Summary
이 프로토콜은 유세포측정법을 사용하여 인간 1차 식세포에 의한 아스퍼질러스 훈증의 식세포증을 정량적으로 측정하고 단순한 유착에서 백혈구로의 식세포증을 구별하는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
Abstract
곰팡이 아스퍼질러스 훈증에 의한 침습성 폐 감염은 면역 손상 환자에게 큰 위협이 된다. 흡입한 곰팡이 코니디아 (포자)는 선천적 단핵구 및 / 또는 호중구에 의해 식세포가 함유되어 인간의 폐 폐포에서 제거됩니다. 이 프로토콜은 인간 백혈구와 공동 인큐베이션및 내부화 및 세포 부착 코리디아의 차별을 허용하기 위해 항 FITC 항체와 후속 카운터 염색을 위해 플루오레세인 이소티오차네이트 (FITC)를 사용하여 유세포증에 의한 식세포증의 빠르고 신뢰할 수있는 측정을 제공합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 그것의 급속성, 관심있는 다른 세포 마커의 세포 분석과 분석, 단일 샘플에서 단핵구 및 호중구의 동시 분석 및 다른 세포 벽 베어링 곰팡이 또는 박테리아에 대한 적용 가능성과 분석을 결합 할 수있는 가능성입니다. 식균 백혈구의 백분율의 결정은 병원체의 독성을 평가하거나 병원체 야생 유형 및 돌연변이를 비교하기위한 미생물학자뿐만 아니라 병원균에 대처하기 위한 인간 백혈구 능력을 조사하기위한 면역 학자에게 수단을 제공합니다.
Introduction
침습성 폐 아스퍼질로시스는 치료 옵션이 제한되어 있고 조기 진단시성공으로 면역 손상 환자에게 큰 위협이 되며, 이는 높은 사망률1을이끈다. 감염제는 대부분의 서식지에 유비쿼터스 인 곰팡이 아스퍼질러스 훈증의 코니디아 (포자)입니다2. 코니디아는 흡입되고 기도를 통과하고 마침내 폐 폐포에 들어갈 수 있습니다. 면역 적격 인간에서, 이들 코니디아는 단핵구 또는 대식세포 및 호중구 과립구와 같은 선천적 면역 세포에 의해 제거되며, 이는 병원체를 (식균) 및 소화한다3. 식세포증은 숙주 병원체 상호 작용에 관심이 있을 때 미생물학자와 면역학자에게 도 마찬가지로 중요합니다. 백혈구 및 코니디아의 공동 배양과 같은 대립 성 애세포는 종종 플루오레세인 또는 그 유도체 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)에 의한 포자의 라벨링을 포함합니다. 현미경을 사용하여, 이 접근은 번거롭고 현실적으로 세포의 수백에 제한되더라도, 내면화한 형광 콘idia를 확인하고 부착된/부착된 코니디아를 결정하는 것은 간단합니다4. 그러나, 쉽게 분 이내에 세포의 수십만의 분석을 허용 유세포 분석, 식균 및 부착 코니디아의 차동 염색은 필수적이다. 따라서 많은 프로토콜은 Trypan Blue에 의존하여 부착 코니디아5,6,7,8에서FITC 형광을 담금질합니다. 또 다른 접근법은 에티듐 브로마이드 및 FITC의 형광 공명 에너지 전달을 이발하여 부착코니디아9,10,11에서녹색 형광 대신적을 방출한다. 특정 항체가 이용 가능한 경우, 일부 박테리아의 경우와 마찬가지로, 세포 결합 입자는12,13을직접 염색할 수 있다.
여기에서, 우리는 세포에 포자의 부착및 상호 작용의 부족과 더불어 인간 백혈구에 의한 FITC 표지된 A. fumigatus conidia의 식균증을 신속하고 정량적으로 평가하는 프로토콜을 제시합니다(APC)-결합된 항체. 이 방법은 또한 동일한 샘플에서 단핵구 및 호중구에 의한 식세포증의 개별 분석을 위해 사용될 수 있는 추가 세포 마커의 동시 유동 세포 분석법을 허용한다.
프로토콜은 곰팡이 균주의 특성화 (예를 들어, 여기에 제시 된 무코랄레스 속의 아스퍼질러스 및 기타 곰팡이의 여러 종) 및 그들의 돌연변이체14 및 면역 손상 된 개인의 백혈구와 같은 식세포에 대한 면역 학적 연구에 적용 될 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜은 수혈 의학 연구소에서 얻은 인간의 버피 코트의 사용을 포함, 예나 대학 병원과 환자에서 가져온 신선한 정맥 혈액, 모두 윤리위원회 승인에 따라 기증자의 서면 동의 후 4357-03/15.
1. 아스퍼질러스 훈증코니디아의 준비
- Co2없이 37°C에서 5일간 1.5% 몰트 한천 페트리 접시에 A. 훈증을 키우고 있다.
주의: A. 훈증은 생물 안전 성 수준 2 미생물이며 생체 안전 캐비닛을 사용하여 실험실 코트, 장갑 및 필터 마스크를 착용하여 적절한 시설에서 처리해야합니다.
참고: 플레이트는 코니디아의 녹색 회색 층으로 완전히 덮여있어야합니다. 백인 문화는 스포더하지 않습니다. 맥아 한천 의 조성 : 4 % (v) 맥아 추출물, 효모 추출물 0.4 % (v), 한천 1.5 % (v), 아쿠아 데스트. - 수확 코니디아
- 바이오 세이프티 캐비닛에 소독제로 젖은 종이 타월을 놓고 휘발성 코니디아의 과잉 분배를 방지하기 위해 접시를 위에 놓습니다.
- 곰팡이 위에 인산염 완충 식염수 (PBS) + 0.01 % 세제 10 mL를 추가하고 드리갈스키 주걱을 사용하여 접시 위에 액체를 퍼뜨리고 어두운 색의 코니디아를 문지릅니다. 백색 균사체를 제거하지 않도록주의하십시오.
- 30 μm 세포 스트레이너를 사용하여 50 mL 튜브에 코니디아 현탁액을 넣고 잔류 균사체를 제거합니다.
- 1.2.2 및 1.2.3 단계를 반복하고 동일한 50 mL 튜브에서 수집합니다.
- 실온에서 2,600 x g에서 5분 간 회전합니다.
- 상급체를 제거하고 멸균 아쿠아 데스트 20 mL에서 다시 일시 중단하십시오.
- 토마 카운팅 챔버로 코니디아 농도를 결정합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지 할 수 있으며 뚜껑을 단단히 조인 상태에서 4 °C에서 최대 1 개월 동안 보관 할 수 있습니다.
- FITC 라벨링
- 멸균 0.1 MNa2CO3 (PBS에 용해)에 FITC 분말의 0.1 mM 용액을준비합니다.
주의: FITC 분말은 위험하며 장갑, 고글 및 필터 마스크로 취급해야합니다. 현지 규정에 따라 폐기물을 수거합니다.
참고: 이 동안 인공 조명과 코니디아와 관련된 다음 단계를 생략하십시오. - 15 mL 튜브에 FITC 용액 5 mL에서 1 x 108 (이하) 코니디아를 다시 일시 중단하십시오. 회전자에서 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
- 네거티브 컨트롤의 경우, 15 mL 튜브에서 0.1 M Na2CO3(FITC 제외)으로 코니디아를 다시 일시 중단합니다. 회전자에서 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
참고: 염색 할 코니디아의 양을 계산 할 때 염색, 붓기 및 필요한 모든 세척 단계에서 최대 70 %의 손실을 고려하십시오. 회전기를 사용할 수 없는 경우, 현탁액은 배양 중에 세 번 흔들어야 합니다. - 세척의 경우, 10 mL의 PBS + 0.01 % 세제를 현탁액에 넣고 실온에서 2,600 x g에서 5 분 동안 돌십시오.
- 10 mL의 PBS + 0.01% 세제로 장신구를 제거하고 두 번 반복 세탁하십시오.
- 멸균 0.1 MNa2CO3 (PBS에 용해)에 FITC 분말의 0.1 mM 용액을준비합니다.
- 코니디아의 붓기 (원하지 않는 경우 생략 될 수있다)
- 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 배지 + 10% 태아 송아지 세럼(FCS)의 5 mL에 FITC 라벨을 부착하고 원하는 시간 동안 37°C에서 로터에 인큐베이팅합니다(예: 2 h, 4시간).
참고: 회전기를 사용할 수 없는 경우, 현탁액은 배양 중에 적어도 20분마다 흔들려야 합니다. - 서스펜션에 10 mL + 0.01 % 세제를 넣고 실온에서 2,600 x g에서 5 분 동안 돌십시오.
- 상급체를 제거하고 10 mL의 PBS + 0.01 % 세제로 두 번 씻으십시오.
- 30 μm 세포 여과기를 통해 걸기 큰 코니디아 덩어리를 제거합니다.
- 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 배지 + 10% 태아 송아지 세럼(FCS)의 5 mL에 FITC 라벨을 부착하고 원하는 시간 동안 37°C에서 로터에 인큐베이팅합니다(예: 2 h, 4시간).
- 코니디아 고정 (원하지 않는 경우 생략 될 수 있습니다)
- FITC 라벨을 다시 부착하고 포름알데히드 1 mL에 부어 오른 코니디아를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 서스펜션에 10 mL + 0.01 % 세제를 넣고 실온에서 2,600 x g에서 5 분 동안 돌십시오.
- 상급체를 제거하고 10 mL의 PBS + 0.01 % 세제로 두 번 씻으십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지 될 수 있으며 코니디아는 4 °C에서 최대 1 주 동안 어두운 곳에서 PBS (알루미늄 호일에 싸여 있는 튜브)에 보관 할 수 있습니다.
2. 인간 1차 백혈구의 준비
- 50 mL 튜브에 버피 코트 5 mL를 넣습니다. 또는 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 모노베트(50 mL 튜브 당 10 mL)로 그려진 신선한 인간 말초 정맥 혈액을 사용하십시오.
주의: 인간의 혈액은 인간 면역 결핍 바이러스 및 B 형 간염 바이러스와 같은 바이러스를 전송할 수 있습니다. B형 간염 예방 접종 을 받은 후에만 실험실 코트와 장갑을 착용한 생체 안전 성 캐비닛에서 처리하십시오. - 적혈구 용해 (EL) 버퍼로 튜브를 채우고 세 번 반전하고 혼합물의 유백색 모양이 분명해질 때까지 수평으로 5-8 분 동안 배양하십시오.
참고: 때때로 혈액이 lyse에 더 오래 걸릴 수 있습니다. 모양으로 이동합니다. 같은 혈액의 두 튜브가 다른 시간을 가지고 있는 것은 드문 일이 아닙니다. EL 버퍼의 조성 : 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3,0.1 mM EDTA - 실온에서 300 x g에서 10 분 동안 돌루기. 상급제는 버리십시오.
- 파이펫팅으로 EL 버퍼 1mL에서 펠릿을 다시 놓습니다. 그런 다음 EL 버퍼의 또 다른 24 mL를 추가하고 여러 번 반전합니다.
- 실온에서 300 x g에서 5분 간 돌이내라.
- RPMI + 10% FCS의 1 mL에서 상급 및 재중단 셀을 폐기하십시오.
- Neubauer 계수 챔버로 세포 농도를 결정합니다.
3. 식세포 분석
- 12웰 세포 배양 플레이트에서 RPMI 의 1.5 mL + 10% FCS에서 2 x 106 백혈구 및 4 x 106 FITC 표지 코니디아(감염의 복합성 = 2)를 배양합니다. 컨트롤로서 셀만 포함합니다(코니디아 없음) 및 셀 + 레이블이 지정되지 않은 코니디아.
- 가습 된CO2 인큐베이터에 37 °C에 놓고 원하는 기간 동안 배양하십시오 (예를 들어, 0.5 h, 2 h 또는 4 h).
- 배양 후, 세포를 스크레이퍼로 수확하고 15 mL 튜브에 넣습니다.
- 실온에서 300 x g에서 5분 간 돌이내라.
- 사이토 카인 분석을 위해 상급을 수집하거나 원하지 않는 경우 폐기하십시오. PBS + 2 mM EDTA의 100 μL에서 각 샘플을 다시 일시 중단하십시오.
4. 항체 염색
- 표 1에따르면 각 샘플에 대해 APC 항 FITC 항체를 포함한 100 μL의 항체 혼합물을 준비합니다.
- 100 μL 샘플을 96웰 V-bottom 플레이트의 한 우물에 넣습니다. 세척을 위해 PBS + 2 mM EDTA 150 μL을 추가하십시오.
- 색상 보정을 위해 96웰 V 바닥 판의 추가 웰에 각 색상에 대해 1 x 106 셀을 배치합니다. 얼룩이 남지 않은 세포의 우물을 포함시다. 세척을 위해 PBS + 2 mM EDTA 150 μL을 추가하십시오.
- 접착제 호일로 덮는 접시.
- 실온에서 300 x g에서 5분 간 돌이내라. 호일을 제거합니다.
- 싱크대 나 일회용 종이 타월 위에 한 번만 접시를 신속하고 강제로 반전시켜 상판을 버리십시오.
참고: 접시에서 세포가 크게 손실될 때까지 용지에 접시를 반복하거나 두드리지 마십시오. - 100 μL 항체 혼합물에서 세포를 재중단하고, 파이펫팅에 의해 잘 혼합한다.
- 색 보상을 위해, PBS + 2 mM EDTA의 100 μL에서 각각의 세포를 재중단하고 항체 혼합에 사용되는 동일한 양으로 각각의 웰에 단일 항체를 추가한다.
- 접착제 호일로 덮고 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 호일을 제거합니다. 세척을 위해 각각 의 150 μL + 2 mM EDTA를 각각 추가하십시오. 접착제 호일로 덮습니다.
- 실온에서 300 x g에서 5분 간 돌이내라. 호일을 제거합니다. 싱크대 나 일회용 종이 타월 위에 접시를 신속하고 강제로 반전시켜 상판을 버리십시오.
- PBS + 2 mM EDTA의 200 μL에서 재중단하고 각각의 우물에서 별도의 둥근 바닥 튜브로 세포를 옮김. 서스펜션에 셀 클러스터가 없는지 확인합니다. 그렇지 않으면 클러스터를 제거합니다.
참고: 눈이 볼 수있을만큼 큰 모든 클러스터는 잠재적으로 세포계를 막을 수있을만큼 큽입니다.
5. 유세포분석
- 유량 세포계를 시작하고 따뜻하게하십시오. 수집 소프트웨어를 시작합니다.
- 새 실험을 만들고 설정하고 샘플에 레이블을 지정합니다.
- 플루오로포피, APC, BUV395, V500, PerCP-Cy5.5에 대한 파라미터(FSC 250, SSC 250) 및 검출기를 설정합니다.
- 보상 설정
- 오픈 보상 설정.
- 개별 색상을 나타냅니다.
- 얼룩이 남지 않았거나 개별 얼룩이 남은 제어 셀을 사용하여 PMT 검출기 전압을 스케일 내의 모든 이벤트를 포함하도록 설정합니다.
- 각 컨트롤의 최소 10,000개의 이벤트를 기록합니다.
- 보정 설정을 사용하여 형광류 의 유출을 계산하고 실험의 세포계 설정에 적용합니다.
- 샘플 데이터 기록
- 수집 소프트웨어에 FSC 및 SSC를 표시하고 백혈구 주위에 게이트를 설정합니다.
- 백혈구 게이트를 기반으로, 표시 도트 플롯 SSC / CD45 및 CD45+ 셀에 대한 게이트는 코니디아에서 분리합니다.
- 도트 플롯 CD14/CD66b 및 게이트 단핵구(CD14+) 및 호중구(CD66b+)에 CD45+ 셀을 별도로 표시합니다.
- 도트 플롯 안티 FITC /FITC에 호중구를 표시합니다.
- 라벨이 지정되지 않은 코니디아샘플을 사용하여 안티 FITC 및 FITC 신호에 대한 사분면을 설정하여 각 사분면에서 최대 1%의 셀을 허용합니다.
- 단핵구 게이트의 경우 5.5.4 단계와 5.5.5단계를 반복합니다.
- 백혈구 게이트에서 최소 20,000개의 이벤트가 있는 모든 샘플을 기록합니다.
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Representative Results
인간의 식세포에 의한 A. fumigatus conidia의 식균을 측정할 때, 순정 내재화와 세포에 코니디아를 부착하는 것 사이의 차별은 특히 유세포 분석과 같은 처리량이 높은 방법에 관한 장애물입니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 세포와 코니디아의 공동 인큐베이션 전에 형광 염료 FITC와 코니디아의 염색에 기초하여 빠르고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제시하고, 배양 후 APC 표지 된 ANTI-FITC 항체로 카운터스테인링(그림 1A). 도 1B에도시된 바와 같이, FITC 표지된 코니디아는 세포에 녹색 신호를 제공하는 인간 단핵구 및 호중구에 의해 식세포가 공급된다. 이 코니디아는 반대로 FITC 항체를 위해 접근할 수 없고, 그러므로, 항체를 묶을 수 없고 세포는 APC 음성 (FITC+, APC-)를 나타납니다. 비상호작용세포는 FITC 표지된 코니디아로부터 녹색 신호를 획득하지 않으며 FITC-, APC-를 유지한다. 몇 가지 셀이 FITC-, APC+로 나타납니다. 반대로 FITC APC 항체는 FITC 표지된 코니디아 없이 세포를 묶을 수 없어야 하기 때문에, 이 사건은 염색 유물로 간주됩니다. 세포에 부착되지만 내면화되지 않은 FITC 표지 코니디아는 FITC에 대해서도 긍정적이지만 FITC 및 APC(FITC+, APC+)에 대해 이러한 세포를 이중으로 양성으로 만드는 ANTI-FITC 항체에 대한 표적을 제공합니다. 현미경으로 분석할 때, 이 인구는 우리의 실험에서만 연결된 conidia를 가진 세포의 20%까지 포함했습니다.
본 프로토콜에 기재된 항체를 이용하여 도 1D에서게이팅 전략을 따르고, FSC 및 SSC 특성에 의한 인간 백혈구의 일반적인 게이팅은 범백혈구 마커 CD45에 의한 백혈구 및 자유 코니디아의 분리에 이어된다. 특히 부어 코니디아 및 / 또는 긴 인큐베이션 시간을 사용하는 경우, 코니디아는 유세포 분석 및 따라서 바이어스 분석의 시간에 거의 세포 크기에 도달 할 수 있습니다. 인간 1차 단핵구와 호중구가 코니디아를 다르게 차지하기 때문에, 이 프로토콜은 호중구를 위한 단핵구 및 CD66b를 위한 잘 확립된 세포 계보 마커 CD14를 가진 염색에 근거를 둔 이 세포 집단을 개별적으로 분석하는 것을 허용합니다. 식균 및 부착 세포 집단에 대한 게이팅은 FITC 나 안티 FITC APC 신호를 전달하지 않는 라벨이 지정되지 않은 코니디아를 가진 제어 샘플을 기반으로 수행됩니다. APC와 FITC가 서로 플롯되면 사분면은 관심 게이트에서 최대 1%의 셀이 허용되는 방식으로 설정됩니다.
코니디아를 내면화하는 인간 1 차 적인 식세포의 백분율은 혈액 기증자 중 높게 가변적일 수 있습니다 그러나 또한 conidia의 인큐베이션 시간 및 팽윤 상태와 같은 실험적인 요인에 달려 있습니다. 포자 내재화는 이미 0.5 시간 의 공동 배양 후 검출 될 수 있으며 시간이 지남에 따라 증가합니다(도 2A). 미리 부어 있는 코니디아는 짧은 배양 시간에도 포자를 쉬기(부어 오르지 않음)보다 쉽게 차지합니다(그림2B). 코니디아가 포름알데히드로 고정되면 식세포증은 네이티브 코니디아에 비해 감소됩니다(그림 2C).
| 시약 | 샘플당 μl |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0.5 |
| CD66b 퍼CP-Cy5.5 | 1.5 |
| 안티 FITC APC | 0.5 |
| PBS + 2 mM EDTA | 97 |
| 총 | 100 |
표 1: 유세포 측정을 위한 항체 혼합. 각 시약의 양은 분석할 샘플당 마이크로리터(1 x 106 세포)로 주어집니다.
도 1: 유세포식세포증 분석의 설정 및 분석. (a)코니디아 및 세포 제제 및 역염색을 포함하는 프로토콜의 구성표. (B)식세포증은 FITC 표지코니디아의 유동 세포측정 데이터를 안티 FITC APC 카운터스테인핑에 대해 플로팅하여 분석한다. 생성된 인구는 상호 작용하는 백혈구(FITC-, APC-), 부착코니디아(FITC+, APC+)를 가진 백혈구(FITC+, APC+) 및 식육세포(FITC+, APC-)의 백분율과 염색 아티팩트(FITC-, APC+)를 나타냅니다. (C)3개의 다른 기증자를 가진 3개의 다른 실험에서 이중 양성 세포 집단 (그 중 2개는 중복에서 수행되고, 1개는 단 하나 수행)는 현미경으로 내부화되고 코니디아만 부착하였다. (D)백혈구(CD45)를 검출하고, 단핵구(CD14) 및 호중구(CD66b)를 식별하고 상호 작용 집단(FITC, anti-FITC)을 결정하는 유세포측정 데이터의 대표적인 게이팅 전략. 이 수치는 Hartung et al., 세포분석 A, 95: 3, p. 332-338 (2019)14에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 인간의 1 차 식세포에 의한 코니디아의 식세포증은 여러 가지 조건에 따라 다릅니다. (a)휴식 코니디아를 내재화하는 세포의 비율은 공동 배양 시간으로 증가하였다. (B)식육증은 0.5 h.(C)네이티브 코니디아를 공동 배양할 때 음혈성 팽윤 시간으로 증가하였고, 고정식 코니디아보다 식세포가 더 잘 되었다. 데이터는 10개의 다른기증자(A, B)또는 5개의 상이한 기증자(C)로부터 10(A,B)또는 5(C) 독립적인 실험으로부터 수득하였다. 오류 막대는 SD를 나타냅니다. 이 수치는 Hartung et al., 세포분석 A, 95: 3, p. 332-338 (2019)14에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 식세포증의 분석은 인간의 1차 식세포의 기능을 평가하고 임상적으로 관련된 금형을 특성화하는 수단입니다. (a)건강한 공여자 및 면역억제 환자로부터의 단핵구의 예시적인 비교(조혈줄기 세포 이식 후) 식균을 0.5 시간, 2 시간 및 4 시간 동안 식균 을 포식하는 코니디아(B)휴식 곰팡이 의 식균은 2 종 후 아스퍼질러스 및 뮤코랄레스에서 임상적으로 관련있는 것으로 결정되었다. 데이터는5(아스퍼질러스)또는3(Mucorales)상이한 공여자로부터 각각 5 또는 3개의 독립적인 실험으로부터 수득되었다. 오류 막대는 SD. 약어를 나타냅니다: A. 아스퍼질러스,L. 리치테이미아,M. Mucor,R. Rhizopus이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 일반적인 현미경 프로토콜에서 불가능한 많은 수의 1차 인간 백혈구와 A. fumigatus conidia의 상호작용을 측정하는 빠른 유동 세포 측정 방법을 제시한다. 현미경을 가진 화상 진찰 세포및 수동내재된 conidia를 계수하는 것은 번거롭고 현실적으로 수백 개의 세포에 대해서만 행해질 수 있습니다. 유세포측정은 몇 분 안에 수천 개의 세포를 측정하여 이 문제를 극복합니다. 두 접근에 일반적인 장애물은 세포에 있는 식균 및 부착한 conidia의 구별, 각각입니다. 현미경 검사법에서 염료 calcofluor 흰색은 종종 부착 코니디아 염색에 사용되지만 그 사용은 키틴 함유 세포벽을 가진 미생물로 제한됩니다.
대조적으로 이 프로토콜은 리니지 마커 CD45, CD14 및 CD66b와 같은 추가 세포 마커를 추가로 추가할 수 있는 상호작용 이벤트의 특성화를 위해 뚜렷한 형광단을 사용하였다. 따라서 단일 샘플에서 단핵구 및 호중구에 의한 병원균의 식균을 구별할 수도 있습니다. 세포 식별을 위한 마커 및 형광단의 선택은 실험의 필요와 사용 가능한 세포계의 용량에 적응될 수 있는 반면, 이 프로토콜에 언급된 특정 APC 항 FITC 항체의 사용은 우리의 손에 가장 신뢰할 수있는 항체.
포름알데히드 고정 된 코니디아는 동등하게 잘 내면화되지 않기 때문에, 네이티브 포자는 식세포 분석에 권장됩니다. 그러나, 네이티브 코니디아 시작 하거나 인간의 백혈구와 공동 인큐베이션 하는 동안 붓기를 계속 하 고 결국 발아. 전형적으로, A. 훈증코니디아는 37°C에서 포도당 함유 매체에서 약 8-9시간 후에 발아한다. 발아로 는 코니디아 표면에 FITC의 손실을 야기로 팽창 시간과 식세포와 공동 배양 시간의 조합은이 시간 프레임을 초과하지 않아야합니다. 더 중요한 것은, 세균은 단핵구 또는 호중구에 의해 더 이상 식세포가 될 수 없습니다. 대신, 이 식세포는 주위에 축적하고 제거되지 않는 경우에, 세포계를 막는 세포 클러스터를 생성하는 세균에 붙어 있습니다. 유사하게, 4 h 부은 conidia는 그들 자신 중 세포와 가진 클러스터를 생성하는 경향이 있습니다. 종종 이러한 클러스터는 더 이상 기계적으로 분리될 수 없으며 유동 세포 분석분석을 위해 내의 세포가 손실됩니다.
게이팅은 처음에는 간단하고 쉽지만, 세포에 의해 더 많은 코니디아가 내면화되고, 흐릿한 게이팅이 될 수 있습니다. MOIs > 2를 사용하면 초기 시점에서 식세포증이 증가하지만 게이팅 문제도 일찍 발생할 수 있습니다. 따라서 MOIs는 관심있는 특정 세포 및 병원체로 신중하게 결정되어야합니다.
이 프로토콜의 한계는 부착 된 코니디아 (FITC + APC +)를 가진 세포 집단의 이중성에 있으며, 이는 또한 부착체뿐만 아니라 내부화 된 코니디아와 세포를 품고있을 수 있습니다. 추가 차별에 대한 가능성은 유세포계에서 측정된 모든 세포의 시각적 이미징을 허용하는 이미징 유동 세포측정법15의 적용이다.
음막 세포벽의 비특이적 FITC 라벨링으로 인해, 이 방법은 무코랄스 속 또는 효모 칸디다 알비칸스의임상적으로 관련된 곰팡이와 같은 다른 곰팡이로 쉽게 전달될 수 있다. 또한, 또한 세포 벽 베어링 박테리아는 FITC 표지 될 수 있습니다. 항 FITC 항체를 가진 보편적인 카운터스테인링은 많은 수의 인간 백혈구에 의해 이 모든 병원체의 식균의 빠르고 쉬운 측정을 허용합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 훌륭한 기술 지원을 위해 부인 피아 Stier에 감사드립니다. M. 폰 Lilienfeld-Toal은 패혈증 제어 및 관리 센터 (독일 연방 교육 보건부, BMBF, FKZ 01E01002) 및 감염성 Gnostics tics 연구 캠퍼스 (BMBF, FKZ 13GW0096D)에 의해 지원됩니다. 티 응옥 마이 호앙은 미생물 통신의 예나 학교에 의해 지원됩니다 (도이치 포르충스게마인샤프트, FKZ 214/2)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
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