Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Celletypespecifik proteinrensning og identifikation fra komplekse væv ved hjælp af en mutant methionin tRNA-syntetasemuselinje

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63713
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1, 2
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man udfører celletypespecifik proteinmærkning med azidonorleucin (ANL) ved hjælp af en muselinje, der udtrykker en mutant L274G-methionin tRNA-syntetase (MetRS *) og de nødvendige trin til mærkning af celletypespecifikke proteiner. Vi skitserer to mulige ANL-administrationsveje i levende mus ved (1) drikkevand og (2) intraperitoneale injektioner.

Abstract

At forstå proteinhomeostase in vivo er nøglen til at vide, hvordan cellerne fungerer under både fysiologiske og sygdomsforhold. Den nuværende protokol beskriver in vivo-mærkning og efterfølgende oprensning af nyligt syntetiserede proteiner ved hjælp af en konstrueret muselinje til direkte proteinmærkning til specifikke cellulære populationer. Det er en inducerbar linje ved Cre-rekombinaseekspression af L274G-methionin tRNA-syntetase (MetRS*), hvilket muliggør azidonorleucin (ANL) inkorporering i proteinerne, som ellers ikke vil forekomme. Ved hjælp af den metode, der er beskrevet her, er det muligt at rense celletypespecifikke proteomer mærket in vivo og detektere subtile ændringer i proteinindholdet på grund af reduktion af prøvekompleksitet.

Introduction

Afvigende protein homeostase er forårsaget af en ubalance i proteinsyntese og nedbrydning. Flere sygdomme er relateret til ændringer i proteinhomeostase. Kendetegnende for nogle sygdomme er tilstedeværelsen af aggregater i forskellige subcellulære steder og hjerneområder. Protein homeostase er ikke kun vigtig i sygdom, men spiller også en afgørende rolle i normal organ og cellulær funktion1. For eksempel er proteinsyntese nødvendig for mange former for neuronal plasticitet2,3, som bestemt ved anvendelse af kemiske hæmmere, der blokerer proteinsyntese4. Det er imidlertid hverken klart, i hvilke celletyper proteomet ændres for at understøtte læring og hukommelse, og det forstås heller ikke, hvilke specifikke proteiner i hver celletype der øges eller falder i deres syntese eller nedbrydning. Således kræver en omfattende undersøgelse af proteinhomeostase evnen til at differentiere proteomer, der kommer fra specifikke celletyper. Faktisk har identifikationen af celletypespecifikke proteomer til undersøgelse af cellulære processer, der forekommer i et flercellet miljø, været en vigtig hindring i proteomics. Af denne grund udviklede vi en teknik ved hjælp af MetRS * -udtryk kombineret med bioortogonale metoder, der har vist sig at være en effektiv måde at identificere og rense celletypespecifikke proteomer og udfylde dette hul 5,6,7.

Ekspressionen af en mutant MetRS* (MetRS L274G) gør det muligt at indlæse den ikke-kanoniske methioninanalog ANL i det tilsvarende tRNA 8,9 og dets efterfølgende inkorporering i proteiner. Når MetRS*-ekspression reguleres af en celletypespecifik promotor, vil den ikke-kanoniske aminosyre blive inkorporeret i proteinerne på en celleselektiv måde. Når ANL er inkorporeret i proteinerne, kan det selektivt funktionaliseres ved klikkemi og efterfølgende enten visualiseres ved billeddannelse (FUNCAT) eller ved Western Immunoblot (BONCAT). Alternativt kan proteiner selektivt oprenses og identificeres ved massespektrometri (MS). Ved hjælp af denne teknologi skabte vi en muselinje, der udtrykker MetRS*-proteinet under kontrol af Cre-rekombinasen. I betragtning af det stigende antal tilgængelige Cre-mus-linjer kan MetRS*-systemet bruges i ethvert felt til at studere enhver celletype fra ethvert væv, for hvilket der er en eksisterende Cre-line. Proteinmærkning med ANL er mulig in vitro eller in vivo og ændrer ikke musens adfærd eller proteinintegritet6. Mærkning af tidsperiode kan tilpasses det videnskabelige spørgsmål for hver forsker, mærkning af nyligt syntetiserede proteiner (kortere mærkningstider) eller hele proteomer (længere mærkningstider). Brugen af denne teknik er begrænset af antallet af celler af den type, som forskeren er villig til at studere; derfor er proteinisolering fra celletyper med lavt antal eller lave stofskifter ikke mulig ved denne metode. Målet med den præsenterede metode er at identificere celletypespecifikke proteiner/proteomer mærket in vivo. I denne protokol beskriver vi, hvordan man mærker celletypespecifikke proteomer med ANL i levende mus og renser de mærkede proteiner. Efter oprensning kan proteiner identificeres ved rutinemæssige massespektrometriprotokoller 5,10. Reduktionen af prøvekompleksitet opnået i denne metode ved selektiv oprensning af proteiner fra specifikke cellulære populationer gør det muligt for eksperimentatoren at detektere subtile ændringer i proteomer, for eksempel som reaktion på miljøændringer. Oprensning af de mærkede proteiner kan opnås på ~ 10 dage, ikke inklusive MS-analysen eller mærkningsperioden. Her beskriver vi to metoder til ANL-administration til MetRS*-ekspressive mus, nemlig (1) tilsætning af aminosyren i drikkevandet og (2) introduktion af ANL ved intraperitoneale injektioner. Uanset hvilken metode der er valgt til ANL-administration, er isolerings- og rensningstrinnene de samme (fra trin 2 og frem).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført med tilladelse fra de lokale regeringskontorer i Tyskland (RP Darmstadt; protokoller: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) eller Spanien (Udvalget for Dyreforsøg ved UCM og Miljørådgivning i Comunidad de Madrid, protokolnummer: PROEX 005.0/21) og er i overensstemmelse med Max Planck Society-reglerne og spanske regler og følger EU's retningslinjer for dyrevelfærd.

1. In vivo metabolisk mærkning med ANL

  1. Drikkevand:
    1. Opløs ANL og maltose i musenes almindelige drikkevand. Den anbefalede maltosekoncentration er 0,7% (wt/vol). Den maksimale mængde ANL tilsat drikkevandet er 1% (wt / vol). Når blandingen er klar, steriliseres den ved filtrering og opbevares ved 4 °C.
    2. Tilfør den blanding, der er fremstillet i trin 1.1, til musene. Skift flasker ofte (f.eks. Hver 3. dag) for at undgå forurening, og kontroller dem hver dag for at se efter mulig forurening eller tilstopning. Overvåg mængden af drukket vand dagligt ved at veje det for at kende musens ANL-indtag.
      BEMÆRK: Den maksimale mærkningsperiode, der evalueres her, er 3 uger ved hjælp af en ANL-koncentration på 1% i drikkevandet, hvilket resulterede i veldetekterbar mærkning i hjernen. God mærkning kan også opnås på 2 uger. Hverken kortere mærkningstider eller længere tidspunkter eller andre ANL-mængder er blevet undersøgt af os ved hjælp af denne administrationsmetode, hvilket ikke indebærer, at ovenstående ikke ville fungere. ANL-inkorporeringshastigheder kan variere afhængigt af det studerede væv eller celletype. Tidspunktet for mærkning kan variere afhængigt af det videnskabelige spørgsmål; For eksempel, hvis proteomer skulle mærkes, skal mærkningstiden beregnes i funktion af den gennemsnitlige halveringstid for proteinerne i det undersøgte væv. Hvis interessen kun er at identificere nyligt syntetiserede proteiner, kan tiderne forkortes. Mærkningsperioderne og ANL-doserne skal empirisk testes for hver eksperimentel tilstand og celletype af interesse.
  2. Administration af intraperitoneal:
    1. ANL opløses i fysiologisk NaCl-opløsning til 400 mM, fosfatsaltbuffer (PBS) eller vand.
    2. Sørg for, at opløsningens osmolaritet er inden for det fysiologiske område. Her administreres 10 ml / kg legemsvægt af ANL-opløsning til musene.
      BEMÆRK: God mærkning i hjernens excitatoriske neuroner opnås med succes ved en daglig intraperitoneal injektion (IP) med 400 mM ANL i 1 uge. Hverken lavere ANL-koncentrationer eller andre mærkningsperioder ved IP-injektioner er blevet testet i denne undersøgelse, hvilket ikke betyder, at de ikke ville fungere. ANL leveres som hydrochlorid af nogle virksomheder. I dette tilfælde skal opløsningernes pH-værdi justeres til den tilstrækkelige pH-værdi (afhængigt af administrationsvejen). ANL kan også syntetiseres efter metoden offentliggjort af Link et al.11 med nogle ændringer5. ANL-mærkning kan udføres ved hjælp af andre ANL-koncentrationer, tidsperioder og administrationsveje. For væv / celletyper med lave metaboliske hastigheder kan en methionindiæt med lavt indhold anvendes, altid startende 1 uge før ANL-administration. Når der anvendes 400 mM ANL, kan den udfældes, mens den opbevares ved 4 °C; opvarmning op til 37 °C bringer ANL tilbage i opløsningen. Lad det nå stuetemperatur før injektion. I de fleste verdensregioner er ANL-administration til mus et dyreforsøg og skal godkendes af de relevante myndigheder.

2. Vævshøst, lysis og proteinekstraktion

  1. Vævsdissektion: Disseker det område af væv, der indeholder celletypen af interesse, og noter vægten af det indsamlede vævsstykke.
    BEMÆRK: Prøver kan opbevares ved -80 °C i flere måneder (stoppunkt). I den nuværende protokol blev mus cortex og hippocampus dissekeret.
  2. Vævslysis: Homogeniser vævet ved stuetemperatur ved at tilsætte et volumen 12-15 gange den våde vægt af vævet i lysisbufferen (PBS pH 7,4, 1% wt/vol SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100, Benzonase (1:1000 vol/vol), en proteasehæmmer (PI) (EDTA-fri 1:4000)). For eksempel tilsættes 240-300 μL lysisbuffer til et 20 mg vævsstykke. Triturere vævet, indtil det er homogeniseret.
    BEMÆRK: Prøver kan opbevares ved -80 °C i flere måneder (stoppunkt). Til direkte homogenisering i 1,5 ml rør anbefales brug af en håndholdt, batteridrevet homogenisator, især når små stykker væv behandles. Til større stykker kan en Dounce homogenisator bruges. Til hver buffer, hvor proteasehæmmere (PI) er inkluderet, skal de tilføjes umiddelbart før brug og ikke tidligere.
  3. Proteindenaturering: Homogenatet opvarmes til 75 °C i 15 minutter og centrifuge ved 17 000 x g i 15 minutter ved 10 °C. Overfør supernatanten til et nyt rør.
  4. Måling af proteinindhold: Mål proteinkoncentrationen i hver prøve, og juster alle prøverne, så de sammenlignes med den samme proteinkoncentration; Juster koncentrationen ved at tilføje lysisbuffer. Et optimalt koncentrationsområde er mellem 2-4 μg/μL.
    BEMÆRK: Prøver kan opbevares ved -80 °C i flere måneder (stoppunkt).
  5. Alkylering
    1. De homogeniserede prøver fortyndes 2-3 gange i PBS (pH 7,8) + PI (EDTA-fri 1:4000).
    2. Der tilsættes iodoacetamid (IAA) til en slutkoncentration på 20 mM (stamopløsning 500 mM).
    3. Prøverne efterlades i 1-2 timer ved 20 °C i mørke. Udfør trin 2.5.2-2.5.3 to gange.
      BEMÆRK: For nogle væv, hvis det ikke-specifikke klik i den negative kontrol forbliver højt, kan det være nødvendigt at udføre et reduktionstrin før alkylering12. Forbered IAA-lageret frisk lige før du tilføjer det til prøverne. Prøverne kan opbevares ved -80 °C i flere måneder (stoppunkt).
  6. Bufferudveksling: Ækvilibrer bufferudvekslingskolonner ved hjælp af klikkemiudvekslingsbufferen (PBS pH 7,8, 0,04% (wt/vol) SDS, 0,08% (vol/vol) Triton X-100 og PI (1:4000)). Følg producentens anvisninger. Udveksl alle alkylerede prøver.
    BEMÆRK: Eluerede prøver kan opbevares ved -80 °C i flere måneder (stoppunkt). I dette trin elimineres IAA, og bufferen udveksles med klikkemibufferen. Protein kan måles igen efter bufferudvekslingstrinnet for at sikre, at proteinerne ikke gik tabt under bufferudvekslingsprocessen. Afhængigt af den type kolonner, der anvendes til bufferudveksling, kan protein gå massivt tabt. Brug de anbefalede kolonner for at undgå proteintab. Til prøveopbevaring anbefales fremstilling af aliquots.
  7. Klik på reaktion for at evaluere ANL-inkorporering i eksperimentet
    1. Der udtages 40 μL af de eluerede prøver i trin 2,6, og PBS (pH 7,8) tilsættes til et slutvolumen på 120 μL.
    2. For at indstille klikkemireaktionen tilsættes følgende reagenser i den givne rækkefølge og hvirvel i 20 s efter hver tilsætning: 1,5 μL triazolligand (lager 40 mM), 1,5 μL biotinalkyn (lager 5 mM) og 1 μL Cu(I)-bromid (stammateriale 10 mg/ml, opløst i DMSO ved omhyggelig pipettering op og ned, ikke hvirvel). Tilsæt reagenserne så hurtigt som muligt.
    3. Prøverne inkuberes natten over i mørke ved 4 °C med kontinuerlig rotation.
    4. Prøverne centrifugeres ved 4 °C i 5 minutter ved 17 000 x g. En lidt turkis pellet vil være synlig. Overfør supernatanten til et nyt rør.
      BEMÆRK: Tilbered Cu (I) bromidfond umiddelbart før brug for at undgå kobberoxidation. Det er vigtigt at holde volumenforholdet mellem den lyserede prøve og PBS konstant mellem prøverne for at sikre den samme endelige koncentration af vaskemiddel i hvert rør. For at fremskynde samlingen af klikkemireaktionen anbefales en bordhvirvel med stativer til rør. De klikkede prøver opbevares ved -80 °C i flere måneder eller ved -20 °C i et par uger indtil videre behandling (stoppunkt).
  8. Western blot-analyse for at evaluere ANL-inkorporering i eksperimentet
    1. Kør en SDS-SIDE med 20-40 μL supernatant fra klikkemireaktionen (trin 2.7). Brug 12% acrylamid geler, køre i 1% SDS, 250 mM Tris-HCI, 2 mM glycin. Kør indtil fronten er ude af gelen.
    2. Overfør proteinerne til en nitrocellulose eller PVDF-membran13.
    3. Inkubere membranen natten over ved 4 °C med GFP-antistof (1:500, GFP-protein oversættes sammen med MetRS*5) og biotinantistof (1:1000) til klik-alkyndetektion, som er konjugeret til biotin.
    4. Vask det primære antistof 2 gange i 10 minutter og tilsæt det sekundære antistof i 1,5 time.
    5. Vask det sekundære antistof 2 gange i 10 minutter og scan (hvis du bruger fluorophorekonjugerede antistoffer) eller udsæt for film (hvis du bruger peberrodsperoxidasekonjugerede antistoffer).
    6. Kvantificer biotinsignalet ved hjælp af ImageJ eller lignende software, evaluer den generelle mærkning af hver prøve af eksperimentet, og registrer mulige outliers. Evaluer signal/støj-forholdet (ANL-prøvemærkning til baggrund fra de negative kontroller) af forsøget, og påfind mulige dyr, der ikke har optaget/inkorporeret ANL.
      BEMÆRK: For prøver med høj ANL-inkorporering er proteinrensning teoretisk mulig ved anvendelse af ikke-spaltede alkyner som den, der anvendes i dette afsnit til evaluering af ANL-inkorporering. Ved hjælp af hjerneprøver er baggrunden opnået i de negative kontroller af MS efter proteinrensning ved hjælp af ikke-spaltede alkyner for høj14. Derfor blev kun de lettere at håndtere, ikke-spaltbare alkyner brugt til en første generel prøve- og eksperimentevaluering. Uanset hvilken type alkyn beregnet til proteinrensning, anbefales det at udføre trinene til alkyndoseringsoptimering beskrevet i det følgende afsnit (trin 2.9).
  9. Klik reaktion for spaltning af alkyndosering
    1. Der fremstilles fire rør med 40 μL af en repræsentativ prøve (opnået i trin 2.6 og evalueret i trin 2.8), og PBS (pH 7,8) tilsættes til et slutvolumen på 120 μL.
    2. Indstil klikkemireaktionen som forklaret i trin 2.7, men denne gang skal du tilføje fire forskellige mængder af DST-alkyn. For nævnte alkyn anbefales det at teste 5 μM, 15 μM, 30 μM og 60 μM.
    3. Gentag trin 2.8 for at afgøre, hvilken der er den mest egnede alkyndosis til det specifikke eksperimentelle spørgsmål, der undersøges, baseret på den højeste mærkningseffektivitet med det laveste baggrundssignal.
      BEMÆRK: Før de resterende prøver udsættes for en klikreaktion, skal den optimale mængde af enhver alkyn bestemmes. Der er flere muligheder for kommercielt tilgængelige alkyner, der kan bruges. De adskiller sig i form af spaltning (f.eks. Lys eller reduktionsmidler). Kobberfri klikkemi ved hjælp af belastningsfremmede reagenser (f.eks. DBCO-reagenser) er også mulig. Små ændringer i mængden af enten alkyner eller DBCO-reagenser øger ofte signalet i den negative kontrol (baggrund) betydeligt. Her beskrives proteinrensningen ved hjælp af en alkyn med en disulfidbro, der kan spaltes ved reduktionsmidler (Disulfidbiotinalkyn eller DST-alkyn15). Når du bruger DST-alkyn, skal du undgå at indlæse buffere med stærke reduktionsmidler som DTT eller β-Mercaptoethanol for at forhindre alkynspaltning til kørsel af SDS-PAGE (trin 8.1). I denne undersøgelse påvirker opvarmning ved 72 °C i 5 minutter ved hjælp af 5 mM N-ethylmaleimid (NEM) i belastningsbufferen ikke DST-alkynstabiliteten. Trin 2.9.2 kan gentages og teste mere finkornede doser inden for området for den bedste observerede.
  10. Præparativ klikreaktion til proteinrensning
    1. Klik på alle prøverne opnået i trin 2.6 med den optimale alkyndosis bestemt i trin 2.9 og analyser en brøkdel ved SDS-PAGE og Western blot (trin 2.8).
      BEMÆRK: Sørg for, at pipetterne er korrekt kalibreret for at sikre prøveopskaleringsnøjagtighed. Klikkede prøver kan opbevares ved -80 °C i flere måneder (stoppunkt).

3. Proteinrensning

  1. Bufferudveksling
    1. Udsæt alle klikkede prøver for en bufferudvekslingsprocedure som beskrevet i trin 2.6, men brug Neutravidinbindingsbuffer som ligevægtsbuffer (PBS pH 7,4, 0,15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 og PI (1:2000)).
      BEMÆRK: Eluerede prøver kan opbevares ved -80 °C i flere måneder (stoppunkt). I dette trin elimineres den ikke-klikkede frie alkyn, og bufferen udveksles af Neutravidin-bindingsbufferen.
  2. Binding til Neutravidin perler
    1. Neutravidin-perlerne med høj kapacitet vaskes med Neutravidin-bindingsbufferen (se trin 3.1); Bland perlerne med bufferen og centrifuger blandingen i 5 min ved 3000 x g, og kassér supernatanten. Gentag tre gange.
    2. Forbered en 1:1 opslæmning af Neutravidin perler ved at tilføje den samme mængde tørre perler og Neutravidin bindende buffer.
    3. 20-40 μL af hver prøve afsættes som forrenset lysat, og den opbevares ved -20 °C.
    4. Proteinkoncentrationen måles (se trin 2.4), og 100 μg protein blandes med 4 μL af perleopslæmningen opnået i trin 3.2.2.
    5. Inkuber blandingen natten over ved 4 °C med kontinuerlig rotation, hvilket gør det muligt for mærkede proteiner at binde sig til perlerne.
      BEMÆRK: Hvad angår klikkemireaktionen, kan den grundlæggende affinitetsrensningsreaktion, der er beskrevet i trin 3.2.4, opskaleres. For eksempel til oprensning af proteiner fra hippocampus excitatoriske neuroner blandes 1 mg proteinlysat med 40 μL Neutravidin-perler (1: 1 opslæmning). Mængden af Neutravidin-perler kan skaleres op eller ned i henhold til mængden af mærkede proteiner pr. mg total protein, hvilket afhænger af den valgte celletype og mærkningsperiode og skal bestemmes empirisk.
  3. Neutravidin perler vasker og protein elution
    1. Supernatanterne opsamles ved centrifugering (se trin 3.2.1). Der lægges en 20-40 μl aliquot af hver supernatant til side til senere analyse, og resten fryses ved -80 °C.
    2. Perlerne vaskes med kølet Neutravidin-vaskebuffer 1 (PBS pH 7,4, 0,2% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 og PI (1:2000)) ved at tilsætte bufferen, sedimentere perlerne og kassere supernatanten. Gentag dette trin tre gange.
    3. Tilsæt derefter den samme buffer og inkuber perlerne i 10 minutter under kontinuerlig rotation ved 4 ° C, før supernatanten kasseres. Gentag dette trin tre gange.
    4. Perlerne vaskes som forklaret i trin 3.3.2-3.3.3, men ved hjælp af Neutravidin vaskebuffer 2 (1x PBS, pH 7,4 og PI 1:2000).
    5. Perlerne vaskes som forklaret trin 3.3.2-3.3.3, men ved hjælp af Neutravidin vaskebuffer 3 (50 mM ammoniumbicarbonat og PI 1:2000).
    6. Elute de klikkede proteiner ved at inkubere perlerne i 30 minutter ved 20 °C med et volumen Neutravidin-elueringsbuffer (5% (vol/vol) β-mercaptoethanol og 0,03% (wt/vol) SDS) svarende til et volumen af de anvendte tørperler.
    7. Hold perlerne i suspension under eluering ved kontinuerlig omrøring (1000 o / min) i en termoblokryster. Elute to gange og kombinere begge eluater.
      BEMÆRK: Den centrifugering, der er beregnet til adskillelse af den faste fraktion af gyllen (perler) og den vandige fase (supernatant), som forklaret i trin 3.2.1, gælder for trin 3.3.1-3.3.7. SDS-mængden kan øges, hvis proteineluering ikke er komplet. Men med mængder over 0,08% -0,1% SDS begynder proteiner, der ikke specifikt er bundet til perlerne, at blive elueret. β-mercaptoethanol er flygtig og giftig; Det anbefales at bruge en hætte til trin 3.3.6-3.3.7. Prøverne indsamlet i trin 3.2.3 og 3.3.1 skal køres af SDS-PAGE og evalueres af Western blot (se trin 2.8) til evaluering af effektiviteten af affinitetsrensningen (trin 3.3).
  4. Evaluering af eluerede proteiner
    1. Indlæs 1/3 af de eluerede prøver på en SDS-SIDE (se trin 2.8.1).
    2. Plet gelen for at visualisere proteiner ved hjælp af en højfølsomhedsmetode, såsom sølvfarvning eller en fluorescerende metode.
    3. Hvis prøverne har den forventede kvalitet, hvilket betyder, at der er 3-4 gange mere protein i de ANL-mærkede prøver sammenlignet med den negative kontrol, kan de eluerede proteiner identificeres ved rutinemæssige massespektrometrimetoder som den, der er forklaret i reference5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter den beskrevne protokol (opsummeret i figur 1) blev ANL administreret til mus enten ved daglige intraperitoneale injektioner (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) i 7 dage eller via drikkevand (0,7 % Maltose, 1 % ANL, CamkII-Cre::MetRS*) i 21 dage. Efter mærkning blev de tilsvarende hjerneområder dissekeret, lyseret, alkyleret og klikket. Klikreaktioner blev analyseret af SDS-PAGE og Western Immunoblot. Repræsentative billeder af forsøgene er vist i figur 2 for ANL-administration ved IP-injektion og i figur 3 for ANL-administration via drikkevand. Bemærk, at formålet med tallene er at vise, at begge mærkningsprotokoller fungerer, ikke at sammenligne dem. Sammenligning er ikke mulig, fordi forskellige neuronale populationer er mærket i de to viste eksperimenter (excitatoriske neuroner i hippocampus og cortex og Purkinje neuroner i lillehjernen).

Et yderligere eksperiment giver et eksempel til bestemmelse af den optimale DST-spaltede alkynkoncentration (figur 4). I dette eksempel er foldændringen mellem mærket prøve og kontrol højest ved en alkynkoncentration på 14 μM. Denne alkynkoncentration påføres derefter på alle prøver. Efter verifikation af mærkningen af hver prøve i forsøget med den valgte alkynmængde blev alle prøver udsat for oprensning af ANL-mærkede / biotin-klikkede proteiner ved affinitetsbinding ved hjælp af Neutravidin-perler (figur 5). I dette trin bindes proteiner til perlerne, vaskes og efterfølgende elueres ved at reducere disulfidbroen, der er til stede i DST-alkyn. Efter dette sidste trin forbliver biotinet og en del af alkynen bundet til perlerne. De ANL-holdige proteiner (bundet til resten af alkyn) genvindes i elueringsbufferen. For at evaluere effektiviteten af elueringstrinnet lægges en tredjedel af eluatvolumenet på en SDS-PAGE-gel og visualiseres ved hjælp af en følsom total proteinpletmetode. Mindst en 3 gange intensitetsforskel i total proteinplet mellem negative kontroller og ANL-mærkede prøver skal observeres for at opnå fortolkelige resultater med massespektrometri. Afslutning af alle trin, der er beskrevet i denne protokol, efterfølges af MS-prøveforberedelse, erhvervelse og analyse5. Selvom der ikke er særlige krav til MS (hvert laboratorium kan bruge sin rutinemæssige MS-protokol 5,10), skal man huske på, at mængden af oprensede proteiner generelt vil være lav (i størrelsesordenen nanogram). Figur 6 giver et eksempel på MS-resultater med en klar berigelse i den ANL-mærkede prøve sammenlignet med kontrollen (figur 6A). Denne forskel var allerede synlig i den samlede proteinplet vist i figur 5. Udover ændringer i peptidintensitet findes der også unikke proteiner i begge prøver (figur 6B).

Figure 1
Figur 1: Arbejdspipeline for celletypespecifik proteinrensning af BONCAT. Efter proteinmærkning med ANL dissekeres og lyseres vævet af interesse, mærkes med biotin ved klikkemi, og mængden af mærkning for hver prøve evalueres af BONCAT. Outliers (der ikke inkorporerede ANL) og repræsentative prøver kan differentieres i dette trin. En af de repræsentative prøver klikkes igen for at finde den optimerede spaltebare alkyndosis til efterfølgende proteinrensning. Alkyndoseringen, der opnår det bedste signal-støj-forhold, anvendes på hver biologisk replikat. Celletypespecifikke proteiner opnås ved affinitetsoprensning. Oprensede prøver studeres ved massespektrometri, og proteiner identificeres. Dette tal er blevet ændret fra Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: ANL-administration ved intraperitoneale injektioner (IP). BONCAT blev udført for at evaluere proteinmærkning i hippocampus (HP) og cortex (CX) efter metabolisk mærkning af proteiner med ANL ved daglige IP-injektioner i 7 dage. Wild-type mus prøver som negativ kontrol (wt) blev klikket parallelt med de mærkede prøver (MetRS *). Mærkede proteiner er fra de excitatoriske neuroner ved hjælp af en Nex-Cre:: MetRS * linje16. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: ANL-administration ved drikkevand. BONCAT blev udført for at evaluere proteinmærkning i Purkinje-neuronerne i lillehjernen efter administration af ANL til GAD-Cre::MetRS* mus via drikkevand i 21 dage. Figuren viser en negativ kontrol (wt) og en mærket prøve (MetRS*) lyset og klikket parallelt. Dette tal er blevet ændret fra Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: DST-alkyn dosering titrering. En biologisk replikat pr. eksperiment vælges som en repræsentativ prøve for at titrere den optimale alkynkoncentration. Tre koncentrationer (14, 28 og 56 μM) af alkynen blev testet her i klikreaktionen for BONCAT. Mærkningsforholdet mellem den ANL-mærkede prøve (MetRS*) og den negative kontrol (wt) bestemmer signal/støj-forholdet (vist i grafen). 14 μM er den bedste alkynkoncentration opnået i dette forsøg. Cortexvæv fra den ANL-mærkede Nex::MetRS* muselinje blev brugt til dette eksperiment. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Oprensede proteiner. Mærkede proteiner fra Purkinje neuroner blev renset og farvet ved hjælp af SYPRO Ruby. Dette tal er blevet ændret fra Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Proteinidentifikation og kvantificering. Purkinje-celleproteomet blev opnået ved massespektrometri ved anvendelse af lillehjernen fra en GAD-Cre::MetRS* muselinje som udgangsmateriale. (A) viser øgede forekomster (peptidintensitet) af de identificerede proteiner i ANL-mærkede prøver sammenlignet med vildtype (wt) mus. (B) Purkinje-proteomet blev opnået ved at samle proteiner beriget i de ANL-mærkede prøver i A (defineret ved >3 gange intensiteter i MetRS*-mus sammenlignet med wt) og unikke proteiner, der findes i MetRS*-ekspressive mus. Dette tal er blevet ændret fra Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kritiske aspekter af protokollen er; inkludering af negative kontroller, der har tilstrækkelige biologiske replikater, ANL-administrationsvej, mængde og varighed, alkylering af prøverne, alkynkoncentration og eliminering af β-mercaptoethanol ved anvendelse af DST-alkyn.

Det er vigtigt at inkludere negative kontrolprøver, der stammer fra ANL-mærkede dyr uden Cre-driver og derfor ingen MetRS *-udtryk. Disse prøver skal underkastes hvert trin, der er beskrevet i protokollen, parallelt med prøverne fra ANL-mærkede Cre-inducerede MetRS*-mus. Prøver, der ikke er klikket på, er ikke gyldige kontroller, da alle resultater, der opnås ved kun at bruge denne kontrol, kan skyldes uspecifikke klik. Vi har ikke observeret inkorporering af ANL i celler, der ikke udtrykker MetRS * -genet, eller MetRS * -ekspression i celler uden Cre; således kan wt-dyr mærket med ANL bruges som en negativ kontrol.

Da den hermed beskrevne protokol består af mange trin, hvor prøver kan gå tabt, anbefales det at beregne biologiske replikater under hensyntagen til tekniske fejl. For hjerneprøver er der ca. 30% replikattab.

Vi beskriver her to ANL-administrationsruter og varigheder. Dette udelukker ikke, at andre administrationsveje (f.eks. Tilsætning af ANL til maden) fungerer lige så godt. Med hensyn til den administrerede ANL-mængde blev de eksperimenter, der er vist her, udført ved hjælp af relativt høje mængder ANL. Mærkning med lavere mængder er også mulig afhængigt af den eksperimentelle opsætning. Det korteste tidsrum for ANL-mærkning, der er rapporteret i denne protokol, er 1 uge og de længste 21 dage. Kortere eller længere mærkningsperioder kunne anvendes, men vi har ikke bestemt det. Forskere bør bestemme ANL-administrationsvejen, ANL-doseringen og ANL-mærkningsperioden, der er passende for det specifikke eksperimentelle spørgsmål, der undersøges, ved at overveje vævets metaboliske egenskaber, celletypen af interesse og det eksperimentelle spørgsmål, der undersøges.

Prøvealkylering, også kendt som capping, er et vigtigt skridt for at undgå baggrundsklik17. Når alkylering udføres korrekt, reduceres det ikke-specifikke klik, som overvåges af kontrolprøverne, og forskellen mellem den negative kontrol og ANL-mærkede prøver er større. Eliminering af fri IAS efter alkylering er også et vigtigt skridt. Tilstedeværelsen af små mængder IAS under klikreaktionen vil begrænse dens effektivitet. Lejlighedsvis skal afsaltningstrinnet, som også eliminerer IAS (trin 2.6), gentages for at sikre korrekt fjernelse af IAS.

Der er flere biotin-alkyner og -DBCO reagenser kommercielt tilgængelige fra en række virksomheder. De vigtigste forskelle mellem dem vedrører polyethylenglycol (PEG) linkerkædelængden og fraværet, tilstedeværelsen og typen af spaltbare grupper. Uanset hvilken type der anvendes, fører overskydende mængder alkyn til ikke-specifikke klik til proteiner, der kun bærer naturlige aminosyrer. Dette kan let forhindres ved præcis og omhyggelig titrering af alkynmængden. Som beskrevet er den bedste måde at opnå dette på at anvende de faktiske lyserede og alkylerede prøver, der skal anvendes i de efterfølgende proteinrensningstrin (trin 2.6) og massespektrometrianalyse.

Når DST-alkyner anvendes i klikreaktionen, reducerer β-mercaptoethanol disulfidbroen og adskiller de mærkede proteiner fra perlerne i elueringstrinnet (trin 3.3). β-mercaptoethanol skal fjernes fra prøverne for at muliggøre den enzymatiske fordøjelse, der er nødvendig for MS. Der er flere måder at gøre dette på (f.eks. Lyofilisering18, udskæring fra en gel19 eller rengøring ved hjælp af S-Trap-kolonne20), og valget skal træffes af MS-laboratoriet, der behandler prøverne.

Ændringer og fejlfinding af metoden skal rettes mod at optimere de kritiske trin, der er nævnt i protokollen. For eksempel, hvis der er for meget variabilitet, skal du tilføje flere biologiske replikater; hvis mærkningen er for lav, skal du øge ANL-koncentrationen, bruge længere mærkningsperioder eller teste andre ANL-administrationsveje, der kan være mere effektive for det undersøgte væv. For proteinalkylering kunne et tidligere reduktionstrin til tilsætning af IAS implementeres.

Metodens hovedbegrænsning er oprensning af proteomer som følge af småcellepopulationer, selvom et lille vævsområde dissekeres. Proteomer af mere talrige cellepopulationer, der imidlertid er spredt ud over større vævsområder, er også vanskelige at få adgang til. Ikke desto mindre kan den in vivo-mærkningsteknik , der er beskrevet her, stadig anvendes til at vurdere de henviste celletyper ved billeddannelse (f.eks. med FUNCAT eller FUNCAT-PLA21).

Denne metode er i øjeblikket den eneste metode, der er tilgængelig til in vivo-undersøgelse af celletypespecifikke proteomer baseret på proteiner i fuld længde og til in situ-visualisering af celletypespecifikke komplette proteiner. Andre ikke-kanoniske aminosyrer såsom azidohomoalanin (AHA) kan også bruges til in vivo-proteinmærkning og oprensning af proteomer, men mangler cellecelletypespecificitet22,23. Andre tilgange såsom puromycin er egnede til at give et fast billede af proteinsyntese24,25. Ikke desto mindre er det muligt at bruge ikke-kanoniske aminosyrer til længere perioder med mærkning, hvilket også afspejler proteinnedbrydning og viser et mere præcist cellulært proteom. BioID-baserede metoder bruges til at identificere proteiner i specifikke subcellulære regioner, uanset deres øjeblik / syntesested26.

I muselinjen, som vi etablerede (tilgængelig fra Jackson Lab, lager nr. 028071), udtrykkes den mutante methionin tRNA-syntetase (MetRS *), der muliggør inkorporering af ANL i cellerne, på en Cre-afhængig måde. Med denne muselinje som værktøj er det muligt udelukkende at udtrykke MetRS* i celletyper, som Cre-driverlinjer er tilgængelige for. Dette arrangement giver metoden betydelig alsidighed, hvilket gør den nyttig inden for næsten alle områder af biomedicinsk forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

B.A-C finansieres af det spanske ministerium for videnskab og innovation (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), af den selvstyrende region Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) og MICINN (PID2020-113270RA-I00) tilskud. R. A-P er finansieret af den selvstyrende region Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. er finansieret af Max Planck Society, en Advanced Investigator-pris fra Det Europæiske Forskningsråd (bevilling 743216), DFG CRC 1080: Molekylære og cellulære mekanismer af neural homeostase og DFG CRC 902: Molekylære principper for RNA-baseret regulering. Vi takker D.C Dieterich og P. Landgraf for deres tekniske rådgivning og syntesen af DST-Alkyne. Vi takker E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast og MPI's dyrefacilitet for hjerneforskning for deres fremragende støtte. Vi takker Sandra Goebbels for at dele Nex-Cre muselinjen. Vi takker Antonio G. Carroggio for hans hjælp med engelsk redigering. B.A-C. designet, udført og analyseret eksperimenter. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. og S. t. D. udførte og analyserede eksperimenter. B.A-C og E.M.S. designede eksperimenter og overvågede projektet, skrev B.A-C papiret. Alle forfattere redigerede papiret.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Acrylamide gels GenScript SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-Mercaptoethanol Sigma M6250 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood
ANL Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)
ANL-HCl IrishBotech HAA1625.0500
Benzonase Sigma E1014
Biotin alkyne Thermo, B10185
Chicken antibody anti-GFP Aves 1020
Complete EDTA-free protease inhibitor Roche 4693132001 Toxic; use a lab coat and gloves.
Copper (I) bromide Sigma 254185 99.999% (wt/wt)
Disulfide tag (DST)-alkyne Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20
DMSO Sigma 276855
Filters Merk SCGP00525
Iodo acetamide (IAA) Sigma I1149
IR anti chicken 800 LI-COR IRDye 800CW Donkey anti-Chicken Secondary Antibody
IR anti rabit 680 LI-COR IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody
Maltose Sigma M9171
Manual Mixer BioSpec Products 1083
NaCl Sigma S9888
N-ethylmaleimide Sigma 4259 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
NeutrAvidin beads Pierce 29200
Nitrocellulose membrane Bio-rad 1620112
PBS 1X Thermo J62036.K2
PBS 1X pH 7.8 Preparation described in reference number 5
PD SpinTrap G-25 columns GE Healthcare Buffer exchange
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo, 23225 Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.
Polyclonal rabbit anti-biotin antibody Cell Signaling 5597
PVDF membrane Millipore IPVH00010
SDS 10% Sigma 71736
SDS-PAGE  Running buffer MOPS GenScript M00138
SYPRO Ruby stain Sigma S4942
Table automatic Vortexer Eppendorf Mixmate
Triazole ligand Sigma 678937
Triton X-100 Sigma T9284
Water Sigma W4502 Molecular biology grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
  2. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
  3. Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
  4. Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
  5. Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
  6. Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
  7. Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
  8. Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
  9. Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
  10. Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
  11. Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
  12. Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, Clifton, N.J. 199-215 (2015).
  13. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  14. Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
  15. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
  16. Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
  17. van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
  18. O'Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, Clifton, N.J. 309-321 (2004).
  19. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  20. Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
  21. tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
  22. McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
  23. Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
  24. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
  25. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
  26. Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).

Tags

Neurovidenskab udgave 182
Celletypespecifik proteinrensning og identifikation fra komplekse væv ved hjælp af en mutant methionin tRNA-syntetasemuselinje
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nassim-Assir, B., Ouro Corredera,… More

Nassim-Assir, B., Ouro Corredera, D., Alvarez-Pardo, R., tom Dieck, S., Ciirdaeva, E., Schuman, E. M., Alvarez-Castelao, B. Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line. J. Vis. Exp. (182), e63713, doi:10.3791/63713 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter