に外科はさみを使用して付属の皮膚をトリミング.
- 切除された組織を組織の使い捨てベース金型に入れ、あらかじめ標識し、最適な切断温度(OCT)埋め込み媒体で充填し、ドライアイス上に配置することにより、金型を迅速に凍結します。オフターゲット分娩を研究するために、他の組織または目的の器官(例えば、肝臓または肺)を切除する。
注:この時点でプロトコルを一時停止するには、続行する準備ができるまで-80 °Cで凍結組織ブロックを保管してください。 - クライオスタットを使用して、セクション凍結組織ブロックを10 μmの厚さでブロックし、隣接するセクションをあらかじめラベル付けされた接着ガラススライドに配置します。
注: この時点でプロトコルを一時停止するには、続行する準備ができるまで-80 °C にスライドを保存します。
4. 生体染色プロトコル
注:蛍光顕微鏡画像間の定量的比較のために、すべてのスライドは、同じ準備された溶液と同時に染色されます。
- OCTを除去するために5分間室温PBSで凍結組織スライドをすすいでください。
- 疎水性バリアペンで組織切片を脱臼し、染色に必要な溶液の量を減らします。
注:ペンがスライドから組織を取り除いたり、影響を受けた組織部分に適切な染色を防ぐことができるので、ペンが組織サンプルの上を走らないように注意してください。組織のセクションが任意の時点で脱水しないようにしてください。 - 4%のパラホルムアルデヒド溶液で組織切片を5分間固定します。
- PBSで5分間スライドをすすいで下します。
- PBSで0.5%のトリトン-X 100で組織切片を15分間透過化する。
- PBSで5分間スライドをすすいで下します。
- 3%w/vウシ血清アルブミン(BSA)および5%v/vヤギ血清で組織をブロックし、両方とも室温で1時間PBS(ブロッキング溶液)で。
注:ブロッキング溶液血清を二次抗体宿主動物と一致させる。 - PBSで5分間スライドをすすいで下します。
- 所望に従って記録保持一次抗体を有する切片をインキュベートし、おそらく一般的な核(例えば、DAPI)、血管(例えば、CD31)、または細胞質マーカー(例えば、アクチン)である。ここで、1:100希釈時のラット抗マウスCD31(血管マーカー)を、スライドトレイ上の脱水から保護された4°Cで一晩ブロッキング溶液中のメーカーの指示に従って用いた。
注:追加の一次抗体または抗体コンジュゲートを追加しないでください。注入し、生体内の組織に蓄積させたコンジュゲートは、一次抗体として作用する。 - PBSで5分間3回スライドし、毎回PBSを変更します。
- 二次抗体を使用してスライドをインキュベートし、一次抗体を標識します。本アプリケーションでは、AlexaFluor-546共役ヤギ抗ウサギ抗体(1:200希釈、メーカーの指示に従って最適化)とCD31をAlexaFluor-488ヤギ抗ラット二次抗体(1:200)を用いて可視化します。希釈は、ブロッキング溶液中の製造元の指示に従って最適化され、スライドトレイ上の光および脱水から保護され、室温で1時間。
注:二次抗体は、同じ宿主動物由来であるが、それぞれの一次抗体の宿主種に対する二次抗体の親和性と一致する。スライドは、この時点以降の光から保護されます。 - PBSで5分間3回スライドし、毎回PBSを変更します。
- 取り付け媒体をティッシュスライスの中心に1滴ずつ塗布し、気泡の閉じ込めを避けてカバースリップを慎重に配置します。
- 明確なマニキュアでカバースリップの端をシールし、乾燥させます。
注: この時点でプロトコルを最大 1 週間一時停止するには、スライドを -20 °C に保存し、続行する準備が整いました。
5. 共焦点顕微鏡イメージングと定量画像解析
注:共焦点顕微鏡およびイメージングパラメータの準備は、使用する共焦点システムによって異なります。ここで使用される顕微鏡は市販品(例えば、ツァイスLSM510メタシステム)を購入し、関連する取得ソフトウェア(例えば、Zen 2009)を使用した。しかし、これらのステップの多くは、任意の共焦点顕微鏡に適用され、基本的な共焦点顕微鏡の知識を仮定します。
- システムの電源を入れ、ウォームアップした後、目的の目的を選択します。ここでは、20倍(数値絞り= 0.8)の目的を使用しました。
- 正のコントロールスライドをロードし、カバースリップダウンし、最も明るい信号の最適化を設定できるようにします。赤いチャネルでのイメージングは、ライブイメージングモードでサンプルにシステムを集中させます。
- 使用するレーザー チャネルごとに、レーザー強度、マスター ゲイン、およびピンホール サイズを次のように最適化します。
- イメージング用の連続モードに切り替えます。
- ルックアップテーブル(LUT)ヒストグラムを監視しながら、レーザー強度(レーザーパワーを制御する)とゲイン(光増量管の電圧を制御するマスター)スライドバーを最適化します。ヒストグラムのダイナミックレンジがピクセルを飽和させることなく塗りつぶされるまで、これら 2 つの設定を調整します。
注:レーザー強度が高すぎると光漂白が発生します。ゲイン(マスター)が高すぎると、画像がノイズになります。理想的には、ゲイン(マスター)はその範囲の中央になります。 - ピンホールを1つの風通しの良いユニット(AU)に設定し、最も高い解像度と最も薄いZスライスを与えます。
- デジタルオフセットバーをスライドさせて、LUT ヒストグラムのノイズフロアを最小限に抑え、真の黒い背景を表示します。
注:顕微鏡検査の設定が各レーザーチャネルと目的に合わせて最適化されたら、イメージングセッション全体とすべてのスライドのイメージングのためにそれらを一定に保ち、スライド間の定量的な比較を可能にします。
- [取得モード]タブで、[平均化]で、目的の数値とビット深度を選択します。最適なボタンをクリックして、最適なピクセルサイズを設定します。
- [スナップ取得] ボタンを使用して、高品質のイメージを収集します。ここでは、腫瘍内からランダムな視野を選択したが、他の対象領域は、異なる用途(血管、腫瘍マージン、浸透深さなど)に適用される場合があります。
- オフライン処理と定量化のために、共焦点ソフトウェア(ここでは「.lsm」)で使用される形式で画像ファイルを保存します。
注: すべてのスライドが同じセッション中にイメージ化されていない場合は、設定を保存して後続の訪問時に再読み込みしますが、同じスライドを再撮影することは、光の漂白のためにお勧めしません。 - 定量蛍光強度測定を行います。フィジー(フィジーはジャストイメージJソフトウェア)19、23を開き、ステータスバーにドラッグして.lsmイメージファイルをロードします。
- カラー チャンネル データを分割します。イメージ> スタック > スプリット チャンネルに移動します。
- 必要に応じて蛍光画像を前処理し、バックグラウンド信号(プロセス>バックグラウンドを減算)を減らすか、フィルタリング方法を使用してノイズを低減します。
- 信号強度にしきい値を設定して、参照タンパク質(血管、核、細胞染色)に対応するカラーチャネルをセグメント化します(画像> 調整> しきい値)。
注: 手動しきい値化では、画像分析に主観性がもとなるため、自動しきい値アルゴリズムまたは参照イメージヒストグラムを使用すると、画像解析結果の偏りが少なくなります。 - このしきい値を使用してバイナリ マスク (プロセス > バイナリ > マスクに変換) を作成します。
- マスク内の ROI を測定してラベル付けする(> パーティクルの分析 > [マネージャに追加] をオンにします)。
- 対象の抗体に対応するカラーチャネルにROIを適用する(チャンネル画像をクリックし、分析>ツール> ROIマネージャ> メジャー)。これにより、マスクROIを抗体画像に適用し、[結果]ウィンドウの標識セクションの画像測定を提供します。結果ウィンドウを保存します (ファイル > 保存)。
- ここで24に説明する平均蛍光強度などの目的の所望の統計量を計算する。
- 一連のスライド内の各イメージと同じ処理手順を実行します。マクロを作成して、大きなイメージ バッチ23に対してこれを自動的に行います。
- 定量的な測定後にのみ画像表示を行う場合は、すべてのスライドで最小、最大、明るさ、コントラストを同じレベルに調整して、生物分布パターンの視覚化を最適化する定性的な画像調整を適用します(画像> 調整)> 明るさ/コントラスト)
- イメージの種類 (イメージ > タイプ > RGB カラー)を変換し、プレゼンテーションやパブリケーションで使用するために、.tiff (ファイル > 保存 As > Tiff...
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Representative Results
IVIL法は、B7-H3-ICGおよびIso-ICGの生体内生体分布および組織相互作用を調べるためにここで使用され、薬剤が生体動物に静脈内注射した後、96時間の標的組織と相互作用し、その後組織が一旦収穫され、排生免疫染色中に一次抗体として作用する。IVIL法はまた、B7-H3マーカーに対する組織の標準的なex vivo IF染色と比較した。正常なマウス乳腺はB7-H3マーカーを発現せず、ex vivoで確認され、標準的なIF染色、および他の受動機構を介して抗体を蓄積せず、したがって、B7-H3-ICGまたはIso-ICGの蓄積は検出されなかった、代表的な負の結果 (図 1、一番上の行) の。しかし、マウス乳腫瘍は血管系と上皮の両方でB7-H3を発現し(標準的なIF染色で確認)、IVILは血管系に強く蓄積し、部分的に余分に増殖させたB7-H3-ICG剤を強調することができた。血管系から癌細胞自体に結合するが、腫瘍全体のB7-H3マーカーの均一な分布と比較して不均一な方法で、図1、下の行にも示す。さらに、Iso-ICG剤は分子特異性を持たないにもかかわらず、Fc相互作用、間質排水不良、およびマウス乳中内の透過性および保持効果の増強により、非特異的な方法で蓄積することが示された。腫瘍(図1)。この違いは、2つの薬剤間で示される生体分布パターンにおいて強調され、さらに特異的抗体剤の特異的結合結果を増強し、肯定的な結果の2つの可能な結果を表す。
B7-H3-ICG代表的な結果は、IVIL法を一般的な抗体/抗体コンジュゲート生体分布を記述する定性的方法として使用する方法を示す。しかし、時には、より定量的な解釈が必要な場合もあれば、抗体が高感度で立体構造特異的結合能力を持つ場合があります。このような状況では、IVIL は必要な情報を提供することもできます。第2の例では、腫瘍組織におけるネトリン-1タンパク質の発現およびCD31陽性腫瘍内皮との共局在が検討された場合、IVIL技術も19に応用することに成功した。
Netrin-1は、転移性乳癌25、26などの特定のタイプの癌において過剰発現される分泌された65kDaタンパク質である。netrin-1に対する分子イメージングアプローチを開発するためには、タンパク質の生体内利用可能性を19に決定しなければならなかった。また、抗ネトリン-1抗体は組織固定後の抗原に対して十分な親和性を持たないため、古典的な免疫組織化学またはIF染色に代わる染色プロトコルが必要となり、IVILが実施された。ヒト化された抗ネトリン-1抗体およびヒトIgGアイソタイプ対照抗体は、心臓灌流および腫瘍採取の前に24時間静脈内注射した。心臓灌流は、血管系における非特異的な背景染色を減少させ、標的発現が制限されている場合のアイソタイプ対照抗体シグナルと比較して有意な抗ネトリン-1抗体蓄積の検出を増強するために適用された。腫瘍切片は、抗CD31抗体(ラット抗マウスCD31抗体(材料表)および蛍光二次抗体、Alexa 488結合ヤギ抗ラットIgG、1:500希釈およびAlexa Fluor 594-を強調する血管系を有するex vivoを標識した。結合ヤギ抗ヒトIgG、1:500希釈)を用いて抗ネトリン-1/アイソタイプおよび抗CD31 mAbsを明らかにした。抗ネトリン-1およびアイソタイプ対照抗体の蛍光シグナル強度を定量し、CD31と共局在する染色の違いを決定した。図2は、MMTV-PyMT乳腺腫瘍の上皮腫瘍室に特異的に蓄積された抗ネトリン-1抗体(陽性結果)を示し、正常な乳腺にはシグナルがなかった(陰性の結果)。抗体は、内皮マーカーCD31とさらに共局所化する。アイソタイプ抗体注入腫瘍および正常腺との比較は、上皮蓄積が腫瘍組織に特異的であることを示した。ネトリン-1結合(腫瘍)および非特異的Fc相互作用(腫瘍および正常乳腺)による腫瘍および正常腺の両方の内皮細胞にシグナル蓄積があった11。したがって、CD31ベースのバイナリマスクを用いた蛍光シグナル定量が必要であり、抗ネトリン-1抗体シグナルが腫瘍組織内のアイソタイプ対照抗体シグナルよりも有意に高いことを実証した。特に腫瘍内皮に蓄積される。
図 1: 正常または癌組織を含むマウス乳腺における特異的B7-H3抗体-ICGコンジュゲートおよび非特異的アイソタイプコントロール抗体-ICGコンジュゲートの比較の代表的な共焦点顕微鏡写真。(上)Iso-ICGまたはB7-H3-ICG(赤色)の33μgを静脈内注射し、抗体コンジュゲートの染色を示さないCD31(緑色)で対染色した動物からの正常なマウス乳腺。正常組織は、標準的なex vivo IF染色によるB7-H3の発現を持たないことが示された。(下)B7-H3-ICGまたはIso-ICG(赤色)および血管対染色CD31(緑色)の33μgを静脈内注射した動物からの浸潤性乳腫瘍は、B7-H3-ICGとB7-H3-ICGの両方に対して、広範で異種染色された染色を示す。Iso-ICG エージェント。B7-H3-ICGは、生体内の最初の接触点である血管系に強く結合し、その後、血管系から腫瘍上皮を不均一に染色するために贅沢することができる。Iso-ICGは、腫瘍組織内の非特異的蓄積を示す。標準ex vivo IF染色は、上皮および内皮細胞上のB7-H3マーカーの均一な発現を示す。黄色は、赤と緑のチャネル信号が共にローカライズされた信号を示します。スケールバーは100 μmで、パネル間で一貫しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: MMTV-PyMT乳腺腫瘍におけるネトリン-1の生体内免疫局在化(左)マウス癌および正常な乳腺におけるネトリン-1発現(赤)またはアイソタイプ制御発現(赤)を検出するIVIL法の代表的な共焦点顕微鏡写真。IVILは、MMTV-PyMT腫瘍ではネトリン-1の上皮シグナルを確認するが、正常な乳腺では、乳房腫瘍における内皮細胞上の強いネトリン-1シグナル(CD31染色、緑色)および正常な乳腺におけるネトリン-1の有意に弱いシグナルを確認する。黄色は、赤と緑のチャネル信号が共にローカライズされた信号を示します。スケールバーは20 μmを示します。腫瘍内皮におけるネトリン-1タンパク質の検出のために、一次ヒト化NET1-H-mAbの100 μgまたはヒトIgGアイソタイプ対照抗体の100μgを、腫瘍採取前に24時間静脈内注射した。自由に循環抗体をPBSとの心臓灌流により除去し、腫瘍組織を単離し、フラッシュ凍結し、クライオスタット上で15μmの厚さで切除した。内皮細胞を一次ラット抗マウスCD31抗体で標識し、続いてセカンダリAlexa 488結合ヤギ抗ラットIgGを用いた。netrin-1を標的とする一次抗体を明らかにするために、二次Alexa Fluor 594結合ヤギ抗ヒトIgGが用いられた。ヤギの二次抗体の非特異的相互作用を避けるために、組織サンプルはヤギ血清で遮断された。(右)抗CD31抗体シグナルと共局所化する抗ネトリン-1またはアイソタイプ対照抗体シグナルの定量を強調する棒グラフ。正常腺の群あたりのMMTV-PyMTおよびN=7乳腺(1匹のマウスの)の群あたりのN=13腫瘍(2匹のマウス);エラー バーは SEM を示します。学生のt検定では2群比較を行った。フィギュアはクリエイティブ・コモンズ・ライセンスCC BY 4.0(https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)の下で19から許可を受けて転載。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法には、いくつかの重要な手順があり、実装を成功させるために潜在的な変更が必要です。まず、抗体/抗体コンジュゲート静脈内注射の投与量およびタイミングは、特定の用途に合わせて調整されなければならない。一般に、抗体コンジュゲートが一般的に使用される方法、すなわち、治療用抗体または抗体ベースの造影剤の一致する用量と一致する用量を使用すべきである。また、標的組織の採取時期も慎重に検討する必要があります。抗体および抗体コンジュゲートは、標準的な薬剤および造影剤よりも長い循環時間を持っていますが、これらは非常に可変であり、所望の用途に最適化されるべきですが、少なくとも24時間の循環時間27を許可することをお勧めします。.第2に、標的組織採取の間に、血液プール19から自由に循環する抗体を除去する心内灌流技術を実施することが必要でありよい。B7-H3-ICGの腫瘍分布を見ていると、十分に長い循環時間(96時間)と薬剤の血管局在化のために不要であることが判明した。しかし、IVIL法のnetrin-1の適用については、心灌流は、ネトリン-1の内皮発現及びその比較的低い発現レベルのために関連すると考えられていた。第三に、生体内組織染色の際には、同じセッション中に定量的に比較されるスライドを、通常のバッチ間変動を防ぐために同じ溶液で染色することが不可欠です。ステップ間でスライドが適切にすすいで、疎水性ペン溶液が組織に接触していないことを確認し、最適でない染色を避けます。最後に、共焦点顕微鏡検査中に、スライド間で同じイメージング設定を維持し、相対的な定量を可能にし、スライドの光漂白を防ぐために迅速に作業します。これらの重要なポイントは、IVIL の実装が成功する可能性を高めるでしょう。
IVIL 法にはいくつかの利点があります。まず、この方法は標準的な IF 手法に似ていますが、この 2 つは大きく異なる情報を提供します。IF染色は、所定の時点における組織内の分子マーカーの解剖学的位置を示す(組織が収集され固定された時)。しかし、IVILは、B7-H3-ICGの局在化によって実証されているように、抗体または抗体コンジュゲートが、標的における特異的または非特異的蓄積、内部化、または保持のいずれであっても、どのように分配および相互作用しているかについての情報を提供する。組織。これは、薬物動態/動的および生物分布研究に重要です。第2に、従来のIF法は、時には、一次抗体28による抗原歪みまたはマスキング防止結合を引き起こす可能性のある組織の固定によって制限される。したがって、IVILは、標準的なIF染色または免疫組織化学が失敗した場合に有用でありうる。IVIL技術は、それ以外の場合は検出できない生体内抗体活性を検証する補完的な方法と考えることができる。最後に、従来のIF染色技術に精通している人は、実行に簡単な方法を見つけ、手元に必要な材料のほとんどを持つことになります。
IVIL メソッドにはいくつかの制限があります。第1に、標的組織を収穫するために動物を安楽死させる必要があるため、IVILは一時に生物学的相互作用情報のみを提供する。異なる動物への様々な時点での一次抗体または抗体コンジュゲートの注入は、生体分布および生体内相互作用に関するより広い時間枠の情報を可能にする。第二に、静脈内尾静脈注射や潜在的な心内灌流などの生体内動物技術に慣れていない場合、これは方法に制限されうる。これらの方法では、熟練した人材が確実に実行する必要があります。しかし、尾静脈注射時のカテーテルの使用は、注射前に適切な針の配置が確認できるように、用量全体の投与を保証する。さらに、考慮され得る尾静脈注射の1つの代替手段は、通常、経験の少ない人員でより高い成功率を有するレトロ軌道注射である。定量的な評価を可能にするために、同じバッチ内のすべての組織スライドを染色し、画像化する必要性は、単一の研究に含めることができるサンプルおよびマーカーの数を制限する。研究は、所望の情報を収集するために、異なる日と隣接する組織スライスに連続染色に整理する必要があります。最後に、種一致抗体の使用、すなわち、マウス前臨床モデルにおけるマウス抗マウス抗体は、二次抗体による非特異的背景染色の問題を提起する。したがって、本研究で提示される種不一致の一次抗体の使用が必要とされ、または蛍光標識種一致した一次抗体を使用する必要がある。
IVIL技術は、多くの用途における診断抗体および治療用抗体の生体分布解析に有用である。静脈内抗体またはリガンド注射およびex vivo組織分析のための異なる用途は、以前に報告されており、この染色手順を広く導入する目的を確認する。Robertsonたちは、リコパシコンの精液アグルチニン(トマトレクチン)29の静脈内注射を伴う内皮毛細血管およびより大きな血管などの血管要素を標識した。この技術は組織化学と免疫細胞化学と互換性があり、血管パターンと機能的な白斑的特徴を明らかにした。しかし、蛍光リガンドの使用は、注射30時の蛍光の急速な分解によって制限された。IVILプロトコルで実証されているように、生体内での一次抗体の注入、続いて二次蛍光抗体によるex vivo標識は、より堅牢なアプローチである可能性があります。このタイプの生体内IF染色のもう一つの興味深い応用は、アンダーソンと同僚31によって実証された血管内リンパ球の標識である。静脈内注射抗体を用いて血管に局在するリンパ球を標識し、その後収集し、免疫マーカーのフローサイトメトリー分析のためにさらに処理した。最後に、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)患者に送達した抗体治療薬の送達および組織学的局在化を評価するために、抗体分布の最初のヒト内研究を全身的に用いて行った。近赤外蛍光標識治療用抗体セツキシマブ-IRDye800CW32を投与する。データを組織学的分析と比較し、特異性を確認する腫瘍からの距離とともに蛍光シグナルが減少することを示した。しかし、治療用抗体は、抗原発現のすべての領域、特に表皮成長因子受容体(EGFR)抗原の高レベルを有する十分に分化した腫瘍領域に到達しなかった。強い抵抗性と有効性の欠如に遭遇する標的治療法と免疫療法の開発に焦点を当てたがん研究の現在の文脈では、IVIL法は、治療用抗体の分布を研究するための優れたツールであろう。例えば、PD-1/PD-L-1またはHER233、34.これらの結果は、新しいアプローチの開発を促進する特定のケースで標的治療が有効である理由を理解するために非常に貴重です。これらの例をまとめると、IVIL アプローチの潜在的な重要性が強調されています。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
ディスカッションと機器の使用に関して、アンドリュー・オルソン博士(スタンフォード神経科学顕微鏡サービス)に感謝します。ユルゲン・K・ウィルマン博士の指導に感謝します。本研究は、NIH R21EB022214助成金(KEW)、NIH R25CA118681研修助成(KEW)、およびNIH K99EB023279(KEW)によって支援されました。スタンフォード神経科学顕微鏡検査サービスはNIH NS069375によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
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