Abstract
Определение механизма действия биологически активных химических веществ, представляет интерес для широкого круга ученых, фармацевтической и промышленных учреждений. Saccharomyces Cerevisiae или почкованием дрожжи, является модель эукариот, для которых полная коллекция ~ 6000 делеции гена мутантов и Гипоморфные основного гена мутанты являются коммерчески доступными. Эти сборники мутантов может быть использован для систематического выявления химико-гена взаимодействий, т.е. гены, необходимые, чтобы переносить химического вещества. Эта информация, в свою очередь, сообщает о вероятном механизме действия этого соединения. Здесь мы опишем протокол для быстрой идентификации химико-генетических взаимодействий у почкующихся дрожжей. Показано, метод с использованием химиотерапевтического агента 5-фторурацил (5-FU), который имеет четко определенный механизм действия. Наши результаты показывают, что ядерная TRAMP РНК экзосома и ферментов репарации ДНК необходимы для пролиферации в присутствии 5-ФУ, который согласуется с предыдущими мicroarray штрих-кодированием химические генетические подходы и знания, что 5-FU негативно влияет как на РНК и ДНК обмен веществ. Необходимые протоколы проверки этих экранов с высокой пропускной способностью, также описаны.
Introduction
Генетические инструменты и доступные в модельной организма Saccharomyces Cerevisiae ресурсы позволили масштабные функциональной геномики исследований, которые в совокупности обеспечивают новое понимание того, как гены функционируют как сети для выполнения требований биологических систем. Краеугольным камнем этих инструментов была совместная создание полного набора незаменимых генов удалений всех открытых рамок считывания в дрожжах 1,2. Поразительным наблюдением было то, что только ~ 20% генов дрожжей, необходимые для жизнеспособности при выращивании в гаплоидов в стандартных лабораторных условиях. Это подчеркивает способность клетки к буфера против геномных возмущений за счет использования альтернативных биологических путей. Генетические мутанты, которые являются жизнеспособными индивидуально, но смертельным в сочетании сигнала, подключенных или конвергентные параллельных биологические пути и создавать сети генетического взаимодействия, которые описывают биологическую функцию. С развитием условного Теmperature-чувствительные и гипоморфные аллели важных генов технология не ограничивается изучением несущественных генов 3,4. Эта концепция была применена в геномной шкале производить объективную карту генетического взаимодействия, иллюстрирующий, как гены, участвующие в подобных клеточных процессов кластер вместе 5.
Химические возмущения генных сетей мимические генов делеции (Рисунок 1) 6. Запрос ингибирующее рост соединений против высокой плотности множества штаммов удалений гиперчувствительности идентифицирует профиль химико-генетического взаимодействия, т.е. список генов, которые требуется переносить химическую нагрузку. Как генетических взаимодействий, крупномасштабные экраны химических библиотек, показали, что соединения с аналогичной способ действия кластера вместе 7. Таким образом, путем создания химико-генетический профиль взаимодействие соединения механизм действия, могут быть установлены путем сравнения его с LARGE масштаб синтетический генетических и химических генетического взаимодействия наборы данных 8,9.
Крупномасштабные химико-генетический экраны, где множество соединений, опрошенные, были выполнены конкуренции штрих-код анализов. При таком подходе Объединенные коллекции штаммов с делецией выращивают в массе в течение нескольких поколений в небольшом объеме среды, содержащей химическое вещество. Поскольку каждый мутант с делецией таит в себе уникальную генетическую штрих-код, жизнеспособность / рост отдельных мутантов в бассейне штаммов удаление отслеживается микрочипов или высокой пропускной последовательности 10.
Выведение пригодность мониторинга размеры колоний физически Arrayed мутантов, выращенных на агара, содержащего биологически активного соединения также эффективный метод, чтобы идентифицировать химические-генетических взаимодействий 11,12. Такой подход обеспечивает экономичную альтернативу к конкурсу на основе отбора и хорошо подходит для опробования небольших библиотек химических веществ.Изложенные здесь просто методология составления перечня химико-генетических взаимодействий в S. Cerevisiae, что не зависит от молекулярной биологии манипуляции или инфраструктуры. Она требует лишь сбор дрожжей удаление, робота или вручную фиксации в аппарат, и свободно доступного программного обеспечения для анализа изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Общая схема этой процедуры указаны на рисунке 2.
1. Определение ингибирующее рост дозы
- Подготовка дрожжей ночной культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: дрожжи-экстракт-пептон-декстроза рост массовой информации (YEPD) используется в данном протоколе является стандартным рецептом 13.- Серия из BY4741 (Мата his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) клеток на YEPD агаром и инкубировать в течение 48 ч при 30 ° С или до видимые колонии образуют.
- Подготовка ночных культур путем инокуляции 5 мл жидкой среды YEPD в стерильной культуральной судна с одной колонии. Инкубируют в течение ночи при 30 ° C при непрерывном вращении или встряхивании. Культура, как правило, достигают насыщения к утру (~ 2 × 10 8 клеток / мл).
- Твердый препарат агаровых средах, содержащих различные химические дозы
- Подготовка несколько запасыхимический быть испытана на 100x желаемой конечной концентрации в соответствующем растворителе.
Примечание: Эффективные концентрации будет зависеть от химических, и должно быть определено эмпирически. Поэтому желательно, чтобы сначала проверить широкий спектр конечная концентрация, то есть от низкой мкМ до высокой мМ. - Для каждой концентрации химических, подлежащих испытанию, аликвоту 3 мл расплавленного агара YEPD к нескольким стерильной культуральной трубки. Место в C водяной бане 55 °, чтобы не укрепляя.
- Для каждой концентрации химических веществ, подлежащих испытания добавить 30 мкл 100x соединения расплавленных сред, вихревых 2-3 сек для смешивания и пипетки 1 мл в каждой паре одинаковых скважин в 12-луночного планшета. Не забудьте включить в транспортное средство только контроль. Разрешить пластин для установки в течение ночи при комнатной температуре. Откажитесь от любого дополнительного средства массовой информации.
- Подготовка несколько запасыхимический быть испытана на 100x желаемой конечной концентрации в соответствующем растворителе.
- Распространение покрытие клетки
- Привить 10 мл жидких сред YEPD с 2 мкл насыщенного дрожжевой культуры, выращивали в течение ночи, как в шаге 1.1.2.
- Пластина 25 мкл разведенной культуры дрожжей в хорошо и равномерно распределяется с помощью стерильных стеклянных шариков или стержень, и позволяют пластины для сушки под огня. Инкубируют планшет при 30 ° С в течение 48 ч.
- Оценка рост дрожжей (общее количество и размер колоний) на пластины. Выбор сублетальный концентрацию соединения, которая не ингибирует рост, больше, чем 10% -15% для выполнения экрана.
2. Систематическое Химическая генетический скрининг
- Обслуживание удаления мутантных массива (DMA) и Подготовка источника плиты
- Для более подробного описания по строительству на удаление массивов мутантных из запасов глицерина, пожалуйста, обратитесь к Барышникова и др. 14. После того, как мутанты с делецией были выстроены при плотности 384 колоний на чашку, DMA могут быть сохранены в течение нескольких месяцев при 4 ° С. Репликация на YEPD агар, содержащий 200 мкг / мл G418, который необходим для предотвращения колонии от выращивания другвсе остальные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько последовательных репликаций следует избегать, чтобы предотвратить потерю медленно растущих штаммов и свести к минимуму появление супрессоров мутантов. Это особенно актуально, если сохранение коллекции, как гаплоидов. - Выполните все шаги реплик обшивки с помощью микробного выстроив роботизированной системы. Кроме того, управлять одел колонии с помощью ручного инструмента пиннинга.
Примечание: В сборник дрожжевого удаление доступен как гаплоидов и диплоидов из нескольких коммерческих источников, и обычно поставляется в виде запасов глицерина в 96-луночных планшетах.
- Для более подробного описания по строительству на удаление массивов мутантных из запасов глицерина, пожалуйста, обратитесь к Барышникова и др. 14. После того, как мутанты с делецией были выстроены при плотности 384 колоний на чашку, DMA могут быть сохранены в течение нескольких месяцев при 4 ° С. Репликация на YEPD агар, содержащий 200 мкг / мл G418, который необходим для предотвращения колонии от выращивания другвсе остальные.
- Конденсаторные массив удаление мутантный
- Подготовьте 250 мл YEPD агаровой среде, содержащей 200 мкг / мл G418. Эффективная концентрация G418 может изменяться, и каждая серия должна быть проверена эмпирически.
- Подготовьте пять YEPD агаром путем заливки 50 мл YEPD агаре, содержащем 200 мкг / мл G418 на пластине. Сделайте это за один день до конденсации массив и позволяют пластины для охлаждения при комнатной температуретературы ночь на плоской ровной поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре пластины будут необходимы для сбора при плотности 1536-деформированное состояние, пятая пластинка выливали в виде дополнительно. - Удалите 16 чашек Петри, содержащих мутантный коллекцию удалить при плотности 384 колоний на чашку и позволяют достичь комнатной температуры (~ 1 ч).
- Сотрите конденсата, образовавшуюся на крышке каждой пластины с использованием деликатная задача уничтожить. Невыполнение этого требования может привести к каплями воды осаждается на массиве и перекрестного загрязнения, выстроенных мутантов.
- Использование микроорганизмов массива закрепления робота, уплотнять DMA с плотностью 384 колоний на чашку (16 чашек Петри) в 1536 колоний на чашку (4 чашках Петри). Выполните это так, что 1-й колонии из пластин 1 штифтов грести 1 столбец 1 конденсированного массива, 1-й колонии пластины 2 в строке 1 колонки 2, 1-й колонии пластины 3 в строке 2 и столбце 1, и 1-й колонии пластины 4 в строке 2колонка 2.
- Выдержите сводный массив на 30 ° С в течение ночи.
- Осмотрите массив для обеспечения равномерного переноса колоний из исходных пластин. Там будет несколько пустых позиций, специально включены в массив, которые служат в качестве руководства для обеспечения DMA были сокращены правильно (рис 4а).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет источником пластины для реплик на среде, содержащей исследуемое соединение. Один источник пластина может быть использован для нескольких pinnings. Кроме того, многие роботы будут иметь компенсирующее функцию, которая будет обеспечивать одинаковое число дрожжей, передаются каждый раз.
- Реплика пластины массив удаление мутант
- Подготовка 700 мл управления (машина только) и 700 мл экспериментальной информации (химико-содержащих). Этого достаточно для проведения анализа в трех экземплярах (12 пластин в состоянии, плюс два экстра).
- Налейте 50 мл YEPD агар, содержащий химически испытание или контроль за тарелку. Разрешить пластин TO остыть при комнатной температуре в течение ночи на плоской ровной поверхности.
- Использование робота реплики пластины, инокуляции DMA на трех наборов пластин, содержащих химические вещества в экспериментально определенной концентрации, а также тремя наборами пластин, содержащих управления транспортным средством. Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 24-48 ч.
3. рентгенографические пластины и анализ данных
- Удалить пластины из инкубатора и позволяют им прийти к комнатной температуре (~ 1 час) до изображений. Это позволит предотвратить образование конденсата во время визуализации пластины.
- Изображение пластины 24 и 48 ч по снятия крышки и размещение лицевой стороной вниз на плоскую сканера постели. Захват изображений с разрешением не менее 300 точек на дюйм. Кроме того, использовать цифровую камеру для захвата изображений. Если этого поместите пластины лицевой стороной вверх на темном фоне и удалить крышки к изображению.
ПРИМЕЧАНИЕ: формат и позиционирование пластин будет зависеть от программы количественного используется. Выполните количественной оценки и сравнения массивов размеров колонии, используя один из нескольких программ с открытым исходным кодом, в том числе Balony 15, SGAtools 16, и ScreenMill 17.
4. Проверка экрана
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе несколько дрожжей делеции мутанты набрать как индивидуальной непереносимости химического вещества. Эти химические, генетические взаимодействия должны следующий раз будет подтверждено двумя способами. Во-первых идентичность чувствительных штаммов должно быть подтверждено с помощью ПЦР. Во-вторых, химической чувствительности должны быть независимо забил. Изложенные ниже краткий протокол для выполнения пятнистость анализы для проверки натяжения гиперчувствительность, технику распространены в дрожжевой биологии.
- Серия из лучшего (повышенной чувствительностью) мутанты с делецией сбора дрожжей на YEPD агаре, содержащем 200 мкг / мл G418. Выдержите при 30 ° С до колонии не образуют. Проверка генотип штамма с помощью диагностического ПЦР с праймерами соответствии спротоколу производителя.
- Посев 5 мл YEPD жидкости для каждого штамма и инкубировали в течение ночи при 30 ° С с вращением или встряхиванием.
- Измерьте наружный диаметр 600 и разбавить каждого штамма, чтобы OD 600 = 1 в стерильной дН 2 O. Они теперь нормированные культуры дрожжей.
- Распределить 100 мкл нормированной дикого типа дрожжей (BY4741) культуры хорошо A1 96-луночного планшета. Распределить 100 мкл до семи дополнительных штаммов скважин B1-H1.
- Используйте многоканальной пипетки обойтись 90 мкл стерильной дН 2 O в лунки A2-H2 через А6-H6. Наконец, подготовить серию 1:10 разведения нормированных культур дрожжей. Сначала серийно пипетки 10 мкл из колонки 1 в колонку 2 с помощью многоканальной пипетки и продолжают по 96-луночного планшета до шести разведений не производится (т.е. 10 0 до 10 -5).
- Трансфер 2-5 мкл разбавленного дрожжевых культур в сетке, используя многоканальныйпипеттор на YEPD твердых средах, содержащих химические и транспортных средств контроля. Планшеты инкубируют при соответствующей температуре в течение 24-48 ч.
- Проверьте пластины и сравнить чувствительность некоторых мутантов к химическому (по отношению к BY4741 управления). Изображение пластины 24 и 48 ч, как и в шаге 3.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: При идентификации нескольких сверхчувствительных штаммов со связанными онтологий генов или функций придает уверенность в справедливости экрана, трансформация гиперчувствительной удаления штамма плазмиды, содержащей дикого типа копии гена необходимо официально установить, что геном удаление интерес (и не скрытые мутации второй сайт) вызывает лекарственной чувствительности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В проверке этого подхода мы провели характерную химическую генетический экран взаимодействия химиотерапевтического средства 5-фторурацил (5-FU) после описанной выше протокола. 5-ФУ, как известно, разрушают тимидилатсинтазы, а также метаболизма ДНК и РНК 18. Химические генетические взаимодействия 5-ФУ хорошо изучены и исследованы методами дрожжи штрих-код микрочипов с использованием как гетерозиготные и гомозиготные коллекции удаления, 8,19. Здесь показано, что аналогичные результаты могут быть получены путем сравнительного количественного мутантного размер колонии.
Следует отметить, что экран выполнен использует несущественные гаплоидный набор генов удаления. Этот тип экрана также может быть выполнена с использованием диплоидных штаммов, чувствительных к температуре мутантов и гипоморфных аллелей, что позволяет включение основного гена мутантов. Одним из преимуществ использования гаплоидный набор удаления увеличивается наркотиков SENSITIVность целевых путей, учитывая полное отсутствие продукта гена. Тем не менее, два существенных недостатков является то, что важным геном гиперчувствительность не могут быть запрошены, и гаплоидные коллекция склонны к спонтанным супрессоров мутаций, выбранных для в течение нескольких propagations. Это может привести к ухудшению коллекции. Таким образом, существует внутреннее компромисс между целостностью и ширину массива и чувствительности к действия лекарственного средства. Это должно быть принято во внимание, и наиболее подходящим мутантом коллекции выбирается на основе желаемого применения.
Во-первых, соответствующий суб-летальной концентрации 5-ФУ, которые будут использоваться на экране было установлено, что 10 мкМ при выращивании BY4741 (MATa HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) клеток на повышение концентрации 5-ФУ и визуально оценить рост дрожжей колонии ( 3А). Кроме того, аналогичные результаты могут быть получены путем растущей Е.АСТ микротитровальных пластин в жидкой культуре и частого мониторинга культур оптической плотности с помощью планшетного (рис 3B), как описано в предыдущих группах 10,20.
Использование Singer ротора, дрожжи DMA была воспроизведена в 1536 колоний на пластину на плотность среды, содержащей 10 мкМ 5-ФУ или контроль диметилсульфоксид (ДМСО) (фиг.4А). Эти планшеты инкубировали в течение 24 ч при комнатной температуре, и отображается на плоской сканера слоем. Измерение размера колонии для каждого мутанта с обеих экспериментальных и контрольных пластин осуществляется с помощью механизма анализа Balony изображения 15. Программное обеспечение Balony вычисляет отношение размера колоний на экспериментальной решетки по отношению к контролю. Пользователь может установить порог отношения и, если экран выполняется по меньшей мере в трех экземплярах р-значение будет присвоено для каждого мутанта. В наших представительств мутантов экрана, которые показали отношение ≤0.8 были рассмотретьЭд хитами. Результаты количественного колонии могут быть представлены графически, откладывая соотношение размера для каждой колонии на оси ординат и делеции гена заказанного позиции массива (фиг.4В) или отношение (фиг.4С) на оси абсцисс.
Синтетический больных / летальные мутанты, выявленные на экране могут быть сгруппированы на основе функциональных описаний, выполняя ген онтологии анализ (GO). Есть несколько общедоступных инструментов для GO анализа списков S. гены Cerevisiae; в том числе Funspec 21, Дэвид биоинформатики базы данных 22,23, и Saccharomyces Геном Database (SGD) Перейти Срок Finder 24. Генные делеции, которые имели отношение меньше или равно 0,8 на экране 5-ФУ были использованы в качестве входного списка для Funspec. Funspec принимает список имен генов систематическое или общий дрожжей и выводит резюме генов онтологии, функциональных классификаций, локализация белковых комплексов, а также OTее полезные классификации, которые обогащены в этом списке. Представитель экрана выполняется показали обогащение онтологий для метаболизма РНК, в том числе тРНК колеблется, модификация уридин и техника РНК наблюдения и ответ на повреждение ДНК (таблица 1). Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями, которые показали, 5-FU результаты лечения в накоплении полиаденилированных некодирующих РНК, которые обрабатываются с помощью ядерного Trf / Rrp6 / Air / Mtr4 Полиаденилирование (пешеходная) экзосома 25. Таким образом, эти результаты находятся в согласии с предыдущими химических генетических экранов и известным механизмом 5-ФУ биологической активности 8,19.
Как и во всех высокой пропускной функциональных геномных подходов необходимо проверить результаты. Для проверки химического генетических взаимодействий дрожжей мутанты должны сначала ПЦР-подтверждены с использованием праймеров, которые отжигаются в промотор гена-мишени и KANMX кассеты с разрывом. Выбор штаммов для действительнация несколько произвольно, однако приоритетности мутанты, которые показывают сильную фенотип и группа функционально представляет собой хорошую отправную точку. Далее, гиперчувствительность к химическим подтверждается с помощью пятнистость анализы, общий подход для измерения пригодности мутантах дрожжей. С этой целью, серийные разведения штаммов дрожжей выставляются в сетке на средах, содержащих соответствующий химический дозы, а также контроль. В качестве примера, мы подтверждаем химический генетический взаимодействие 5-ФУ с AIR1 и trf5 мутантов бродяги комплекса (рисунок 5). Эти гены кодируют компоненты TRAMP ядерной экзосома. Отметим, что rrp6 штамм, не имея ядро 3'-5 'экзонуклеазной активности TRAMP, погиб в высокой плотности коллекции DMA нашей лаборатории. О получении свежий rrp6 мутант Мы подтверждаем, что rrp6 и 5-ФУ также отобразить химический генетического взаимодействия, установив, что TRAMP активность необходима терпеть 5-ФУ. Это показывает,что целостность больших коллекций удаление может стать угрозой со временем, делая правильный уход DMA и проверка натяжения решающее значение.
Наша экран также определены мутантов в нескольких ферментов репарации ДНК (в том числе Rad50, Rad52 и mre11) в качестве 5-ФУ чувствительной. Подсчет размера колоний указывает на относительную пригодность этих мутантов 10 мкМ 5-ФУ в 0,7, 0,65, и 0,42 по сравнению с диким типом. Основываясь на наших подтверждающих подзорные анализов (рис 5), эти значения занижены, скорее всего из-за ограниченного динамического диапазона фитнес измерения по размеру колонии очков. Это подчеркивает вторую причину самостоятельно подтвердить взаимодействия от серийного кровянистые выделения: величина некоторых химических генетических взаимодействий может быть недооценена в анализе первичных данных. Наши результаты показывают, что рост на основе химической генетический скрининг проводили с ~ 4800-штамма коллекции гаплоидный удаления, в трех экземплярах, обеспечивает адекватную RESOL социологическое загрязнение уверенно выделить специфические химические генетических взаимодействий.
Рисунок 1:. Схематическое представление химической генетических взаимодействий удаления генов, которые приводят к повышенной чувствительности к химическим возмущения позволяет выявить биологических процессов, направленных на химических веществ. () Конвергентные пути могут быть нарушены или делеции гена (geneA) или химически (geneB). Индивидуально, эти клеточные оскорбления может быть терпимо из-за присущей избыточности в биологических путей. Тем не менее, в жизнеспособности клеток комбинированной нарушена в результате либо синтетически болезни или летального фенотипа. (B) Удаление генов (geneC), важных для смягчения химически стрессу и вызывать гиперчувствительность и указать биологические пути разрушены химической обработки. jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Последовательность действий для генетический скрининг химической () Определение суб-ингибиторной дозы:. Родительский штаммы дрожжей выращивали до стационарной фазы, разбавляют 1: 5000, а распространение высевают на твердые YEPD средах, содержащих повышения химической дозу. Наибольшая концентрация не имея ингибирование роста больше, чем на 10-15% выбран для скрининга против DMA. (B) Систематический генетический скрининг химической Использование массива с высокой пропускной пиннинга робота С. CEREVISIAE ДМА реплика была помещена на средах, содержащих соответствующую концентрацию исследуемого вещества. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 24-48 ч, отображаемого, и относительный размер колонии определяется.ЗАДАНИЕ = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" TARGET = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3 :. Определение югу от подавляющей концентрации. () Рост BY4741 клеток на твердых средах, содержащих 5-fluouracil. Насыщенный BY4741 культуры разводили 1: 5000 и высевали на возрастающих концентраций 5-фторурацила. Кривая (В) Рост BY4741 клеток в жидких средах, содержащих 5-flurouracil. ~ 4 × 10 4 клеток на хранение в трех экземплярах на повышение концентрации 5-ФУ и ОР были измерены каждые 10 мин в течение 22 ч.
Рисунок 4: Химическая генетический скрининг 5-Фторурацил. (А) С. Cerevisiae массив удаление мутант воспроизведены на YEPD агар, содержащий 10 мкМ 5-ФУ (справа) и контроля ДМСО (слева). (B) Результаты генетический скрининг химического: Относительный рост мутантов на 10 мкМ 5-ФУ по сравнению с контролем ДМСО, заказанного позиции массива. (С) Относительный рост мутантов 10 мкМ 5-ФУ в сравнении с контролем ДМСО заказу соотношении размера колоний. Отношение порог ≤0.8 указывается на обоих графиках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Проверка химического генетических взаимодействий. Серийные разведения нескольких изолированных мутантных штаммов, выращенных на контроле ДМСО (A), 10 мкМ 5-ФУ (
| GO Категория | P-значение | Идентифицированных генов (хитов) | # хиты | Общее генов в GO Категория |
| тРНК колебание уридин модификация [GO: 0002098] | 2.24 × 10 -6 | SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 | 7 | 24 |
| транскрипция, ДНК-зависимая [GO: 0006351] | 1,69 × 10 -5 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 Sac3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 | 32 | 540 |
| перевод [GO: 0006412] | 4.28 × 10 -5 | RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A | 22 | 318 |
| тРНК колебание позиция уридин Тиолирование [GO: 0002143] | 1,88 × 10 -4 | NCS6 URM1 TUM1 | 3 | 5 |
| регуляции транскрипции, ДНК-зависимая [GO: 0006355] | 4.98 × 10 -4 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 Sac3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 | 27 | 507 |
| белок urmylation [GO: 0032447] | 6.33 × 10 -4 | NCS6 URM1 URE2 | 3 | 7 |
| экспорт мРНК из ядра в ответ на тепловой стресс [GO: 0031990] | 2,04 × 10 -3 | RPB4 NUP120 NUP133 | 3 | 10 |
| ядерного полиаденилирования зависит от CUT катаболический процесс [GO: 0071039] | 2,04 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 10 |
| триптофан метаболический процесс [GO: 0006568] | 2.15 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 3 |
| рано эндосом в Гольджи транспорта [GO: 0034498] | 2,75 × 10 -3 | Ent5 TCA17 RCY1 | 3 | 11 |
| рибосомальная малой субъединицы биогенеза [GO: 0042274] | 3.63 × 10 -3 | Sac3 LTV1 RPS19B RPS19A | 4 | 24 |
| модификация хроматина [GO: 0016568] | 3.64 × 10 -3 | LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1 SGF11ELP3 | 9 | 114 |
| ATP метаболический процесс [GO: 0046034] | 4.23 × 10 -3 | VMA2 VMA1 | 2 | 4 |
| вакуолярная протон-транспортных V-типа АТФ-азы сложный монтаж [GO: 0070072] | 4.23 × 10 -3 | VMA21 VPH2 | 2 | 4 |
| хромосома локализации [GO: 0050000] | 4.23 × 10 -3 | NUP120 NUP133 | 2 | 4 |
| мРНК транспорт [GO: 0051028] | 4.59 × 10 -3 | DHH1 Sac3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 | 6 | 58 |
| вакуолярная подкисление [GO: 0007035] | 4.89 × 10 -3 | VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 | 4 | 26 |
| экспорт рРНК из ядра [GO: 0006407] | 5.63 × 10 <SUP> -3 | NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A | 4 | 27 |
| эндоцитоза [GO: 0006897] | 6,57 × 10 -3 | SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 конец3 | 7 | 82 |
| наблюдения ядерной мРНК мРНК 3'-конца обработки [GO: 0071031] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 MPP6 | 2 | 5 |
| ncRNA полиаденилирования [GO: 0043629] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| ядерного полиаденилирования зависит от катаболических процесс snoRNA [GO: 0071036] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| ядерного полиаденилирования зависит от катаболических процесс мяРНК [GO: 0071037] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| триптофан биосинтеза процесс [GO: 0000162] | 6,92 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 5 |
| вставка белка в ER мембраны [GO: 0045048] | 6,92 × 10 -3 | GET1 GET4 | 2 | 5 |
| стабилизация мРНК [GO: 0048255] | 6,92 × 10 -3 | ATP25 IGO1 | 2 | 5 |
| ответ на повреждение ДНК стимула [GO: 0006974] | 7,05 × 10 -3 | MUS81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 MRE11 Rad50 RMI1 | 12 | 197 |
| GO Категория | P-значение | Идентифицированных генов (хитов) | в "> # хитовОбщее генов в GO Категория | |
| ядерного полиаденилирования зависит от катаболических процесс рРНК [GO: 0071035] | 8,46 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 16 |
Таблица 1: Ген онтологии (GO) Характеристика 5-фторурацил чувствительных мутантов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изложенные здесь подход для создания химико-генетических профилей взаимодействия. Метод прост: путем сравнения размеров колонии каждого из штаммов в полных коллекций делеции гена в присутствии и в отсутствие химической, все гены, необходимые, чтобы переносить химическую инсульт определены. Анализ обогащение Краткое полученного списка чувствительных штаммов могут быть использованы, чтобы дать представление о режиме химических веществ действий. В то время как этот протокол был оптимизирован для начинающих дрожжи, оно также может быть адаптирован для использования с другими одел микробных коллекций удаление, таких как E. палочка Кейо коллекции, которая была успешно использована для исследования сотни сотовой возмущений 26,27.
Химическая-генетический профилирование в дрожжах и других организмов хорошо известно. Большинство из этих исследований опирались на соискание анализов, которые количественно объединенных делеционных мутантов с помощью анализа микрочипов или высокой пропускной sequencing уникальных генетических штрих-кодов. Такой подход оказался успешным в производстве надежных химико-генетических профилей больших химических библиотек. Методика описана здесь обеспечивает полезную альтернативу для химико-генетический анализ меньшим числом испытуемых соединений. Анализ обеспечивает простой считывание, которое меньше, чем стоимость непомерно высокой пропускной последовательности или анализа микрочипов и не страдают от смещения последовательности. В то время как протокол, как описано требует роботизированным инструментом для колонии манипуляции, такие системы становятся все более доступными и, поочередно протокол может быть скорректирована для использования с ручными инструментами закрепления, примеры которых были включены в список материалов.
Важно быть в курсе ограничений этого подхода и химической генетического профилирования в целом. Во-первых, соединение должно оказывать влияние на жизнеспособность в многообещающий дрожжей, или удельная организм быть использованы. В то время как многие фундаментальные биологические процессыи функции хорошо сохраняется среди эукариот, организм конкретные химические генетические взаимодействия могут варьироваться в широких пределах, так же как и поглощение химических веществ в клетки. Следует также отметить, что несколько штаммов удаление было обнаружено, что быть чувствительны к лекарственной терапии несколькими 8. Они включают в себя гены, участвующие в оттоке наркотиков, вакуолярной функции и целостность мембраны. Важно учитывать множественной лекарственной устойчивости, когда делать выводы в отношении прямых и косвенных способов действия.
Экран, описанный здесь проводили с использованием гаплоидный набор удаление, общий подход к химико-генетического анализа в дрожжах. Есть теперь несколько сборников мутантах дрожжей, доступных для дальнейшей помощи в определении режима химическое соединение в действия. Это включает в себя не только полный гомозиготную и гетерозиготных диплоидных коллекции удаление, но также условные основного гена мутантов чувствительные к температуре, DecreAsed изобилии мРНК возмущений (влажной) дрожжей мутанта библиотекой, а также синтетического гистона H3 и H4 мутанта коллекции, которые могли бы быть использованы для исследования эпигенетических основе молекулярных методов лечения 3,4,28, учитывая невероятную глубину из имеющихся инструментов, простота Методология, и ограниченный инфраструктуры, необходимой, этот подход обеспечивает доступной форме доступа богатый функциональную информацию относительно механизма химического состава.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Исследования в лаборатории CJN поддерживается операционными грантов NSERC, Научно-исследовательского института Канады общества рака (CCSRI), и Канадский Фонд рака молочной железы (BC-Юкон филиал).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12-well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5 ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10 cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1,000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1,000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
