Summary
이 문서 동물 행동 실험을위한 실험실 설정에서 용존 산소 조건을 조작 할 수있는 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 용존 산소 농도의 변화에 대형 무척추 동물, 어류, 양서류 또는 유기체의 반응을 평가하기 위해 모두 교육 및 연구 실험실 설정에서 사용될 수있다.
Abstract
실험실 환경에서 용존 산소를 (DO) 조작 할 수있는 능력은 생태 학적 유기체의 행동 문제의 수를 조사 할 중요한 응용 프로그램이 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 저산소 및 무산소 조건으로 인한 수생 생물의 행동 반응을 연구하기 위해 DO 조작 할 수있는 간단하고 재현성 및 제어 방법을 제공한다. 질소는 통상적으로 실험실 설정에서 사용되는 물의 탈기를 수행하는 동안, 생태 (수중) 애플리케이션에 대한 명시적인 방법은 문헌에 존재하지 않고,이 프로토콜은 유기체의 반응을 관찰하기 위해 물 degasify하는 프로토콜을 기술하는 제이다. 이 기술 및 프로토콜은 수생 대형 무척추 동물에 대한 직접 응용 프로그램에 대한 개발되었다; 그러나, 작은 물고기, 양서류 및 기타 수생 척추 동물은 쉽게 대체 될 수 있습니다. 그것은 2 ㎎ / ℓ에서 11 밀리그램 / 안정성 L에 이르기까지 DO 수준의 쉬운 조작을 가능하게하기위한 5 분 동물 관찰 기간까지.5 분의 관찰 기간을 넘어 물 온도가 상승하기 시작, 10 분 DO에서 수준을 유지하기에 너무 불안정했다. 이 프로토콜은 입문 교육 연구소와 높은 수준의 연구 응용 프로그램에 신속한 구현을 허용, 연구 유기체로 확장 재현하고 신뢰할 수 있습니다. 이 기술의 예상 결과는 생물의 행동 반응에 산소 변화를 용해 관련이 있어야합니다.
Introduction
용존 산소 (DO)는 수중 생태계 내에서 생물학적, 생태 학적 프로세스의 번호를 매개하는 중요한 열쇠 물리 화학적 매개 변수입니다. 급성 및 만성 하위 치명적 저산소증에 노출 특정 수생 곤충의 성장 속도를 줄이고 1 노출 곤충의 생존을 줄일 수 있습니다. 이 프로토콜은 동물 행동에 미치는 영향을 관찰하기 위해 스트림 물 DO 수준을 조작 제어 방법을 제공하기 위해 개발되었다. 모든 호기성 수생 생물 생존 살고 재현하기 위해 산소 농도에 의존하기 때문에, DO의 농도의 변화는 종종 생물에 의한 행동 변화에 반영됩니다. 더 많은 모바일 수생 무척추 동물과 물고기가 높은 DO 2,3와 로케일을 추구하여 낮은 산소 농도 (저산소증)에 대응하는 관찰되었다. 이하 모바일 수생 생물의 경우, 행동 적응이 유일한 실행 가능한 옵션이 될 수있다 DO의 섭취를 증가시킵니다. PLEC의 수생 대형 무척추 동물 순서6 - optera (stonefly)는 자신의 외부 아가미 4에서 산소의 물 흐름과 흡수를 증가시키기 위해 "푸시 업"운동을 수행하는 데 주목하고있다. 이러한 적응 행동은 자연 환경과 실험실 실험에서 관찰되었다.
물 DO의 실험 조작은 동물 행동 연구를위한 중요한 기회를 열어하지만, 방법 론적 전개에 상당한 격차가 존재한다. 예를 들어, 한 연구는 질소 가스 배출은 다음과 저산소 환경에 더럽혀진베이스의 생리적 반응 시간 (Micropterus의 salmoides)을 평가하기 위해 대형 수족관을 사용하지만, 부족한 세부 사항은 방법론 7 주어진다. 제브라 물고기 (다니오 레 리오)에서 수행하는 또 다른 연구는 물에 가스를 제공하고, 물 (8)의 DO를 줄이기 위해 질소 가스를 다공질 돌을 이용하여 설명했다. 화학 기반 응용 프로그램의 경우, 용매의 탈기 방법은 전문적인 활용장치 9-11은 용매로부터 산소를 제거 할 수 있지만, 동물 행동 연구에 적합하지 않을 것입니다. 이 연구는 물에서 산소를 제거하는 방법을 사용하지만, 더 설명하는 방법은 변경 작업을 수행하는 응답 동물의 행동의 평가를 허용하는 것을 식별 할 수있다.
이하 설명 된이 방법은 충분히 질소 가스를 사용하여 물 DO 조작을위한 프로토콜을 기술하기위한 시도이다. 또한,이 방법은 stonefly 동작 (팔 굽혀 펴기) 사이의 관계를 관찰으로 개발하고 그 학년 수준의 생물학 실험실에서 사용 하였다 DO했다. 이 방법의 주요 이점 중 하나는 쉽게 공통 유리 대부분 이차 높은 교육 기관 액세스 재료 실험실 내에서 수행 될 수 있다는 것이다. 이 프로토콜은 개인 연구 또는 교육 응용 프로그램에 명시된 목표를 달성하는 절차를 확장 할 수 있도록 쉽게 적응할 수있다.
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Protocol
참고 :이 실험 동물 관리 및 사용위원회 주니아 대학의 연구소의 승인을 필요로하지 않았다 때문에 척추 동물을 사용하지 않았다. 그러나 척추 동물에 사용이 방법을 채택 개인, IACUC 승인이 모색되어야한다.
1. 필드 샘플 컬렉션
- 결정하고, 가게를 수집 할 수있는 능력에 대한 잠재적 인 필드 사이트를 평가하고, 전송 stoneflies 빠르게 1 시간의 통과의 최대 권장 시간과 운송 시간을 최소화 할 수 있습니다.
- 적어도 35 stoneflies (12)를 수집하기 위해 표준 킥 순 절차에 따라 선택한 필드 사이트에서 충분한 시간을 킥 순 샘플링을 수행합니다.
- 스트림에서 2cm의 최대 직경 스트림 물과 바위의 50 L를 수집합니다.
- 스트림 사이트의 온도로 설정 냉장고에 수족관을 배치합니다. 수족관에 스트림 사이트에서 수집 바위를 배포하고 수족관 당 스트림 물 4 L로 입력합니다. (20)를 배치수족관 당 -30 수집 stoneflies 및 각 탱크로 수족관 버블에 부착 된 버블 돌을 배치하고 지속적으로 물에 실내 공기를 추가 할 수 버블의 전원을 켭니다.
- stoneflies는 48 시간의 기간 동안 수족관에서 새로운 환경에 적응하도록 허용합니다.
그림 1. 용존 산소 조작에 설정합니다. (A) 1) 남성 호스 미늘 2) 스토퍼 실의 위치에 구리 파이프에 대한 피팅이 잘 보장 플라스크를 밀봉 검사합니다. (B) 1) 사이드 암 플라스크에 1.9 물 2) 가스 튜브 각각 질소 버블과 실내 공기의 기포에 사용하는 기포 (청색), 3) 질소 탱크 L 및 계측 값 4) 2 L 플라스크에 충전이 L 진공 튜브 (5) 침수) 용존 산소 측정기 물 0.4 L 가득합니다. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
2. 실험 세트까지
- (도 1B의 1) 도시 한 바와 같이 벤치 위에, 2 L 사이드 암 플라스크의 측면 팔 표준 벽 진공관을 연결한다.
- 12 ° C로 설정 냉장고에 수집 된 스트림 물을 들고 3 L 플라스틱 컨테이너에서 스트림 물 1.9 L 플라스크를 입력합니다.
- 플라스크 내부의 전망을 왜곡하지 않고 사이드 암 플라스크 주위에 얼음 목욕을 유지하고 얼음 트레이를 채우기 위해 충분히 큰 쟁반에 술병과 튜브를 놓습니다.
- 용기에 가스를 제공하고 1) 구리 파이프의 통과를 허용하기 위해 고무 마개 두 3mm 직경의 구멍을 드릴 2)도 1b의 2 L 사이드 암 플라스크로 DO 미터 프로브 (1) .
- 상기 스토퍼에 DO 프로브의 와이어의 안착을 허용하도록 구멍 중 하나에 스토퍼 모서리 측면 절개를.
- 3 밀리미터 남성 호스 커플러를 연결미늘 (그림 1A 1) 2mm 직경의 구리 파이프의 조각에. 이 파이프 스토퍼를 통해 도달하면서 플라스크의 바닥 10cm 이내로 도달하기에 충분히 긴 있는지 확인하십시오.
- 스토퍼의 바닥에서 길이까지 스토퍼의 두 번째 구멍이 플라스크의 바닥 10cm 이내로 도달하기에 충분하지만 커플러와 파이프를 배치합니다.
- 배관의 커플러 3 mm의 직경과 0.75 m 길이의 얇은 벽 폴리에틸렌 가스 튜브를 연결한다.
- 플라스크에 DO 프로브 및 구리 파이프를 모두 밀어 넣고 마개 플라스크를 밀봉.
- 마개 플라스크뿐만 아니라 파이프와 스토퍼 내 프로브 와이어 사이의 아늑한 적합 사이의 보안 씰을 확인합니다.
- 수돗물의 0.4 L로 1 L 플라스크를 채우고 얼음 욕조와 진공 플라스크 트레이에 인접하여 배치합니다.
- 1 L 플라스크의 물에 큰 진공 플라스크에서 오는 폴리에틸렌 튜브를 담근다. 고정이 실험을 통해 잠긴 상태로 유지됩니다 있도록 테이프 튜브.
- 수족관 실내 공기 버블에 진공 플라스크에서 3 mm 직경 가스 라인을 연결합니다. 물에 실내 공기와 산소를 소개 수족관 버블에 연결하여 거품에 2 L 플라스크에 물을 시작합니다.
- 5 분 동안 DO 미터와 DO 농도 및 물의 온도를 모니터 또는 DO의 평형 DO 작은 변화가 발생되도록 상기 챔버 내에 설치 될 때까지.
3. 테스트 실험 세트 최대의 안정성
- stoneflies의 추가 이전 DO 안정성에 대한 각 설정을 테스트합니다.
- stoneflies가 팔 굽혀 펴기를위한 도움이 기판을 가질 수 있도록 2 L 플라스크에 서너 바위를 추가합니다.
- 기포로부터 가스를 분리 관 및 질소 가스 라인에 부착하여 DO의 시험 조작을 시작한다.
- 약 40 시간 (CFH) 당 20입방피트 질소 버블 링 시작1 분에 초.
- DO가 0.5 mg의 목표 농도 / L 내로 떨어지면 15 CFH로 흐름을 감소시키고 농도가 목표로 감소 할 수있다.
- 목표 농도에 도달하면 즉시 질소 흐름을 중단.
- DO가 대상 이하로 감소하면 목표 농도 농도를 반환하는 수족관 실내 공기 버블을 사용합니다.
- DO가이 셋업의 테스트 기간 동안 불안정한 경우 수온이 안정적이고 변화하지, 물 볼륨이 1.9 L에 여전히 및 물 밖으로 버블하지 않았다 확인하고, 모든 피팅에 도장 꽉 밀봉 것으로 보인다.
- 세 가지 시험을 수행하고, 실험은 DO를 제어 할 수있는 능력에 대한 자신감이되고 나면, 버블 거품에 가스 라인이 다시 평형 연결합니다.
- 수족관 버블을 3 mm 직경의 가스 라인을 부착하고 농도까지 물에 대한 실내 공기의 첨가를 시작하여 평형 거품물에 산소를 증가 또는 3 분 동안 변경되지 않습니다.
- 일단 평형, 버블 링 중지하고 플라스크를 개봉.
4. Stonefly 푸시 업 실험
- 실험 수행의 수를 결정하는 관찰자의 숫자로 stoneflies의 총 수를 나눈다.
- stoneflies의 행동 응답 (팔 굽혀 펴기 수)를 평가하는 2, 10 ㎎ / ℓ 사이의 서로 다른 DO 수준을 결정합니다.
- 고무 마개 플라스크를 봉인 한 후, 재판 당 하나의 플라스크를 설정하고 플라스크에 관찰자 (이 설계 내에서 4 stoneflies)이 있기 때문에 stoneflies의 동일한 번호를 추가, 다시 플라스크에 프로브와 파이프를 배치합니다.
참고 :이 stoneflies가 샘플링 된 곳에서 스트림의 DO 농도가 이후 초기 10 mg의 농도를 DO / L은 제 1 관찰 지점으로 선택되었다. - 물은 다음 단계 2.10-2.11 버블 링시켜 10 ㎎ / ℓ로되면 개시 물의 온도를 기록하고 허용stoneflies 플라스크에있는 바위 기판에 부착합니다.
- stonefly에 의해 전시 위아래로 몸의 움직임이다 푸시 업 동작의 정확한 계산을 위해 하나의 stonefly를 보는 하나의 관찰자를 할당합니다.
- 개수 및 3 분의 관찰 기간에 걸쳐 관찰 된 푸시 - 업 횟수를 기록한다.
- 다음 실험 DO 레벨 DO 조작하고 추가 실험 수준의 3 분의 관찰 기간을 반복한다.
참고 :이 실험 설계 내에서 세 가지 DO 수준을 평가 하였다.
5. 통계 분석
- 주어진 DO 재판에 대한 그룹에서 네 stoneflies에서 팔 굽혀 펴기의 통계 분석 사용 평균을 수행합니다.
- 팔 굽혀 펴기와 각 실험 시험의 순서를 사용하여 DO 농도의 수에 차이 (ANOVA)의 분석을 수행 할 수없는 R 통계 컴퓨팅 소프트웨어 (12)를 사용 (레벨 DO) 및 COV 등의 온도ariates. 단일 요소의 개별 수준으로 DO를 분석했습니다.
- 정상 13를 확인하기 위해 잔류에 앤더슨 - 달링 정상 테스트를 사용합니다.
- DO 농도에 대한 굽혀 펴기의 평균 수를 플로팅하여 데이터에 대한 선형 회귀 분석을 수행합니다.
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Representative Results
설명 된 설정의 여섯 시험은 stoneflies 물에 다른 DO 농도에 대한 응답으로 수행 굽혀 펴기의 수를 정량화하기 위해 교육 실험실 환경에서 24 학년 학부생에 의해 수행되었다. DO 수준 내에서 각 시험 내에서 수행 굽혀 펴기의 평균 수는 그림 2의 DO 수준에 대한 푸시 업을 플롯 풀링 하였다. 분산 분석은 물론, DO 농도, 시험의 순서, 온도를 이용하여 처음 실시 하였다 모든 변수 사이의 상호 작용. 결과는 농도가 크게 stoneflies에 의해 수행 굽혀 펴기의 수에 영향 않는 것이 좋습니다 (R 2 형용사를. = 0.322, P = 0.004) 및 다른 변수 또는 상호 작용은 팔 굽혀 펴기의 중요한 예측 인자였다. 이 분석에 사용 된 모든 데이터는 앤더슨 달링 테스트를 사용하여 정상 상태에 대한 확인되었다.
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시험별로 그룹화 stoneflies에 의해 수행 굽혀 펴기 그림 2. 평균 번호. 이것은 상당한 음의 관계를 보여줍니다 용존 산소 농도에 대하여 플롯 (R 2 형용사를. = 0.322, P = 0.004) 팔 굽혀 펴기와 용존 산소 농도 사이에 (의 기울기 -6.063). 빨간색 숫자는 재판 (° C)에서 물 온도를 나타냅니다. 온도는 3 분의 시험 기간에 걸쳐 안정, 그러나 실험에서 다양했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
기업 코드 파일 :. 통계 분석을위한 R 코드 이를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오파일.
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Discussion
중요한 단계
이 절차는 수생 생물의 행동 연구를 수행하기 위해 실험실 설정에서 DO를 조작하는 간단하고 효율적인 방법을 제공한다. 우리는 직접 결과와 관련이 실험을 수행 할 때 알아야 할 몇 가지 중요한 단계 / 항목이있을 발견했다. 시험 내에서, 물 위의 가스의 분압의 변화를 방지하는 챔버 압력을 유지하는 것이 중요하고, 후속의 변동을한다. 프로토콜의 "실험 장치의 안정성을 테스트"섹션에 설명 된 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 스토퍼 물 1 L 플라스크에 넣고, 진공 호스의 완전한 침수을 보장 플라스크 스토퍼 시일 검사 (실내 공기의 역류를 방지하기 위해) 및 가스 라인 안착 와이어 씰 일은 안정을 유지할 수 챔버 환경을 제공합니다. 또한, 실 내에 물의 양을 최대화 DO에서의 안정성을 개선 할 필요가있다우리가 불규칙하고 불안정이 조작을 DO 너무 작은 볼륨 결과 것으로 나타났습니다로 재판.
상기 챔버의 물 온도를 유지하면 내부 DO 수준의 양호한 제어를위한 필수적이다. 우리는 개별 그룹 실험에서 차가운 물 온도를 유지할 수있는 동안, 다른 시험에서 온도에 최소한의 변화는 (그림 2) 분명했다. 온도의 우리의 전체 범위 (11.8-13.5˚C) 낮은 stoneflies의 일반적인 범위 내에서 이었기 때문에, 그것은 stonefly의 팔 굽혀 펴기위한 우리의 모델의 중요한 예측 인자 인 것을 입증하지 않았다. 그러나, 수온을 물 (14, 15)의 산소 포화도 전위를 행하도록 알려져 있으며, 챔버의 수온을 유지하지 못하는 것은 DO 수준에 직접적인 영향을 미칠 것이다. 좋은 인감, 물을 적절한 볼륨 및 안정적인 물 온도, 내부 챔버 압력으로 쉽게 시험 사이의 DO의 실험 및 제어를 통해 유지 마십시오 것은 s입니다테이블과 재현.
제한 사항 및 수정
이 실험의 두 가지 잠재적 인 한계는 챔버의 크기 및 관찰 기간의 길이이다. 물 (~ 2의 L)과 챔버의 목에서 작은 구멍의 부피는 수 유기체의 크기가 사용되는 제한한다. 이 규모로, 프로토콜은 다른 대형 무척추 동물, 양서류, 작은 물고기에 대한 stoneflies 쉽게 교체를 허용하지만, 더 큰 유기체 (즉, 육식 물고기, 문어)에 적용되지 않을 것입니다. 그러나, 더 큰 유기체와 상이한 학습 / 연구 목적을 달성하기 위해 전체 프로토콜을 큰 유리를 사용하고, 적용하여 실험을 확장 할 수있을 것이다. 인해 2 L 플라스크에 작은 목 둘레에 유리를 선택할 때 추가적으로, 더 큰 유기체 챔버에 필요한 기판이 고려되어야한다. 우리의 실험에서 작은 강-돌은 충분한 챔버들 stoneflies으로 수집 및 제공되었다 stoneflies가 팔 굽혀 펴기를 수행하는 ubstrate.
짧은 시간 관찰 기간 동안 내부 챔버 조건이 최소한의 변동으로 유지되었다, 그러나 불확실성은 더 이상 관찰 기간에 대해 남아있다. 프로토콜 챔버 수온에서 설명한 3 분의 관찰 기간을 이용하고 DO 레벨은 일정한 값으로 유지 하였다. 우리는 5 분의 관찰 기간까지 DO 및 물 온도를 유지할 수 있었지만, 10 분 긴 관찰 기간에서, 챔버 내의 물의 온도가 상승하기 시작 하였다. 현재의 프로토콜에서, 5 분 이상 관찰 기간을 연장 가능하지 않다. 그러나, (예를 들면, 기후 조절 실 사용 등) 현재의 프로토콜에 적응 수온 증가 장기 안정성을 허용 할 수있다. 또한, 주변 물 조건 (온도, DO, 분압) 대 관측 시간보다 강력하고 구체적인 분석을 제한하는 요소를 결정할 수있다.
콘텐츠 ">이 프로토콜은 상이한 요구 및 목적들을 충족하기 위해 (전술 한 바와 같이)를 수정할 수있는 능력을 가지고있다. 우리가 전적으로 작은 구리 파이프를 사용하면서 기존의 프로토콜에 대한 하나의 추가 변형 예. 버블 시스템에 변형 될 거품을 물, 우리가 큰 질소 가스 거품의 추가는 종종 강 돌에 자신의 보류에서 stoneflies을 빠질 챔버 주위에 떠을 보낸 통지를했다. 우리는 질소 가스의보다 균일 한 분산을위한 버블 링 돌을 사용하려고 시도 하지만, 챔버의 물을 균일하게 챔버 내에서 저산소 상태의 칼럼의 결과로, 질소 가스를 분산 충분히 교반되지 않았 음을 발견 하였다. 질소 가스 전달 시스템의 또 다른 구체화를 stoneflies을 빠지의 잠재적 혼동 유용한 통찰을 제공하고 제거 할 수있다 DO 시험 사이의 기판에서. 의의 및 향후 응용 프로그램
이 실험에서 그것의 종류의 첫번째이었다실험실 환경에 동물 행동 관찰 DO 수준을 조작 상세한 프로토콜 개발 clude. 다른 문서 작업 DO 7,8,16 레벨을 조작하는 질소 가스의 사용을 제안하지만, 불충분 방법론 상세 복제 가능하도록 주어진다. 이 프로토콜 개발에 대한 관심이 DO 수준을 조작하고 주니아 대학에서 대학 수준의 입문 생태 실험실에서 사용하기 위해 동물의 행동을 관찰하는 우리의 욕망에서 비롯. (24) 학생의 클래스 내에서이 프로토콜은 DO 수준을 다른과 학생들의 그룹간에 시험에서 재현 입증했다. 더욱이,이 프로토콜은 실험실 실험에 대한 DO 레벨을 조작 할 수있는 매우 접근하고 비용 효율적인 방법을 제공한다.
이 프로토콜은 교육 실험실에서 stoneflies와 함께 사용하기 위해 특별히 개발 된 반면, 쉽게 다른 목적에 적합 할 수있다. 보다 구체적으로,이 프로토콜은 쉽게 다른 작은 수중으로 사용될 수있다대형 무척추 동물, 물고기, 심지어 양서류 관심의 종류에 따라 다릅니다. 예를 들어, 사용할 수있는 저산소증 (17)에 대한 응답으로 자신의 기관차 활성을 증가 순서 Amphipodia의 구성원, 또는 금붕어 (붕어 속 auratus) 저산소 상태 (16) 동안 그 전시 물 표면에서 "꿀꺽 꿀꺽 마시고"행동하십시오. 또한, 수생 생물의 다양한 삶의 단계는 개발을 통해 생명체의 산소 요구에 대한 우리의 이해를 증진하는 데 도움이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 18 mudpuppies (Necturus의 maculosus)와 같은 양서류 실험에서 저산소증에 대한 생화학 적 반응을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 또한,이 프로토콜은 더 크거나 더 작은 유기체 및 교육 연구 또는 애플리케이션의 요구에 맞는 크기로 축소 또는 상하로 할 수있다. 우리는 프로토콜과 특정 응용 프로그램 자체가 광범위한 생태 학적 관심이 protoco의 가장 큰 장점이라고 생각하지만리터는 분류 학적 그룹과 실험 목적에 걸쳐 훌륭한 기반 개발을 제공하는 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter flask 2 L | Pyrex | 5340 | |
| Rubber Stopper size 6 | Sigma-Aldrich | Z164534 | |
| Nalgene 180 Clear Plastic Tubing | Thermo Scienfitic | 8001-1216 | |
| Whisper 60 air pump | Tetra | ||
| Standard flexible Air line tubing | Penn Plax | ST25 | |
| 0.25 inch Copper tubing | Lowes Home Improvement | 23050 | |
| Male hose barb | Grainger | 5LWH1 | |
| Female Connector | Grainger | 20YZ22 | |
| Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter | Extech | 407510 | |
| Nitrogen gas | Matheson TRIGAS | ||
| Radnor AF150-580 Regulator | Airgas | RAD64003036 |
References
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