Summary
本文介绍了一个简单的和可重复的协议来操作溶氧条件在实验室环境对动物行为的研究。该协议可能在教学和研究实验室的设置可用于评估在溶解氧浓度的变化无脊椎动物，鱼类，两栖类或生物体的反应。
Abstract
操纵溶解氧（DO）在实验室环境的能力有显著应用调查若干生态和生物体的行为的问题。这里所描述的协议提供了一种简单的，可重复，并且控制方法来操纵DO来研究从低氧和缺氧条件下得到的水生生物的行为反应。在执行的水脱气用氮气在实验室设置常用生态（水生）应用没有明确的方法存在于文献中，并且该协议是第一个描述的协议以degasify水来观察生物体反应。这种技术和协议是为水生无脊椎动物直接应用开发;然而，小鱼类，两栖类，和其它水生脊椎动物可以很容易被取代。它允许从2毫克/升，以11毫克/升与稳定性DO水平的容易操纵长达5分钟的动物观察期。超过5分钟的观察期水温开始上升，并在10分钟DO水平变得太不稳定维护。该协议可扩展到研究有机体，重现性好，可靠，允许快速实施到入门教学实验室和高层次的研究应用。这种技术的预期的结果应与溶解氧改变生物体的行为反应。
Introduction
溶解氧（DO）是在调解一些水生生态系统中的生物和生态过程的重要关键生理参数。暴露于急性和慢性亚致死缺氧减少某些水生昆虫的生长率，降低暴露1昆虫的生存。该协议的开发提供一个可控的方法来操纵溪水DO水平，观察动物行为的影响。由于所有的有氧水生生物的生存，为了生存和繁殖依赖于氧浓度，溶解氧浓度的变化往往反映在生物行为变化。更多的移动水生无脊椎动物和鱼类已观察到寻求语言环境具有较高的DO 2,3低氧浓度（缺氧）响应。对于流动性较差的水生生物，行为适应增加DO的摄入量可能是唯一可行的选择。 PLEC的水生底栖动物秩序的OPTera（StoneFly的）已被指出以执行“上推”运动，以增加水中的氧的流量，和吸收，在其外部鳃4 - 6。这些适应性行为已在自然的环境，并在实验室实验中观察到。
在水中溶解氧的实验室操作开辟了动物行为研究显著的机会，但在方法上部署显著存在差距。例如，一项研究使用的大型水族馆评估以下用氮气脱气大嘴低音的生理响应时间（ 加州鲈 ）缺氧的环境中，但很少详细给出的方法7。使用氮气和多孔石将气体输送到水，减少水分8 DO描述上斑马鱼（ 斑马鱼 ）进行的另一项研究。对于基于化学的应用程序，对于溶剂的脱气方法使用专门的设备9 - 11从溶剂除去氧气，但不会是适合动物行为的研究。虽然这些研究采用的方法来从水中除去氧气，没有描述的方法可以查明将允许对动物行为评价响应于DO变化。
下面描述这种方法是试图通过使用氮气充分描述了的水的DO操作的协议。此外，这种方法对观察StoneFly的行为（如俯卧撑）之间的关系发展，去做一些在大一级别的生物实验室使用。其中一个这种方法的主要好处是，它可以很容易地与常用玻璃器皿和大多数中等和高等教育机构可获得的材料在实验室内进行。该协议也很容易适应，允许个人扩展，以满足提出的研究或教学应用目标的过程。
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Protocol
注意：这个实验没有使用脊椎动物，因此没有需要由杰尼阿塔学院研究所的动物护理和使用委员会的批准。然而，对于个人适应与脊椎动物使用这种方法，IACUC批准，应寻求。
领域样品采集
- 确定并收集，存储能力评估潜在的野外场地，运输石蝇迅速在1小时过境最大推荐时间减少在途时间。
- 在选定的领域站点执行球网采样下列标准球网的程序足够的时间来收集至少35石蝇12。
- 收集50升流的水和岩石的与流2厘米的最大直径。
- 放置水族馆中设定为数据流部位的温度的冰箱。在分发流现场收集到的岩石和水族馆，每水族馆4升溪水填补。将20每水族馆-30收集石蝇和放置连接到水族馆鼓泡到每个罐中鼓泡石和打开鼓泡向室内空气连续地添加到水中。
- 允许石蝇调整到在水族馆的48小时期间新的环境。
图1.为溶解氧操作。（A）1）安装铜管男性软管倒钩2）塞密封的位置，以检查确保密封性好烧瓶中。 （B）1）2 L侧臂烧瓶装满1.9升水2）气体管和分别空气鼓泡器（蓝色），于氮气鼓泡和房间空气鼓泡使用，3）氮罐和衡量值4）2升烧瓶洋溢着0.4升的水与真空管淹没5）溶解氧测定仪。 请点击这里查看该图的放大版本。
2.实验设置
- 上的台顶，一个标准的薄壁真空管连接到2L侧臂烧瓶的侧臂如图所示（ 图1B 1）。
- 与3升的塑料容器保持收集流水在冰箱设置为12℃的1.9升流的水的填充烧瓶中。
- 放在一个托盘大到足以容纳周围的侧臂瓶冰浴不遮挡烧瓶内部的看法和填充用冰托盘中的烧瓶和油管。
- 钻两个直径3mm的孔的橡胶塞，以允许1）的铜管的通道，以输送气体到容器和2）的DO计， 如图1B中的探头插入2升侧臂烧瓶（1） 。
- 使从塞子的边缘的横向切口的孔中的一个，以使DO探头的导线的座位到塞子。
- 连接耦合器带有3毫米公软管倒钩（ 图1A 1）一块直径为2毫米铜管。确保该管足够长以10厘米烧瓶底部的内达到通过塞子到达时间。
- 放置管具有耦合器虽然在止动件的第二孔，直到从止动件的底部的长度是足够到10cm烧瓶底部的内达到。
- 连接0.75米长，薄壁聚乙烯燃气管的直径为3mm到管道上的耦合器。
- 两者DO探头和铜管滑入烧瓶中并密封与止动烧瓶。
- 检查塞子和烧瓶，以及管和塞子中的探针导线之间的紧密配合之间的安全密封。
- 补的1L烧瓶加入0.4升的自来水，并放置相邻的冰浴，并在真空烧瓶中的托盘。
- 淹没聚乙烯管从大保温瓶来进1升烧瓶中的水。固定用胶带管，使得其将通过实验保持浸没。
- 从保温瓶3毫米直径的天然气管线连接到一个水族馆室内空气鼓泡。在水族馆起泡器，它引入了室内空气和氧气送到堵水开始泡在2升烧瓶上的水。
- 监控溶解氧浓度及水分的温度与DO仪5分钟，或直至溶解氧的平衡在腔室内建立，使得在溶解氧很少改变正在发生。
3.测试实验装置的稳定性
- 测试每个设置为之前除了石蝇的DO稳定性。
- 添加三个或四个石头到2升瓶，使石蝇有基材利于俯卧撑。
- 通过从鼓泡断开气体管，并将其附加到氮气行开始的DO的试用操作。
- 开始在立方英尺每小时（CFH）20约40氮气鼓泡秒至1分钟。
- 一旦溶解氧已0.5毫克/升的目标浓度的内下降到时，流程降低到15 CFH和允许的浓度降低到目标。
- 立即停止氮气流下一旦达到目标浓度。
- 使用水族馆室内空气鼓泡至浓度返回到目标浓度如果溶解氧减小低于目标。
- 如果做一套行动的测试过程中是不稳定的再检查水量仍处于1.9 L和没有水已经起泡了，水温稳定，不改变，并在所有接头密封显得紧，密封。
- 一旦三个试验已经完成，并实验者在控制DO的能力有信心，附加气体线起泡和气泡再平衡。
- 泡到平衡通过附加3mm直径的气体管线的水族馆起泡和开始加入室内空气的到水中，直到浓度氧气在水中不增加或更改3分钟。
- 一旦处于平衡状态，停止冒泡和启封烧瓶。
4. StoneFly的俯卧撑实验
- 由观察员人数除以石蝇的总数确定试验来执行的数目。
- 确定2和10毫克/升之间不同DO水平来评价石蝇的行为反应（俯卧撑的数量）。
- 设置每试验一锥形瓶并添加石蝇的数目相等，因为有观察员至烧瓶（该设计内4石蝇），探针和管放回烧瓶，然后重新密封的橡胶塞的烧瓶中。
注：初始DO为10mg / L浓度被选为第一个观察点，因为它是流从其中石蝇进行取样的溶解氧浓度。 - 一旦水是在10毫克/升通过鼓泡以下步骤2.10-2.11，记录开始水温，并允许石蝇附加到烧瓶中的岩石基体。
- 仅指派一名观察员观看一个StoneFly的保证俯卧撑的行为，这是由StoneFly的表现上下肢体动作计数准确。
- 算并记录在3分钟的观察期的过程中观察到的俯卧撑的数目。
- 操纵DO到下一个试验的DO水平，并重复3分钟的观察期，附加的实验水平。
注意：在这个实验设计，三个不同的DO水平进行了评价。
5.统计分析
- 向在一组为给定的DO试验执行在四个石蝇俯卧撑的统计分析使用平均数。
- 使用免费的R统计计算软件12在俯卧撑和使用每个实验试的顺序DO浓度的数量进行方差分析的分析（DO级）和温度COVariates。分析DO作为单个因素的离散电平。
- 使用残差的安德森-达林正态性检验，检查正常13。
- 通过绘制针对DO浓度俯卧撑的平均数对数据执行线性回归。
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Representative Results
所描述的设置六个试验是由24新生本科生教学实验室环境进行量化石蝇响应不同的溶解氧浓度的水进行俯卧撑的数量。俯卧撑的DO水平内，每个试验中进行的平均数为汇集暗算溶解氧水平俯卧撑如图2所示 。方差分析进行最初利用溶解氧浓度，试验的顺序，温度，以及所有的变量之间的相互作用。结果显示，只有做浓度显著影响由石蝇进行俯卧撑的数量（R 2 ADJ。= 0.322，P = 0.004），并没有其他的变量或相互作用俯卧撑的显著预测。在这种分析中使用的所有数据证实了使用安德森 - 达林检验常态。
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图2.通过试验分组进行石蝇俯卧撑平均数暗算的溶解氧浓度。这显示了显著负相关关系（R 2 ADJ。= 0.322，P = 0.004），俯卧撑和溶解氧浓度（斜率-6.063）。红色数字表示了试验水温（以°C）。的温度分别在3个分试用期稳定，但在整个实验不同的。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充编码文件 ： 用于统计分析R代码里面 请点击此处下载本文件。
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Discussion
关键步骤
这个程序提供了一个简单而有效的方式来操作DO在实验室环境对水生生物进行行为研究。我们发现有以几个关键步骤/项意识到执行该实验是直接相关的结果时的感觉。在一个试验中，它是保持室压力，以避免在水上方的气体的分压的变化的关键，和随后的DO波动。按照协议的“试实验装置的稳定”小节中所列的步骤是关键的。检查与烧瓶塞子的密封，保证真空管的完全浸没到水的1升烧瓶中（以防止室内空气的倒流）和座位的气体管线和DO电线密封与挡块可以帮助保持稳定的室内环境。此外，在腔室最大化的水的体积是必要的范围内提高溶解氧的稳定性因为我们已经发现，在不稳定的和不稳定的DO操作太少体积结果的试验。
在腔室维持水温当务之急是内部DO水平的良好的控制。尽管我们可以保持个人组实验中冷的水温，在不同的试验温度有些变化最小，很明显（ 图2）。由于我们的整体温度范围为低（11.8-13.5˚C）和典型的范围内的石蝇，它并没有被证明是我们的StoneFly的俯卧撑模型显著的预测。然而，水的温度是众所周知的效果14,15水的氧饱 和度的潜力，并没有保持室内水温会对DO水平直接影响。凭借良好的密封性，水货量充足，稳定的水温，内室压力和DO容易DO整个审判之间的实验和控制保持为s表和可重复性。
限制和修改
该实验的两个潜在的局限性是腔室的大小和观察期的长度。的水（〜2L）和在腔室的颈部小开口的体积限制了可用于生物能的大小。在这个规模，该协议将允许石蝇其他无脊椎动物，两栖类，和较小的鱼类容易替代，但并不适用于较大的生物体（ 即食肉性鱼类，章鱼）。然而，这将是可能的，通过使用较大的玻璃器皿，并适应整体协议，以满足不同的学习/研究目标与较大的生物体扩展这个实验上。另外，由于在2升烧瓶小颈部尺寸选择玻璃器皿时在该腔室为较大的生物体所需要的任何基材应该予以考虑。在我们的实验小河里的石头收集与石蝇和提供了充足的腔S ubstrate的石蝇进行俯卧撑。
在很短的时间观测周期内室条件保持以最小的波动，但不确定性依然存在约更长的观察期。利用在协议中，腔室的水的温度所概述的3分钟的观察期和DO水平保持在恒定值。我们能够保持DO和水温达5分钟的观察期，但在10分钟长的观察期，水的温度在腔室开始上升。在当前的协议，它是不可行的延伸超过5分钟的观察期。然而，适应于当前的协议（例如，使用的气候受控的房间）可以允许提高的水的温度的长期稳定性。另外，观测时间与环境水条件（温度，溶解氧，分压）的更强大的和详细的分析，将有助于确定限制因素。
内容“>该协议必须被修改（如上所述），以满足许多不同的需求和目标的能力。一个附加的修改现有的协议将起泡系统的变形例。虽然我们利用仅仅一个小铜管泡了水，我们也注意到，在添加大量的氮气气泡往往逐出他们在河石保留的石蝇，并给他们送去浮动室周围，我们试图使用冒泡石更均匀散布氮气的，但发现没有搅动足以均匀分散的氮气，产生的腔室内低氧条件列中的腔室的水。氮气输送系统的进一步改进可提供有用的见解，并删除撞出石蝇的电位变乱从DO试验间基材。意义和应用前景
这个实验是首开先河在CLUDE一个详细的协议的发展来操纵在实验室环境对动物行为观察DO水平。而其他已发表 的工作建议使用氮气来操纵DO水平7,8,16，方法细节不足被给予允许进行复制。在此协议开发的兴趣，从我们的愿望操纵DO水平，并观察动物的行为在杰尼阿塔学院本科入门生态实验室使用朵朵。在班级的24名学生，该协议被证明具有不同DO级别和学生团体在各试验可重复。此外，该协议提供了一种非常方便和成本有效的方式来操作的实验室实验DO水平。
虽然该协议是为在教学实验室与石蝇使用专门开发的，它可以很容易地适应其他目标。更具体地说，该协议可以很容易地与其它小的水生用于无脊椎动物，鱼，甚至两栖动物取决于所感兴趣的物种。该订单Amphipodia的实例成员，增加响应于低氧17其机车活性可以使用，或金鱼（ 鲫鱼），该展览期间低氧条件16在水表面“囫囵吞枣”的行为。此外，水生生物的不同生命阶段也可以使用此协议，用于帮助促进我们整个发展有机体需氧量理解。该协议也可以利用通过与两栖动物如mudpuppies（Necturus maculosus）18实验来研究对缺氧的生化反应。此外，该协议可以上下大小按比例增加，以满足较大或较小的生物和教学或研究应用的需求。虽然我们认为，协议和具体应用本身广泛的生态利益，这protoco的最大力量l为它提供了跨分类群和实验目标一个很好的基础的发展。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter flask 2 L | Pyrex | 5340 | |
| Rubber Stopper size 6 | Sigma-Aldrich | Z164534 | |
| Nalgene 180 Clear Plastic Tubing | Thermo Scienfitic | 8001-1216 | |
| Whisper 60 air pump | Tetra | ||
| Standard flexible Air line tubing | Penn Plax | ST25 | |
| 0.25 inch Copper tubing | Lowes Home Improvement | 23050 | |
| Male hose barb | Grainger | 5LWH1 | |
| Female Connector | Grainger | 20YZ22 | |
| Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter | Extech | 407510 | |
| Nitrogen gas | Matheson TRIGAS | ||
| Radnor AF150-580 Regulator | Airgas | RAD64003036 |
References
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