Summary
Denne protokollen gir en rask og pålitelig metode for å kvantitativt måle fagocytose av Aspergillus fumigatus conidia av menneskelig primære phagocytes bruker flyt flowcytometri og å diskriminere fagocytose av conidia fra bare vedheft til leukocytter.
Abstract
Invasiv lungeinfeksjon av mold Aspergillus fumigatus utgjør en stor trussel mot immunsupprimerte pasienter. Inhalert fungal conidia (sporer) er ryddet fra den menneskelige lunge alveoler ved å være phagocytosed av medfødte monocytter og/eller nøytrofile. Denne protokollen gir en rask og pålitelig måling av fagocytose ved å flyte flowcytometri ved hjelp av fluorescein isothiocyanate (FITC)-merket conidia for co-inkubasjons med menneskelige leukocytter og påfølgende counterstaining med et anti-FITC antistoff for å tillate diskriminering av internalisert og celle-tilhenger conidia. Store fordeler av denne protokollen er dens rapidness, muligheten til å kombinere analysen med analytiske analyse av andre celle markører av interesse, samtidig analyse av monocytter og nøytrofile fra en enkelt prøve og dens anvendelighet til andre cellevegg-bærende sopp eller bakterier. Fastsettelse av prosenter av phagocytosing leukocytter gir et middel til å mikrobiologer for å evaluere virulens av en patogen eller for å sammenligne patogen wildtypes og mutanter samt å immunologer for å undersøke menneskelig leukocytter evner å bekjempe patogener.
Introduction
Invasiv lunge aspergillose er en stor trussel mot immunsupprimerte pasienter som behandlingstilbud er begrenset og bare vellykket ved tidlig diagnose, noe som fører til høy dødelighet1. Smittsomme midler er conidia (sporer) av mold Aspergillus fumigatus som er allestedsnærværende til de fleste habitater2. Conidia er inhalert, passerer gjennom luftveiene og kan endelig gå inn i lunge alveoler. I immunkompetente mennesker, disse conidia er ryddet av medfødte immunceller som monocytter eller makrofager og nøytrofile granulocytter, som tar opp (fagocyttere) og fordøye patogener3. Fagocytose er viktig for mikrobiologer og immunologer likeså når interessert i Host-patogen interaksjoner. Konfrontasjon analyser, slik som co-inkubasjons av leukocytter og conidia, ofte inkluderer merking av sporer av fluorescein eller dets avledede fluorescein isothiocyanate (FITC). Ved hjelp av et mikroskop, er det enkelt å identifisere internalisert fluorescerende conidia og å bestemme vedlagt/tilhenger conidia, selv om denne tilnærmingen er tungvint og realistisk begrenset til noen få hundre celler4. Men i Flow flowcytometri som lett tillater analyse av hundretusener av celler i løpet av minutter, differensial farging av phagocytosed og tilhenger conidia er avgjørende. Derfor er mange protokoller stole på Trypan blå å slukke FITC-fluorescens fra tilhenger conidia5,6,7,8. En annen tilnærming er å utnytte fluorescens resonans energi overføring av etidiumbromid bromide og FITC å avgi rød i stedet for grønne fluorescens fra tilhenger conidia9,10,11. Hvis spesifikke antistoffer er tilgjengelige, slik tilfellet er for enkelte bakterier, kan celle bundne partikler være direkte beiset12,13.
Her presenterer vi en protokoll for å raskt og kvantitativt vurdere fagocytose av FITC-merket a. fumigatus conidia av menneskelige leukocytter sammen med vedlegg av sporer til celler og mangel på interaksjon ved å ansette en ALLOFYKOCYANIN (APC)-kombinert anti-FITC antistoff. Metoden gir også mulighet for samtidig flyt analytiske analyse av ytterligere celle markører som kan benyttes for egen analyse av fagocytose av monocytter og nøytrofile fra samme prøve.
Protokollen kan anvendes for karakterisering av sopp stammer (f. eks, flere arter av Aspergillus og andre former fra slekten Mucorales presentert her) og deres mutanter14 og immunologiske forskning på phagocytes, slik som leukocytter fra immunsupprimerte individer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen inkluderer bruk av menneskelige Buffy strøk innhentet fra Institutt for overføring medisin, Jena universitetssykehus og fersk venøs blod trukket fra pasienter, både etter skriftlig informert samtykke fra givere i henhold til etikk komiteen godkjenning 4357-03/15.
1. utarbeidelse av Aspergillus fumigatus Conidia
- Grow A. fumigatus på 1,5% malt agar Petri retter i 5 dager ved 37 ° c uten co2.
Forsiktig: a. fumigatus er en biosafety nivå 2 mikroorganismen og må håndteres i et egnet anlegg ved hjelp av et biosafety kabinett og iført Laboratoriefrakk, hansker og filtermaske.
Merk: platen skal dekkes helt med et gråaktig lag med conidia. Hvite kulturer ikke sporulate. Sammensetning av malt agar: 4% (w/v) malt ekstrakt, gjærekstrakt 0,4% (w/v), agar 1,5% (w/v), Aqua destinasjon. - Høsting conidia
- Plasser et papir håndkle vått med desinfiserende i biosafety kabinett og sette platen på toppen for å hindre overdistribution av flyktige conidia.
- Tilsett 10 mL fosfat bufret saltvann (PBS) + 0,01% vaskemiddel på toppen av soppen, bruk en Drigalski slikkepott for å spre væsken over platen og gni av den mørke fargede conidia. Vær forsiktig så du ikke fjerner den hvite mycel.
- Sett conidia suspensjon til en 50 mL rør ved hjelp av en 30 μm celle sil for å fjerne eventuelle gjenværende mycel.
- Gjenta trinn 1.2.2 og 1.2.3 og samle i samme 50 mL tube.
- Spin for 5 min på 2 600 x g ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspend i 20 mL sterilt vann.
- Bestem conidia konsentrasjon med et Thoma telle kammer.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her og conidia suspensjon lagret i opptil 1 måned ved 4 ° c med lokket skrudd tett.
- FITC merking
- Forbered en 0,1 mM løsning av FITC pulver i steril 0,1 M na2co3 (oppløst i PBS).
Forsiktig: FITC pulver er farlig og bør håndteres med hansker, vernebriller og filtermaske. Samle avfall i henhold til lokale forskrifter.
Merk: Utelat kunstig lys under denne og følgende trinn som involverer conidia. - Resuspend 1 x 108 (eller mindre) conidia i 5 ml FITC-oppløsning i et 15 ml rør. Ruge i 20 min ved 37 ° c i en rotator.
- For negativ kontroll, resuspend conidia i 0,1 M na2co3 (uten FITC) i en 15 ml tube. Ruge i 20 min ved 37 ° c i en rotator.
Merk: ved beregning av mengden av conidia som skal beiset, ta hensyn til et tap på opptil 70% under farging, hevelse og alle nødvendige vasketrinn. Hvis ingen Rotator er tilgjengelig, bør suspensjonen ristes tre ganger under inkubasjons. - For vasking, tilsett 10 mL PBS + 0,01% vaskemiddel til suspensjonen og spinn i 5 min ved 2 600 x g ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og gjenta vask to ganger med 10 mL PBS + 0,01% vaskemiddel.
- Forbered en 0,1 mM løsning av FITC pulver i steril 0,1 M na2co3 (oppløst i PBS).
- Hevelse av conidia (kan utelates hvis ikke ønskelig)
- Resuspend FITC merket conidia i 5 mL av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium + 10% fosterets kalv serum (FCS) og ruge i en Rotator ved 37 ° c for ønsket tid (f. eks 2 h, 4 h).
Merk: Hvis ingen Rotator er tilgjengelig, bør suspensjonen ristes minst hver 20 min under inkubasjons. - Tilsett 10 mL PBS + 0,01% vaskemiddel til suspensjonen og spinn i 5 min ved 2 600 x g ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og vask to ganger med 10 mL PBS + 0,01% vaskemiddel.
- Filtrer gjennom 30 μm celle sil for å fjerne store klumper av conidia.
- Resuspend FITC merket conidia i 5 mL av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium + 10% fosterets kalv serum (FCS) og ruge i en Rotator ved 37 ° c for ønsket tid (f. eks 2 h, 4 h).
- Festing av conidia (kan utelates hvis ikke ønskelig)
- Resuspend FITC merket og hovne conidia i 1 mL formaldehyd og ruge for 1 t ved romtemperatur.
- Tilsett 10 mL PBS + 0,01% vaskemiddel til suspensjonen og spinn i 5 min ved 2 600 x g ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og vask to ganger med 10 mL PBS + 0,01% vaskemiddel.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her og conidia lagret i PBS i mørket (tube innpakket i aluminiumsfolie) i inntil 1 uke ved 4 ° c.
2. utarbeidelse av humane primær leukocytter
- Sett 5 mL av Buffy coat i en 50 mL tube. Alternativt, bruk fersk humant perifer venøs blod trukket inn ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) monovettes (10 mL per 50 mL tube).
Forsiktig: humant blod kan overføre virus som humant immunsviktvirus og hepatitt B-virus. Håndter bare etter å ha blitt vaksinert mot hepatitt B. håndtak i et biosafety kabinett iført Laboratoriefrakk og hansker. - Fyll opp røret med erytrocytt lyse (EL) buffer, inverter tre ganger og ruge for 5-8 min horisontalt til melke utseendet til blandingen blir klar.
Merk: av og til kan det ta lengre tid å lyse opp blodet. Gå av utseendet. Det er ikke uvanlig at to rør av samme blod tar forskjellige tider til lyse. Sammensetning av EL buffer: 0,15 M NH4CL, 10 mm KHCO3, 0,1 mm EDTA - Spin for 10 min på 300 x g ved romtemperatur. Kast supernatanten.
- Resuspend pellet i 1 mL EL buffer ved pipettering. Deretter legger du til en annen 24 mL EL buffer, og invertere flere ganger.
- Spin for 5 min på 300 x g ved romtemperatur.
- Kast supernatanten og resuspend cellene i 1 mL RPMI + 10% FCS.
- Bestem celle konsentrasjonen med et Neubauer telle kammer.
3. fagocytose analysen
- Ruge 2 x 106 leukocytter og 4 x 106 FITC-merket conidia (mangfold av smitte = 2) i 1,5 ml RPMI + 10% FCS i en 12-brønn cellekultur plate. Som kontroller inkluderer bare celler (ingen conidia) og celler + umerkede conidia.
- Plasser i en fuktet CO2 inkubator ved 37 ° c og ruge for den ønskede tidsperioden (for eksempel 0,5 h, 2 h eller 4 h).
- Etter inkubasjons, høste celler med en celle skraper og satt i en 15 mL tube.
- Spin for 5 min på 300 x g ved romtemperatur.
- Samle supernatanten for cytokin analyse eller kast hvis ikke ønsket. Resuspend hver prøve i 100 μL av PBS + 2 mM EDTA.
4. antistoff farging
- For hver prøve forbereder du 100 μL av antistoff blanding, inkludert APC anti-FITC antistoff, i henhold til tabell 1.
- Sett en 100 μL prøve i en brønn av en 96-brønn V-bunnplate. Tilsett 150 μL av PBS + 2 mM EDTA for vasking.
- For farge kompensasjon, plasser 1 x 106 celler for hver farge i ytterligere brønner på 96-brønn V bunnplate. Inkluder en brønn av celler som er venstre unstained. Tilsett 150 μL av PBS + 2 mM EDTA for vasking.
- Dekkplate med en selvklebende folie.
- Spin for 5 min på 300 x g ved romtemperatur. Fjern folien.
- Kast supernatanten ved å invertere platen raskt og kraftig bare én gang over vasken eller et tørkepapir.
Merk: ikke gjenta eller banke platen på et papir til det er tørt, da dette vil resultere i et massivt tap av celler fra platen. - Resuspend celler i 100-pipettering, og bland godt ved å kombinere det.
- For farge kompensasjon resuspend de respektive cellene 100 μL av PBS + 2 mM EDTA og legger til et enkelt antistoff i hver brønn på samme beløp som brukes i antistoff miksen.
- Dekk med en selvklebende folie og ruge i 20 min ved romtemperatur i mørket.
- Fjern folien. Tilsett 150 μL av PBS + 2 mM EDTA til hver brønn for vasking. Dekk med en selvklebende folie.
- Spin for 5 min på 300 x g ved romtemperatur. Fjern folien. Kast supernatanten ved raskt og kraftig invertere platen over vasken eller en disponibel papir håndkle.
- Resuspend i 200, μL av PBS + 2 mM EDTA og Overfør celler fra hver brønn til en egen rund bunn tube. Kontroller at det ikke er noen celle klynger i suspensjonen. Fjern klynger ellers.
Merk: hver klynge som er stor nok for øyet å se er stor nok til å potensielt tette flowcytometer.
5. Flow flowcytometri
- Start strømnings flowcytometer og la den varmes opp. Start oppkjøpet programvare.
- Opprett et nytt eksperiment, og Definer og Merk eksemplene.
- Sett opp parametere (FSC 250, SSC 250) og detektorer for fluorophores FITC, APC, BUV395, V500, PerCP-CY 5.5.
- Kompensasjon oppsett
- Åpne kompensasjonsoppsett.
- Angi individuelle farger.
- Bruk kontrollcellene venstre unstained eller med individuelle farging, og angi at PMT detektor spenningene skal inkludere alle hendelser innenfor skalaen.
- Ta opp minst 10 000 hendelser av hver kontroll.
- Bruk kompensasjons oppsettet til å beregne smitteeffekter av fluorophores og gjelde for flowcytometer innstillingene for eksperimentet.
- Registrere eksempel data
- Vis FSC og SSC i oppkjøpet programvare og sette port rundt leukocytter.
- Basert på den leukocytter porten, vise prikk plot SSC/CD45 og gate for CD45 + celler for å skille fra conidia.
- Utfoldelse CD45 + celler inne en prikken flekk CD14/CD66b og gate monocytter (CD14 +) og nøytrofile (CD66b +) hver for seg.
- Display nøytrofile i en prikk plot anti-FITC/FITC.
- Bruk prøven med umerkede conidia, sett kvadranter for anti-FITC og FITC-signaler, slik at maksimalt 1% av cellene i de respektive kvadranter.
- Gjenta trinn 5.5.4 og 5.5.5 for monocytt gate.
- Ta opp alle prøvene med minst 20 000 hendelser i leukocytter gate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I måling fagocytose av A. fumigatus conidia av menneskelige phagocytic celler, diskriminering mellom ekte internalisering og bare vedlegg av conidia til cellene er en hindring, spesielt når det gjelder høy gjennomstrømming metoder som flyt flowcytometri. For å overkomme dette hinderet, presenterer vi en rask og pålitelig protokoll basert på farging av conidia med fluorescerende fargestoff FITC før co-inkubasjons av celler og conidia, etterfulgt av en counterstaining med et APC-merket anti-FITC antistoff etter inkubasjons (figur 1a). Som vist i figur 1B, FITC-merket conidia er phagocytosed av menneskelige monocytter og nøytrofile som gir et grønt signal til cellene. Disse conidia er utilgjengelige for anti-FITC antistoff, og dermed kan ikke binde antistoff og cellene vises APC negative (FITC +, APC-). Ikke-samspill celler ikke erverve et grønt signal fra FITC-merket conidia og forblir FITC-, APC-. Noen få celler vises FITC-, APC +. Siden anti-FITC APC-antistoff ikke skal kunne binde celler uten FITC-merket conidia, betraktes disse hendelsene som farge artefakter. FITC-merket conidia, som er festet til cellene, men ikke internalisert, gjengi celler også positivt for FITC men også gi et mål for anti-FITC antistoff som gjør disse cellene doble positive for FITC og APC (FITC +, APC +). Når analysert mikroskopisk, denne populasjonen inneholdt opp til 20% av cellene med vedlagte conidia bare i våre eksperimenter.
Ved hjelp av antistoffer som er beskrevet i denne protokollen og etter gating strategien i figur 1D, etterfølges en generell gating av menneskelige LEUKOCYTTER av FSC og SSC egenskaper av en separasjon av leukocytter og gratis conidia av Pan-leukocytter markør CD45. Spesielt når du bruker hovne conidia og/eller lange inkubasjons ganger, kan conidia nå nesten Cellestørrelse på tidspunktet for flyt flowcytometri og dermed bias analyse. Siden menneskets primære monocytter og nøytrofile ta opp conidia annerledes, denne protokollen gjør det mulig å separat analysere disse celle befolkning basert på farging med godt etablerte celle avstamning markører CD14 for monocytter og CD66b for nøytrofile. Gating for phagocytosing og tilhenger celle populasjoner er gjort basert på kontroll prøver med umerkede conidia som bærer verken en FITC eller et anti-FITC APC signal. Når APC og FITC er plottet mot hverandre, kvadranter er satt på en slik måte at maksimalt 1% celler er tillatt i portene av interesse.
Andelen av menneskelige primære phagocytes internalizing conidia kan være svært variabel blant blodgivere, men også avhengig av eksperimentelle faktorer som inkubasjonstid og hevelse tilstand conidia. Spore internalisering kan oppdages etter 0,5 h av co-inkubasjons allerede og øker med tiden (figur 2A). Pre-hovne conidia er tatt opp lettere enn å hvile (ikke hovne) sporer selv ved korte inkubasjons ganger (figur 2B). Hvis conidia er festet med formaldehyd, fagocytose er redusert i forhold til innfødte conidia (figur 2C).
| Reagens | μL per prøve |
| CD45 BUV395 | 1 |
| CD14 V500 | 0,5 |
| CD66b PerCP-CY 5.5 | 1,5 |
| anti-FITC APC | 0,5 |
| PBS + 2 mM EDTA | 97 |
| Totalt | 100 |
Tabell 1: antistoff blanding for strømnings flowcytometri. Mengder av hver reagens gis som mikroliter per prøve (1 x 106 celler) som skal analyseres.
Figur 1: oppsett og analyse av strømnings analytiske fagocytose analysen. (A) ordning av protokollen inkludert conidia og celle forberedelse og counterstaining. (B) fagocytose er analysert ved plotting av flyt analytiske data av FITC-merket conidia mot anti-FITC APC counterstaining. Resulterende populasjoner indikerer prosenter av ikke-samspill leukocytter (FITC-, APC-), leukocytter med tilhenger conidia (FITC +, APC +) og phagocytosing leukocytter (FITC +, APC-) samt farging gjenstander (FITC-, APC +). (C) Double positive celle populasjoner fra 3 forskjellige eksperimenter med 3 forskjellige givere (to av dem utført i duplikater, en utført singel) ble mikroskopisk telles for internalisert og festet bare conidia. (D) representant gating strategi flyt analytiske data for å oppdage LEUKOCYTTER (CD45), identifisere MONOCYTTER (CD14) og nøytrofile (CD66b) og bestemme samspill POPULASJONER (FITC, anti-FITC). Dette tallet er endret fra Hartung et al., flowcytometri A, 95:3, s. 332-338 (2019)14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: fagocytose av conidia av menneskets primære phagocytes avhenger av flere forhold. (A) prosentandel av celler internalizing hvile conidia økt med co-inkubasjonstid. (B) fagocytose økte med conidial hevelse tid når co-inkubert for 0,5 h. (C) native conidia var bedre phagocytosed enn faste conidia. Data ble innhentet fra 10 forskjellige donorer (a, b) eller 5 forskjellige givere (c) i 10 (a, b) eller 5 (c) uavhengige eksperimenter. Feilfelt angir SD. Dette tallet er endret fra Hartung et al., flowcytometri A, 95:3, s. 332-338 (2019)14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: analyse av fagocytose er et middel til å vurdere funksjonaliteten til menneskets primære phagocytes og karakterisere klinisk relevante former. (A) eksemplarisk sammenligning av monocytter fra en sunn donor og en aper pasient (etter blodkreft stilk cellen transplantasjon) phagocytosing hviler conidia for 0,5 h, 2 h og 4 h. (B) fagocytose av hvile fungal conidia ble bestemt for klinisk relevante Aspergillus og Mucorales arter etter 2 h co-inkubasjons. Data ble innhentet fra 5 (Aspergillus) eller 3 (Mucorales) ulike givere i 5 eller 3 uavhengige eksperimenter hver. Feil linjer angir SD. forkortelser: A. Aspergillus, L. Lichtheimia, M. Mucor, R. Rhizopus Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen presenterer en rask flyt analytiske metode for å måle interaksjon av a. fumigatus conidia med et stort antall primære menneskelige leukocytter som ikke er mulig i vanlige mikroskopiske protokoller. Imaging celler med et mikroskop og manuelt telling internalisert conidia er tungvint og realistisk kan gjøres for et par hundre celler bare. Flow flowcytometri overvinner dette problemet ved å måle tusenvis av celler i løpet av minutter. Et hinder felles for begge tilnærminger er skillet mellom phagocytosed og tilhenger conidia i eller på celler, henholdsvis. I mikroskopi, fargestoff calcofluor hvitt er ofte brukt for farging tilhenger conidia men bruken er begrenset til mikroorganismer med en kitin celle veggen.
Denne protokollen i kontrast brukt distinkte fluorophores for karakterisering av interaksjon hendelser som gjør at tillegg av ytterligere celle markører, for eksempel avstamning markører CD45, CD14 og CD66b. Dermed er det også mulig å diskriminere fagocytose av patogener ved monocytter og nøytrofile i en enkelt prøve. Selv om valg av markører og fluorophores for celle identifikasjon kan tilpasses behovene til eksperimentet og kapasitetene til de tilgjengelige flowcytometer, anbefales bruken av det spesifikke APC anti-FITC-antistoff som nevnes i denne protokollen, da det var mest pålitelige antistoff i våre hender.
Siden formaldehyd-faste conidia er ikke internalisert like godt, Native sporer er anbefalt for fagocytose analyser. Men native conidia vil starte eller fortsette hevelse under co-inkubasjons med menneskelige leukocytter og til slutt spire. Vanligvis, A. fumigatus conidia spire etter ca 8-9 h i glukose-inneholdende medier ved 37 ° c. Kombinasjonen av hevelse tid og co-inkubasjonstid med phagocytes bør ikke overstige denne tidsrammen som spire forårsaker tap av FITC på conidia overflaten. Flere betydelig, germlings kan ikke være phagocytosed mere av monocytter eller nøytrofile. I stedet, disse phagocytes akkumuleres rundt og hold deg til germlings som produserer celle klynger som tetter flowcytometer, hvis ikke fjernet. Tilsvarende 4 h hovne conidia tendens til å generere klynger seg imellom og med celler. Ofte disse klynger kan ikke skilles mekanisk lenger og cellene innenfor er tapt for Flow analytiske analyse.
Selv om gating er enkel og lett i begynnelsen, jo mer conidia er internalisert av celler, kan uskarpe gating bli. Bruke fuktighet > 2 øker fagocytose ved første gangs poeng, men gating problemer kan oppstå tidligere også. Derfor bør fuktighet være nøye bestemt med de spesifikke cellene og patogener av interesse.
En begrensning av denne protokollen er i dualitet av cellen befolkning med tilhenger conidia (FITC + APC +) som kan også være harboring celler med tilhenger samt internalisert conidia. En mulighet for videre diskriminering er anvendelsen av bilde flyt flowcytometri15 som tillater visuell Imaging av alle celler målt i flyten flowcytometer.
På grunn av løs FITC merking av conidial celle veggen, er denne metoden lett overførbar til andre sopp av interesse som klinisk relevante formene av slekten Mucorales eller gjær Candida albicans. Videre kan også celle-vegg bærende bakterier være FITC-merket. Den universelle counterstaining med anti-FITC antistoff gir rask og enkel måling av fagocytose av alle disse patogener både av et stort antall menneskelige leukocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker fru Pia stier for utmerket teknisk assistanse. M. von Lilienfeld-toal er støttet av Center for sepsis kontroll og omsorg (det tyske føderale departementet for utdanning og helse, BMBF, FKZ 01E01002) og InfectoGnostics Research campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc mai Hoang er støttet av Jena School of mikrobiell Communication (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
References
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
- Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
- Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
- Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
- Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
- Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
- Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
- Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
- de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
- Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
- Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).
