Name: Die Rollen der physikalischen Kräfte in frühen Küken embryonalen Morphogenese sondieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Entdecken Sie ex-ovo-Experimente zur Untersuchung mechanischer Kräfte bei der frühen Gehirnentwicklung von Hühnerembryonen. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung morphogenetischer Prozesse auf Gewebe- und Organismusebene.

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Z.C. erkennt die Unterstützung von Dartmouth Gründerfonds und Branco Weiss - Gesellschaft für Wissenschaft Gemeinschaft, verwaltet von der ETH Zürich. Die Autoren danken Dr. Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo, sowie Yunfei Shi für hilfreiche Gespräche und die anonyme Gutachter für Kommentare. Dieses Material basiert auf Arbeit, unterstützt von der National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter Grant Nr. DGE-1313911. Jede Meinung, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen ausgedrückt in diesem Material sind diejenigen der Autoren (s) und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten von der National Science Foundation.

1. Vorbereitung des Gewebes Nährmedien
<ol><li>Verwenden Sie eine 0,5 L Flasche von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glukose, Natriumbicarbonat und L-Glutamin als Basis für die Nährmedien.</li>
	<li>Fügen Sie in einem sterilen Laminar-Flow-Haube 10 mL von Antibiotika bis 0,5 L von DMEM hinzu</li>
	<li>Mit einer sterilen Pipette, 50 mL DMEM-Antibiotika-Lösung auf einem sterilen 50 mL konische Rohr übertragen.</li>
	<li>Die restliche DMEM-Antibiotika-Lösung in der 0,5 L Flasche in der sterilen Haube Küken Serum 50 mL hinzufügen.</li>
	<li>Speichern Sie die endgültige Lösung (genannt jenseits Küken Nährmedien [CCM]) in 50 mL konische Rohr Aliquote bei-20 ° C.</li>
</ol>2. Ei Ausbrüten
<ol><li>Verwendung zarte wischt mit 70 % Ethanol befruchteten bestimmten Pathogen-freies weiße Leghorn Hühnereier zu reinigen. Eier in einer longitudinalen Ausrichtung auf Inhaber zu arrangieren.</li>
	<li>Schalten Sie eine eibrutkasten eine Solltemperatur von 37,5 ° C und die Luftfeuchtigkeit bei 48-55 %. Die Luftfeuchtigkeit wird gesteuert, indem man eine entsprechende Menge an Wasser in den Inkubator.</li>
	<li>Brüten Sie die Eier, HH11-13, ca. 40-44 h.</li>
	<li>Lassen Sie die Eier bei Raumtemperatur für ca. 15-30 min vor dem Sprühen/Reinigung mit 70 % Ethanol abkühlen.</li>
</ol>3. ziehen Sie Glaskapillaren
<ol><li>Montieren Sie eine 10 cm lange Glas-Kapillarröhrchen mit einem äußeren Durchmesser von 1,0 mm und einem Innendurchmesser von 0,5 mm auf einer Mikropipette Abzieher.</li>
	<li>Hitze und Parameter bzw. 750 und 400, zu ziehen. Das Kapillarrohr in dünne Nadeln ziehen mit der Taste ziehen.</li>
</ol>(4) Filterpapier Carrier Methode
<ol><li>Schneiden Sie die Kreise von ca. 3 cm Durchmesser aus Filterpapier.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Rechteck etwa 1 cm x 2 cm aus dem Kreis mit einem Loch-Puncher. Achten Sie darauf, entfernen alle hervorstehenden oder scharfe Ecken.</li>
</ol>5. Embryo Ernte und Vorbereitung
<ol><li>Eier von unten, ziehen Sie die Schale vorsichtig auseinander und Zahlen Sie Inhalt sorgfältig auf eine 150 x 15 mm Petrischale ein. Um sicherzustellen, dass der Embryo-Seite nach oben zeigt, halten Sie die Eier in der gleichen Ausrichtung, die sie beim knacken sie inkubiert wurden.</li>
	<li>Entfernen Sie die dünnen Albumin mit einer Einweg-Pasteurpipette.</li>
	<li>Trennen Sie die dicken Albumin aus dem Dotter mit stumpfen Pinzette endete. Sicherstellen Sie, dass die dicken Albumin durch kratzen leicht oben auf das Eigelb mit der stumpfen endete Pinzette entfernt wurde.</li>
	<li>Verwenden Sie feine Spitzen Pinzette zu zentrieren und legen einen Filterpapier Ring über dem Embryo, Abgleich der Längsachse des Ringes mit der Längsachse des Embryos.</li>
	<li>Schneiden Sie das Eigelb, die rund um das Filterpapier-Ring mit einer Schere.</li>
	<li>Ziehen Sie den Ring und Embryo aus dem Eigelb in eine schräge Richtung der Website wo das Eigelb zuerst geschnitten wurde.</li>
	<li>Spülen Sie die Embryonen in zwei sequentielle 100-mm-Gerichte mit Raumtemperatur 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Legen Sie einen Filterpapier Ring in einer 35-mm-Petrischale zunächst. Dann stellen Sie die Embryo dorsale Seite nach oben auf das Filterpapier bereits in 35-mm-Petrischale.</li>
	<li>Legen Sie einen Edelstahl-Ring auf das Filterpapier Sandwich. Achten Sie darauf, nicht den Embryo schädigen.</li>
	<li>Jede Petrischale 3 mL der vorbereiteten CCM hinzufügen.</li>
	<li>Entfernen Sie die VM von jedem Embryo durch leicht überfliegen die gezogene Kapillare Nadel am oberen Rand der Embryo und peeling entfernt die VM, ab dem vorderen Ende (rechts oben das Vorderhirn) und Sie fortfahren, um die Chorda (Abbildung 1A).</li>
	<li>Legen Sie acht 35 mm Petrischalen in einer 150 mm-Gericht, das mit Wasser gesättigt heikle Aufgabe Tücher (um die Feuchtigkeit zu erhalten) ausgekleidet war.</li>
	<li>Ort der 150-mm-Petrischale in einem verschließbaren Plastikbeutel füllen Sie den Beutel mit einem Gasgemisch, bestehend aus 95 % O2 und 5 % CO2.</li>
	<li>Den Beutel und legen Sie es in einem Inkubator 37,5 ° C.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Embryonen für weitere 27 h bis HH15-HH16 (Abbildung 1 b).</li>
</ol>(6) induzieren Oberflächenspannung
<ol><li>Entfernen Sie die Embryonen aus dem Inkubator und verwenden Sie eine optische Kohärenz Tomographie (OCT) System, um sie Bild. Verwendung OCT Verdrehwinkel des Neuralrohrs (NT) (Abbildung 2) zu bestimmen.</li>
	<li>Transfer der Embryonen zu einem Lichtmikroskop und visualisieren Sie bei 10-facher Vergrößerung. Verwenden Sie eine 200 Mikroliter-Pipette, um inkrementell 0,2 mL von Medien aus der Petrischale zu entfernen.</li>
	<li>Nehmen Sie Hellfeld Bilder bei jedem Intervall, die Auswirkungen der Medien-Luftschnittstelle auf den Embryo zu beobachten.</li>
	<li>Medien zu entfernen, bis die Oberflächenspannung in den Embryo Torsion (Abbildung 1) induziert.</li>
	<li>Bild des Embryos mit dem OCT-System wieder herstellen einer endgültigen Verdrehwinkel zum Vergleich, Embryonen zu kontrollieren.  Hinweis: Die Bright-Field-Bilder wurden mit einem sezierenden Mikroskop erworben. Eine optische Kohärenz Tomographie System mit einem angehängten Mikroskop wurde verwendet, um Cross-Sectional Bild Stapel von live Embryonen zu erwerben. Bilder waren in einer 3 x 10 x 3 mm3 Scan Domäne erhalten, dann in eine imaging-Software verarbeitet. Zu guter Letzt wurden die physikalischen modelbilder mit einer digitalen Spiegelreflexkamera aufgenommen.</li>
</ol>(7) physikalische Modellierung der Oberflächenspannung/VM Kräfte
<ol><li>Entwickeln Sie eine vereinfachte 3D Geometrie, die einen Embryo zwischen HH14-17 in kommerziellen Modellierungssoftware (Abbildung 3A) ähnelt.</li>
	<li>Die Negativform der 3D-Geometrie in kommerziellen 3D Computer-Grafik-Software zu entwerfen.</li>
	<li>Verwendung ein 3D-Druckers mit 1,75 mm Acrylnitril Butadien Styrol Filament zu 3D geladen Drucken die Form, in köraform (STL) Format.</li>
	<li>Um die Form gegossen, mischen Sie Silikon-Kautschuk-Elastomer-Komponenten A und B zu gleichen Teilen und Gießen Sie die Mischung in die Form sofort; Legen Sie die Gussform, bei Raumtemperatur für 12 h (Abb. 3 b) zu heilen.</li>
	<li>Markieren Sie das physikalische Modell des Embryos entlang der NT an der dorsalen Seite Torsion zu visualisieren.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Deckglas Replizieren der Krafteinwirkung auf das physische 3D-Modell der VM oder Oberflächenspannung (Abbildung 3D) nachahmt.</li>
	<li>Legen Sie eine Reihe von starren Drähte gleichlang auf die Seite des physikalischen Modells. Nachdem das Deckglas eine externe Kraft auf das Gehirn Modell ausübt, werden die Drähte in einem Winkel geneigt, die von der Lage abhängt. Bestimmen Sie den Drehwinkel von Arctan die projizierte Länge über die ursprüngliche Länge jedes Drahtes (Abbildung 3E).</li>
</ol>8. ändern die Richtung der Herz-Schleife
<ol><li>Folgen Sie den Schritten in 3.1 und 3.2, zog Kapillarrohr zu erhalten.</li>
	<li>Folgen Sie den Schritten in 5.1 durch 5.10 Embryos vorzubereiten.</li>
	<li>Verwenden Sie ein paar der Zange, um das Filterpapier zu kippen, so dass der Embryo Ventral-Side-Up wird.</li>
	<li>Verwenden Sie zog Kapillarrohr einen Schlitz in der Splanchnopleure (SPL) Membran aufzuschneiden.</li>
	<li>Verwenden Sie das Kapillarrohr, um eine mechanische Kraft, das Herz von der rechten Seite auf die linke Seite schieben.</li>
	<li>Folgen Sie den Schritten in 5.12 durch 5.15, die Veränderung der Torsion zu beobachten.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Während physikalische Phänomene eine wesentliche Rolle in Morphogenese26,27,28,29,30, die spezifischen mechanische Mechanismen sowie die Koordination von mechanischen spielen und Molekulare Mechanismen bleiben weitgehend unerforscht. Es ist bekannt, dass die ventrale Biegung und rechts Torsion des primitiven Gehirns sind zwei zentrale Prozesse, die zur frühen ...

Modernen Entwicklungsbiologie Forschung konzentriert sich weitgehend auf Verständnis Entwicklung aus der Perspektive der Molekulargenetik1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. es ist bekannt, dass physikalische Phänomene eine zentrale Rolle in der Morphogenese spielen oder die Generation von biologischen14,15,16,17 bilden; spezielle mechanische Mechanismen der Entwicklung bleiben jedoch weitgehend unerforschte. 19,20ändern ventrale Biegung und rechts Torsion des primitiven Gehirn Rohres nach dem Hamburger-Hamilton Stufe 11 (HH 11)18 sind die zwei wichtigsten Prozesse, die embryonale Form beitragen. Insbesondere bleibt der physikalische Mechanismus zugrunde liegt die Torsionssteifigkeit Entwicklung im embryonalen Gehirn unvollständig verstanden.
Die embryonale Torsion Küken Embryos gehört zu den frühesten morphogenetischen Ereignissen des Links-Rechts (L-R) Asymmetrie in der Entwicklung. Wenn der Prozess der L-R Asymmetrie gestört ist, treten Geburtsschäden wie Situs Inversus, Isomerieoder Heterotaxie 21. Hier präsentieren wir ein Protokoll verbindet Ex Ovo Experimente22,23 mit physical-Modeling, mechanische Kräfte während der frühen Entwicklung des embryonalen Gehirns zu charakterisieren. Vorgestellte Methode soll die mechanischen Kräfte verantwortlich für Gehirn Torsion und die Faktoren, die Einfluss auf den Grad der Torsion während der frühen Entwicklung12zu identifizieren. Basierend auf den experimentellen Beobachtung, dass die dotterhäutchen Membran (VM) die dorsale Seite des Embryos einschränkt, vermutet wir, dass die VM liefert die Kraft für das sich entwickelnde Gehirn Torsion unabdingbar. Daher bei dieser Methode entfernt wir den Teil des virtuellen Computers, der den Bereich des Gehirns um herauszufinden, die Auswirkungen auf Gehirn Torsion abdeckt. Darüber hinaus wurde die Methode zur Anwendung von flüssigen Oberflächenspannung zur mechanischen Rolle des virtuellen Computers zu bestätigen und eine Schätzung von der Kraftaufwand für Gehirn Torsion, die zuvor nicht getan haben. Messung der Kräfte während der embryonalen Morphogenese ist eine anspruchsvolle Aufgabe. Vor allem in einer bahnbrechenden Studie entwickelt Campàs und Mitarbeiter24 eine neuartige Methode zur Quantifizierung der zellulären betont mit eingespritzten Microdroplets. Dennoch war diese Methode beschränkt sich auf Kräfte auf zellulärer Ebene, daher gilt nicht für Kräfte auf Gewebe oder Organismus-Ebene Sonde messen. Das Protokoll in diesem Papier präsentiert wurde entwickelt, um diese Lücke teilweise zu füllen.

<table><tbody><tr><td>Befruchtet Spezifisch pathogenfrei Weiße Leghorn Hühnereier</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optisches kohärentes Tomographiemikroskop</td><td>Thorlabs</td><td>GAN220C1</td><td></td></tr><tr><td>Silikonelastomer</td><td>Smooth-On, Inc.</td><td>EcoFlex 00-50</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotika</td><td>Sigma</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>Kükenserum</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>Modell P-30</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>5202-110</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Comsol MultiPhysics</td><td>Comsol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D-Computergrafiksoftware</td><td>Rhino 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop mit OCT</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>Digitale Spiegelreflexkamera</td><td>EOS</td><td>Rebel T3i</td><td></td></tr></tbody></table>

die rollen der physikalischen kräfte in frühen küken embryonalen morphogenese sondieren

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

Embryonalentwicklung ist traditionell aus der Perspektive der biomolekularen Genetik studiert, aber die grundlegende Bedeutung der Mechanik in Morphogenese wird zunehmend anerkannt zu werden. Insbesondere die embryonalen Küken Herz und Hirn-Schlauch, der morphologische Veränderungen unterziehen, wie sie sich entwickeln, gehören zu den Hauptkandidaten zur Untersuchung der Rolle von physikalischen Kräfte in Morphogenese. Progressive ventrale biegen und rechts Torsion des Gehirns rohrförmige embryonale Küken passieren in der frühesten Phase der ORGANEBENE links-rechts-Asymmetrie in Küken Embryonalentwicklung. Die dotterhäutchen Membran (VM) schränkt die dorsale Seite des Embryos und hat dabei die Kraft für das sich entwickelnde Gehirn Torsion unabdingbar in Verbindung gebracht. Hier präsentieren wir Ihnen eine Kombination aus neuen Ex-Ovo -Experimente und physikalische Modellierung, um die Mechanik des Gehirns Torsion zu identifizieren. Hamburger-Hamilton Zeitpunkt 11, Embryonen werden geerntet und kultivierten ex Ovo (in den Medien). Die VM ist anschließend mit einer gezogenen Kapillarrohr entfernt. Durch die Steuerung des Niveau der Flüssigkeit und den Embryo eine Flüssigkeit-Luftschnittstelle zu unterwerfen, kann die Flüssigkeit Oberflächenspannung der Medien, die mechanische Rolle des virtuellen Computers zu ersetzen verwendet werden. Mikrochirurgie Experimente wurden auch durchgeführt, um die Position des Herzens die resultierende Änderung in die Chiralität des Gehirns Torsion zu verändern. Ergebnisse aus diesem Protokoll veranschaulichen die grundlegenden Aufgaben der Mechanik in Morphogenese fahren.

In dieser Studie wurde die VM des Embryos bei HH11 an der thorakalen Biegung vom vorderen Ende entfernt. Die Embryonen wurden durch ein OCT-System abgebildet. In diesem Stadium ist die Torsion des Gehirns Rohr (Abbildung 1A) nicht gestartet. Nach HH15-16 inkubiert werden, stellte Embryonen mit ihrer VM entfernt reduzierte Gehirn Rohr Torsion, ca. 35 Grad (Abbildung 1 b) im Vergleich zur Steuerung von Embryonen, die Torsion von ru...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll eine Reihe von neuen Ex-Ovo -Experimente und physical-Modeling-Ansätze für das Studium der Mechanik der Morphogenese während frühen Küken embryonalen Gehirn Torsion.

Die Rollen der physikalischen Kräfte in frühen Küken embryonalen Morphogenese sondieren

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls ist es, die Rolle mechanischer Kräfte bei der frühen embryonalen Gehirnentwicklung durch Ex-Ovo-Experimente zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Entwicklungsbiologie und Biomechanik zu beantworten, wie z.B. die Rolle mechanischer Signale bei der Morphogenese, also der Erzeugung biologischer Formen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Charakterisierung der Rolle mechanischer Kräfte bei der Morphogenese auf Gewebe- und Organismusebene ermöglicht.Um diesen Vorgang zu starten, verwenden Sie feine Tücher mit 70 % Ethanol, um die befruchteten spezifisch pathogenfreien weißen Leghorn-Hühnereier zu reinigen. Ordnen Sie dann die Eier in Längsrichtung auf einem Halter an. Stellen Sie danach den Eierbrutkasten auf eine Zieltemperatur von 37,5 Grad Celsius ein und halten Sie die Luftfeuchtigkeit bei 48 bis 55 %Die Luftfeuchtigkeit wird durch Zugabe einer angemessenen Menge Wasser in den Inkubator kontrolliert.Inkubieren Sie die Eier etwa 40 bis 44 Stunden lang auf HH11 bis 13. Lassen Sie die Eier anschließend ca. 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie sie mit 70 % Ethanol reinigen. In diesem Schritt schlagen Sie die Eier von unten auf, ziehen die Schale vorsichtig auseinander und geben den Inhalt vorsichtig in eine 150 x 15 Millimeter große Petrischale.Um sicherzustellen, dass die Embryonenseite nach oben zeigt, halten Sie die Eizellen beim Aufschlagen in der gleichen Ausrichtung, wie sie bebrütet wurden. Entfernen Sie das dünne Albumin mit einer Einweg-Pasteurpipette. Trenne das dicke Albumin mit der stumpfen Pinzette vom Eigelb.Stellen Sie sicher, dass das dicke Albumin entfernt wurde, indem Sie die Oberseite des Eigelbs leicht abkratzen. Legen Sie dann mit einer Pinzette mit feiner Spitze einen Filterpapierring über den Embryo und zentrieren Sie ihn, indem Sie die Längsachse des Rings mit der Längsachse des Embryos abgleichen. Schneiden Sie anschließend das Eigelb, das den Filterpapierring umgibt, mit einer Schere ab.Ziehen Sie anschließend den Ring und den Embryo vom Eigelb in schräger Richtung zu der Stelle, an der das Eigelb zuerst geschnitten wurde. Spülen Sie den Embryo dann in zwei aufeinanderfolgenden 100-Millimeter-Schalen mit PBS bei Raumtemperatur. Legen Sie als Nächstes einen Filterpapierring in eine 35-Millimeter-Petrischale.Legen Sie den Embryo mit der Rückenseite nach oben auf das andere Filterpapier in der 35-Millimeter-Petrischale. Legen Sie danach einen Edelstahlring auf das Filterpapiersandwich. Achten Sie darauf, den Embryo nicht zu beschädigen.Geben Sie nun drei Milliliter des zuvor zubereiteten CCM in jede Petrischale. Entfernen Sie die Vitellinmembran jedes Embryos, indem Sie mit der gezogenen Kapillarnadel leicht über die Oberseite des Embryos streichen. Schälen Sie dann die Vitellinmembran ab, beginnend am vorderen Ende und weiter bis zur Chorda.Legen Sie anschließend acht 35-Millimeter-Petrischalen in eine 150-Millimeter-Schale, die mit wassergetränkten Tüchern ausgelegt ist, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Legen Sie dann die 150-Millimeter-Petrischale in einen verschließbaren Plastikbeutel und füllen Sie den Beutel mit einem Gasgemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % CO2. Verschließen Sie den Beutel und legen Sie ihn in einen 37,5 Grad Celsius heißen Inkubator.Nehmen Sie nun den Embryo aus dem Inkubator und verwenden Sie ein OCT-System, um ihn abzubilden und den Torsionswinkel des Neuralrohrs zu bestimmen. Übertragen Sie die Embryonen in ein Lichtmikroskop und visualisieren Sie sie mit 10-facher Vergrößerung. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um schrittweise 0,2 Milliliter des Mediums aus der Petrischale zu entfernen.Nehmen Sie nach jeder Runde der Medienentfernung Hellfeldbilder auf, um die Wirkung der Medien-Luft-Grenzfläche auf den Embryo zu beobachten. Fahren Sie mit der Entfernung des Mediums fort, bis die Oberflächenspannung über dem Embryo eine Torsion auslöst. Stellen Sie sich den Embryo erneut mit dem OCT-System vor, um einen endgültigen Torsionswinkel für den Vergleich zur Kontrolle der Embryonen zu ermitteln.Um die Richtung der Herzschlinge zu ändern, drehen Sie das Filterpapier mit einer Pinzette um, so dass der Embryo mit der Bauchseite nach oben zeigt. Dann schneidest du mit dem gezogenen Kapillarrohr einen Schlitz in die Splanchnopleure Membran auf und übst eine mechanische Kraft aus, um das Herz von der rechten auf die linke Seite zu drücken. Wenden Sie die flüssige Oberflächenspannung an, um das Herz auf der linkshändigen Seite zu halten.Inkubieren Sie den Embryo dann für weitere 20 Stunden, um die Veränderung der Chiralität der Torsion zu sehen. Hier ist ein entnommener Embryo zu sehen, bei dem die VM bei HH11 entfernt wurde. Derselbe Embryo wurde nach der VM-Entnahme 27 Stunden lang inkubiert und zeigte eine verminderte Torsion.Hier ist derselbe Embryo, der unter Anwendung von Oberflächenspannung des Fluids eine Hirntorsion erfuhr, und hier ist der Kontrollembryo mit normaler Hirntorsion in einem vergleichbaren Stadium. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, darauf zu achten, dass der Embryo nicht beschädigt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Finite-Elemente-Analyse durchgeführt werden, um rechnerisch zu modellieren, wie physikalische Kräfte die Morphologie beeinflussen können.Daher ebnete diese hier entwickelte Technik den Weg für zukünftige Studien zur Mechanik der Morphogenese in Hühnerembryonen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie man Hühnerembryonen für die In-vitro-Kultur entnimmt, die Vitellinmembran mikrochirurgisch entfernt, die von der Vitellinmembran bereitgestellte Kraft rekapituliert und die Embryonalmorphologie durch OCT und Hellfeldbildgebung überwacht.

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Forschung

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Biotechnik

Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

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Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo

Durch das Pfropfen von Kügelchen, die mit Wachstumsfaktoren oder spezifischen Inhibitoren von Signalwegen getränkt sind, in sich entwickelnde Embryonen ist es möglich, ihre Wirkung direkt in vivo zu testen. Bei diesem Protokoll werden Kügelchen in die Knospe der Gliedmaßen transplantiert, um die Auswirkungen dieser Moleküle auf die Genexpression und Signaltransduktion zu bestimmen.

Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Protokolle, die undurchlässige Barrieren verwenden, um Induktionsereignisse zwischen Geweben der Hauptkörperachse und der Flanke im Hühnerembryo zu blockieren, die für die Gliedmaßenbildung erforderlich sind, werden beschrieben. Kügelchen, die mit induktiven Signalkandidaten getränkt sind, werden verwendet, um den Effekt der Barriereplatzierung zu überwinden, und die Analyse der Genexpression bestätigt dies.

Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

Das Fehlen von Instrumenten zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo verhindert Validierung ihrer Rolle während der Entwicklung. Wir beschäftigten Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Nanopartikel-Tracking, mechanische Eigenschaften auf die intakte Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Diese Methoden sind zuverlässig und vielseitig einsetzbar, aufdringliche Interventionen zu vermeiden.

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Wir präsentieren Ihnen eine Setup der optischen Pinzette gekoppelt mit einem leichten Bogen Mikroskop und deren Umsetzung, Zelle Mechanik ohne Perlen in Drosophila Embryos zu erforschen.

Prüfende Zelle Mechanik mit Wulst-freie optische Pinzetten in Drosophila Embryos

Rekombinante Gliedmaßen sind ein leistungsfähiges experimentelles Modell, das es ermöglicht, den Prozess der Zelldifferenzierung und die Erzeugung von Mustern unter dem Einfluss embryonaler Signale zu untersuchen. Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung rekombinanter Gliedmaßen mit Mesodermalzellen von Hühnergliedmaßen vor, die an andere Zelltypen angepasst werden können, die aus verschiedenen Organismen gewonnen werden.

Chicken Recombinant Limbs Assay, um Morphogenese, Musterung und frühe Schritte in der Zelldifferenzierung zu verstehen

Der durchnässte Perlenassay beinhaltet die gezielte Abgabe von Testreagenzien zu jedem Entwicklungszeitpunkt, um die Regulation der Zelldifferenzierung und Morphogenese zu untersuchen. Es wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das auf jedes Versuchstiermodell anwendbar ist, um drei verschiedene Arten von getränkten Perlen herzustellen und diese in die Zwischenziffer eines Hühnerembryos zu implantieren.

Analyse der Zelldifferenzierung, Morphogenese und Musterung während der Hühnerembryogenese mit dem Soaked-Bead-Assay

Hier beschreiben wir Protokolle für drei Arten von embryonalen Hautexplantatkulturen von Vögeln, die zur Untersuchung von Gewebeinteraktionen, 4D-Bildgebungs-Zeitrafferfilmen (3D plus Zeit), globalen oder lokalen Störungen der molekularen Funktion und systembiologischer Charakterisierung verwendet werden können.

Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die mechanischen Eigenschaften des Neuralplattengewebes während der Neurulation des Hühnerembryos im Längsschnitt zu überwachen. Es basiert auf der Integration eines Brillouin-Mikroskops und eines Inkubationssystems auf der Bühne und ermöglicht die mechanische Live-Bildgebung von Neuralplattengewebe in Ex-Ovo-kultivierten Kükenembryonen.

Überwachung der mechanischen Entwicklung von Gewebe während des Neuralrohrverschlusses des Kükenembryos

Entdecken Sie ex-ovo-Experimente zur Untersuchung mechanischer Kräfte bei der frühen Gehirnentwicklung von Hühnerembryonen. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung morphogenetischer Prozesse auf Gewebe- und Organismusebene.

Die Rollen der physikalischen Kräfte in frühen Küken embryonalen Morphogenese sondieren

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