Die Rollen der physikalischen Kräfte in frühen Küken embryonalen Morphogenese sondieren

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls ist es, die Rolle mechanischer Kräfte bei der frühen embryonalen Gehirnentwicklung durch Ex-Ovo-Experimente zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Entwicklungsbiologie und Biomechanik zu beantworten, wie z.B. die Rolle mechanischer Signale bei der Morphogenese, also der Erzeugung biologischer Formen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Charakterisierung der Rolle mechanischer Kräfte bei der Morphogenese auf Gewebe- und Organismusebene ermöglicht.

Um diesen Vorgang zu starten, verwenden Sie feine Tücher mit 70 % Ethanol, um die befruchteten spezifisch pathogenfreien weißen Leghorn-Hühnereier zu reinigen. Ordnen Sie dann die Eier in Längsrichtung auf einem Halter an. Stellen Sie danach den Eierbrutkasten auf eine Zieltemperatur von 37,5 Grad Celsius ein und halten Sie die Luftfeuchtigkeit bei 48 bis 55 %Die Luftfeuchtigkeit wird durch Zugabe einer angemessenen Menge Wasser in den Inkubator kontrolliert.

Inkubieren Sie die Eier etwa 40 bis 44 Stunden lang auf HH11 bis 13. Lassen Sie die Eier anschließend ca. 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie sie mit 70 % Ethanol reinigen. In diesem Schritt schlagen Sie die Eier von unten auf, ziehen die Schale vorsichtig auseinander und geben den Inhalt vorsichtig in eine 150 x 15 Millimeter große Petrischale.

Um sicherzustellen, dass die Embryonenseite nach oben zeigt, halten Sie die Eizellen beim Aufschlagen in der gleichen Ausrichtung, wie sie bebrütet wurden. Entfernen Sie das dünne Albumin mit einer Einweg-Pasteurpipette. Trenne das dicke Albumin mit der stumpfen Pinzette vom Eigelb.

Stellen Sie sicher, dass das dicke Albumin entfernt wurde, indem Sie die Oberseite des Eigelbs leicht abkratzen. Legen Sie dann mit einer Pinzette mit feiner Spitze einen Filterpapierring über den Embryo und zentrieren Sie ihn, indem Sie die Längsachse des Rings mit der Längsachse des Embryos abgleichen. Schneiden Sie anschließend das Eigelb, das den Filterpapierring umgibt, mit einer Schere ab.

Ziehen Sie anschließend den Ring und den Embryo vom Eigelb in schräger Richtung zu der Stelle, an der das Eigelb zuerst geschnitten wurde. Spülen Sie den Embryo dann in zwei aufeinanderfolgenden 100-Millimeter-Schalen mit PBS bei Raumtemperatur. Legen Sie als Nächstes einen Filterpapierring in eine 35-Millimeter-Petrischale.

Legen Sie den Embryo mit der Rückenseite nach oben auf das andere Filterpapier in der 35-Millimeter-Petrischale. Legen Sie danach einen Edelstahlring auf das Filterpapiersandwich. Achten Sie darauf, den Embryo nicht zu beschädigen.

Geben Sie nun drei Milliliter des zuvor zubereiteten CCM in jede Petrischale. Entfernen Sie die Vitellinmembran jedes Embryos, indem Sie mit der gezogenen Kapillarnadel leicht über die Oberseite des Embryos streichen. Schälen Sie dann die Vitellinmembran ab, beginnend am vorderen Ende und weiter bis zur Chorda.

Legen Sie anschließend acht 35-Millimeter-Petrischalen in eine 150-Millimeter-Schale, die mit wassergetränkten Tüchern ausgelegt ist, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Legen Sie dann die 150-Millimeter-Petrischale in einen verschließbaren Plastikbeutel und füllen Sie den Beutel mit einem Gasgemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % CO2. Verschließen Sie den Beutel und legen Sie ihn in einen 37,5 Grad Celsius heißen Inkubator.

Nehmen Sie nun den Embryo aus dem Inkubator und verwenden Sie ein OCT-System, um ihn abzubilden und den Torsionswinkel des Neuralrohrs zu bestimmen. Übertragen Sie die Embryonen in ein Lichtmikroskop und visualisieren Sie sie mit 10-facher Vergrößerung. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um schrittweise 0,2 Milliliter des Mediums aus der Petrischale zu entfernen.

Nehmen Sie nach jeder Runde der Medienentfernung Hellfeldbilder auf, um die Wirkung der Medien-Luft-Grenzfläche auf den Embryo zu beobachten. Fahren Sie mit der Entfernung des Mediums fort, bis die Oberflächenspannung über dem Embryo eine Torsion auslöst. Stellen Sie sich den Embryo erneut mit dem OCT-System vor, um einen endgültigen Torsionswinkel für den Vergleich zur Kontrolle der Embryonen zu ermitteln.

Um die Richtung der Herzschlinge zu ändern, drehen Sie das Filterpapier mit einer Pinzette um, so dass der Embryo mit der Bauchseite nach oben zeigt. Dann schneidest du mit dem gezogenen Kapillarrohr einen Schlitz in die Splanchnopleure Membran auf und übst eine mechanische Kraft aus, um das Herz von der rechten auf die linke Seite zu drücken. Wenden Sie die flüssige Oberflächenspannung an, um das Herz auf der linkshändigen Seite zu halten.

Inkubieren Sie den Embryo dann für weitere 20 Stunden, um die Veränderung der Chiralität der Torsion zu sehen. Hier ist ein entnommener Embryo zu sehen, bei dem die VM bei HH11 entfernt wurde. Derselbe Embryo wurde nach der VM-Entnahme 27 Stunden lang inkubiert und zeigte eine verminderte Torsion.

Hier ist derselbe Embryo, der unter Anwendung von Oberflächenspannung des Fluids eine Hirntorsion erfuhr, und hier ist der Kontrollembryo mit normaler Hirntorsion in einem vergleichbaren Stadium. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, darauf zu achten, dass der Embryo nicht beschädigt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Finite-Elemente-Analyse durchgeführt werden, um rechnerisch zu modellieren, wie physikalische Kräfte die Morphologie beeinflussen können.

Daher ebnete diese hier entwickelte Technik den Weg für zukünftige Studien zur Mechanik der Morphogenese in Hühnerembryonen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie man Hühnerembryonen für die In-vitro-Kultur entnimmt, die Vitellinmembran mikrochirurgisch entfernt, die von der Vitellinmembran bereitgestellte Kraft rekapituliert und die Embryonalmorphologie durch OCT und Hellfeldbildgebung überwacht.