גישה פשוטה מניפולציות חמצן מומס לתצפיות התנהגות בעלי החיים

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט לשחזור כדי לתפעל תנאי חמצן מומסים במעבדת הגדרה ללימודי התנהגות בעלי החיים. פרוטוקול זה יכול לשמש הוא הגדרות הוראת מעבדת המחקר להעריך תגובה האורגניזם של חסרי חוליות, דגים, דו-חיים או לשינויים בריכוז חמצן מומס.

Abstract

היכולת לתפעל חמצן מומס (DO) במעבדת הגדרה יש משמעות ישומית לחקור מספר שאלות התנהגות אקולוגיות האורגניזם. הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה פשוטה, לשחזור, ומבוקר לתמרן לעשות כדי ללמוד תגובה התנהגותית באורגניזמים ימיים הנובעות מחוסר חמצן ותנאי anoxic. בעת ביצוע degasification מים עם החנקן הוא נפוץ הגדרות במעבדה, אין שיטה מפורשת לשימוש אקולוגי (מימי) קיימת בספרות, ואת הפרוטוקול זה הוא ראשון שתאר פרוטוקול degasify מים להתבונן בתגובה האורגניזם. טכניקת פרוטוקול זה פותחו עבור יישום ישיר עבור חסרי חוליות ימיות; עם זאת, דגים קטנים, דו-חיים, ובעלי חוליות מימיות אחרות לא יוכל להחליף בקלות. זה מאפשר מניפולציה קלה של רמות DO הנעה בין 2 מ"ג / L עד 11 מ"ג / L עם יציבות עד לתקופת חיה בטחונית 5 דקות.מעבר לכל טמפרטורות מי תצפית תקופה של 5 דקות החלו לעלות, וב -10 דקים 'DO הרמות הפכו יציבות מכדי לשמור. הפרוטוקול הוא ניתן להרחבה עד האורגניזם המחקר, לשחזור, אמין, המאפשר יישום מהיר לתוך מעבדות הוראת היכרות ויישומי מחקר ברמה גבוהה. התוצאות הצפויות של טכניקה זו צריכות להתייחס מומסות שינויי חמצן תגובות התנהגותיות של אורגניזמים.

Introduction

חמצן מומס (DO) הוא פרמטר physiochemical מפתח חשוב בתיווך מספר התהליכים ביולוגיים ואקולוגיים בתוך מערכות אקולוגיות מימיות. חשיפה לסיכוני היפוקסיה תת-קטלנים חריפה וכרונית להפחית את שיעורי צמיחת חרקים ימיים מסוימים ולהפחית את ההישרדות של חרקים חשופים ^1. פרוטוקול זה פותח כדי לספק שיטה מבוקרת לתפעל רמות DO במים זרמו בבחינת ההשפעות על התנהגות בעלי חיים. מכיוון שכל ההישרדות 'אורגניזמים הימיים האירוביים תלויה בריכוז החמצן כדי לחיות ולהתרבות, שינויים בריכוזים של DO משתקפים לעתים קרובות שינויים התנהגותיים על ידי אורגניזמים. עוד חסר חוליות ודגים ניידות מימיות נצפו להגיב ריכוזי חמצן נמוכים (חוסר חמצן) על ידי מבקשי אזורים עם DO הגבוה ^2,3. לאורגניזמים מימיים ניידים פחות, עיבודים התנהגותי להגדיל את הצריכה של DO עשויה להיות האפשרות המעשית היחידה. צו macroinvertebrate המימי של Plecoptera (Stonefly) כבר ציין לבצע תנועות "שכיבות למעלה" כדי להגביר את זרימת המים, ספיגת החמצן, על פני הזימים ⁴ החיצוני שלהם ^{- 6.} התנהגויות מסתגלות אלו נצפו בסביבות טבעיות בניסויי מעבדה.

מניפולציה מעבדה של DO במים פותחת הזדמנויות משמעותיות ללימודי התנהגות בעלי חיים, אך פערים משמעותיים פריסה מתודולוגית להתקיים. לדוגמא, מחקר אחד המשמש לאקווריום גדול כדי להעריך את זמן תגובה הפיזיולוגי של בס Largemouth (salmoides Micropterus) לסביבות היפוקסי הבאים בגז עם חנקן, אבל פרט דל ניתן לחישוב על פי השיטה ^7. מחקר נוסף מבוצע על דג הזברה (Danio rerio) מתואר באמצעות גז חנקן אבן נקבובית לספק גז מים ולהפחית את DO של המים ^8. עבור יישומים מבוססי כימיה, שיטות degasification ממס לנצל מיוחדותמנגנון ^{9 - 11} כדי להסיר חמצן ממסים, אבל לא יהיה מתאים מחקרי התנהגות בעלי החיים. בעוד שמחקרים אלה מפעילים שיטות להסרת חמצן ממים, אין שיטה תיאורי ניתן היה לזהות שתאפשר הערכה של התנהגות בעלי חיים בתגובה DO שינויים.

שיטה זו המתוארת להלן היא ניסיון מתארים פרוטוקול מלא עבור מניפולציה של DO של מים באמצעות גז חנקן. יתר על כן, שיטה זו פותחה כלפי התבוננות יחסים בין התנהגות Stonefly (שכיבות שמיכה) ולעשות כי הועסק במעבדה לביולוגיה בכיתה ט 'ברמה. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו היא שהיא יכולה להתבצע בקלות בתוך מעבדה עם זכוכית משותפת וחומרים ונגישים ביותר במוסדות להשכלה תיכוניים וגבוהים. הפרוטוקול הוא גם להתאמה בקלות, ומאפשר לאנשים לטפס על ההליך כדי לעמוד ביעדים שנקבעו עבור יישומי מחקר או הוראה.

Protocol

הערה: ניסוי זה לא להשתמש חוליות ולכן לא טעונה אישור מכון של מכללת Juniata לטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש. עם זאת עבור אנשים התאמת שיטה זו לשימוש עם חוליות, אישור IACUC יש לחפש.

אוסף דוגמאות שדה 1.

1. לקבוע ולהעריך אתרי שדה פוטנציאל היכולת לאסוף, לאחסן stoneflies התחבורה במהירות כדי למזער את הזמן במעבר עם זמן מקסימאלי מומלצת במעבר של 1 שעה.
2. בצע דגימה נטו בעיטה באתר השדה שנבחר בעקבות הליכים סטנדרטיים בעיטה-נטו מספיק פעמים כדי לאסוף לפחות 35 stoneflies ^12.
3. אסוף 50 ליטר של זרם מים וסלעים בקוטר מקסימאלי של 2 סנטימטרים מזרמים.
4. מניח אקווריומים במקרר מוגדר הטמפרטורה של אתר הנחל. פזר סלעים שנאספו באתר זרם לתוך אקווריומים ולמלא עם 4 ליטר מים זרם לכל אקווריום. מקום 20-30 Stoneflies שנאספו לכל אקווריום ומניחים אבן מבעבע מצורף bubbler אקווריום לתוך כל טנק ולהדליק bubblers להוסיף ברציפות באוויר חדר אל המים.
5. אפשר stoneflies כדי להסתגל לסביבה החדשה אקווריומים לתקופת 48 שעות.

איור 1. גדר עבור מניפולצית חמצן מומסת. (א) 1) נאוה צינור נחוש צינור זכר עקיצה 2) מיקום של חותם פקק לבחון להבטחה גם איטום בקבוק. (ב) 1) 2 L בצד זרוע מולא בקבוק עם 1.9 ליטר מים 2) צינור גז bubbler האוויר (כחול) לשימוש מבעבע חנקן מבעבע אוויר בחדר, בהתאמה 3) מיכל חנקן וערכים יעידו 4) 2 בקבוק L מלא 0.4 ליטר של מים עם מד חמצן 5) מומס צינור ואקום שקוע. נא ללחוץ כאןלצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. ניסיוני להגדיר

1. על גבי ספסל, לחבר צינור ואקום תקן חומה לזרוע בצד של בקבוקון 2 L בצד הזרוע כמו מוצג (1 באיור 1B).
2. מלאו את הבקבוק עם 1.9 ליטר מים זרם ממיכלי פלסטיק 3 L מחזיק מים זרם שנאספו במקרר להגדיר עד 12 מעלות צלזיוס.
3. מניח את הבקבוק, אבובים על מגש גדול מספיק כדי להכיל באמבט קרח סביב הבקבוק בצד הזרוע מבלי להסתיר את התצוגה של פן הבקבוק ולמלא את המגש עם קרח.
4. מקדחה שני חורים בקוטר 3 מ"מ פקק גומי כדי לאפשר מעבר של 1) צינור נחושת כדי לספק את הגז לכלי השיט ו -2) החללית המטר DO לתוך הבקבוק 2 L בצד הזרוע (1 באיור 1B) .
5. ביצוע חתך לרוחב מהקצה של פקק לאחד החורים כדי לאפשר ישיבה של החוט של חללית DO לתוך הפקק.
6. חבר מצמד עם צינור זכר 3 מ"מעקיצה אל חתיכת צינור נחושת בקוטר 2 מ"מ (1 באיור 1A). ודא כי צינור זה מספיק זמן כדי להגיע עד למרחק של 10 ס"מ של החלק התחתון של הבקבוק תוך הגעה באמצעות פקק.
7. מניחים את הצינור עם מצמד למרות החור השני פקק עד אורך מעומק את הפקק הוא מספיק כדי להגיע עד למרחק של 10 ס"מ של החלק התחתון של הבקבוק.
8. חבר צינור גז פוליאתילן 0.75 מ 'אורך, קירות דק בקוטר של 3 מ"מ עד המצמד על הצינור.
9. חלק השנייה חללית DO הצינור נחושת לתוך הבקבוק ואת החותם את הבקבוק עם הפקק.
10. בדקו חותם מאובטח בין הפקק ואת הבקבוק, כמו גם להתאמה הדוקה בין הצינור ואת חוט הבדיקה בתוך הפקק.
11. מלאו בקבוק 1 ליטר עם 0.4 ליטר של מים ברז ומניחים סמוכים המגש עם אמבט הקרח ירמוס.
12. להטביע את צינור פוליאתילן מאגף תרמוס הגדול למים של בקבוק L 1. אבטח אתצינור עם קלטת כזאת שזה יהיה להישאר תחת מים דרך הניסוי.
13. חבר את קו הגז בקוטר 3 מ"מ מבקבוק הוואקום אל bubbler אקווריום בחדר-אוויר. בגין לבעבע המים בבקבוק 2 ליטר ידי חיבור bubbler אקווריום, אשר מציגה אוויר בחדר וחמצן אל המים.
14. לפקח על ריכוז DO וטמפרטורת המים עם מד DO במשך 5 דקות או עד שיווי המשקל של DO מוקם בתוך החדר כך השינוי קטן DO מתרחש.

3. בדיקת יציבות של עד ניסיוני Set

1. בדוק כל התקנת יציבות DO לפני התוספת של stoneflies.
2. מוסיף שלוש או ארבע אבנים אל בקבוק 2 L, כך יש stoneflies מצע תורם שכיבות שמיכה.
3. בגין מניפולציה משפטו של DO ידי ניתוק צינור הגז מן bubbler מצרף אותו אל קו גז חנקן.
4. בעבוע חנקן ב 20 רגל מעוקב לשעה (CFH) למשך כ 40שניות עד 1 דקות.
5. לאחר DO ירד בתוך 0.5 מ"ג / L של ריכוז היעד, להפחית את זרימת עד 15 CFH ולאפשר ריכוז כדי להקטין אל המטרה.
6. הפסקת זרימת החנקן מייד לאחר ריכוז היעד הוא הגיע.
7. השתמש bubbler חדר-אוויר באקווריום להחזיר את הריכוז לריכוז היעד אם DO יורדת מתחת ליעד.
8. אם DO אינו יציב במהלך הבדיקה של הגדרה ולאחר מכן לבדוק את נפח המים עדיין על 1.9 L ולא מים מחלחלים, טמפרטורת מים היא יציבה ולא משתנה, וחותם על כל האביזרים להיראות חזק ואטום.
9. לאחר שלושה ניסויים בוצעו ואת הנסיין יש ביטחון ביכולת לשלוט DO, לצרף את קו הגז bubbler ואת הבועה לשיווי משקל שוב.
10. הבועה לשיווי משקל על ידי הצמדת צינור גז בקוטר 3 מ"מ bubbler אקווריום ומתחיל תוספת של אוויר בחדר למים עד ריכוז שלהחמצן במים אינו מעלה או לשנות במשך 3 דקות.
11. לאחר בשיווי משקל, להפסיק המבעבעים unseal הבקבוק.

4. ניסוי שכיבות סמיכה הגיעו Stonefly

1. מחלקים את המספר הכולל של stoneflies במספר משקיפים כדי לקבוע את מספר הניסויים לבצע.
2. קביעת רמות DO שונות בין 2 ל -10 מ"ג / L על מנת להעריך את התגובה ההתנהגותית של stoneflies (מספר שכיבות שמיכה).
3. הגדרת בקבוק אחד לכל ניסוי ולהוסיף מספר שווה של stoneflies שכן ישנם משקיפים אל הבקבוק (4 stoneflies בתוך עיצוב זה), מניחים את החללית ואת הצינור בחזרה לתוך הבקבוק, ואז לאטום את הבקבוק עם פקק גומי.
   הערה: ראשוני לעשות ריכוז של 10 מ"ג / L נבחר כנקודת התצפית הראשונה מאז זה היה הריכוז DO של הנחל מאיפה נדגמו stoneflies.
4. לאחר שהמים נמצאים במרחק של 10 מ"ג / L ידי מבעבע ביצוע שלבי 2.10-2.11, להקליט את טמפרטורת המים החל ולאפשרstoneflies כדי לצרף מצע הרוק בבקבוק.
5. קצה רק אחד הצופה לצפות Stonefly אחד, כדי להבטיח ספירה מדויקת של התנהגות פוש-אפ, שהיא התנועה למעלה ולמטה הגוף הוצגה על ידי Stonefly.
6. הרוזן ולהקליט את מספר שכיבות סמיכה שנצפו במהלך תקופת תצפית 3 דקות.
7. המניפולציות לעשות כדי לשלב הבא ניסיוני DO וחזור 3 תקופת תצפית דקות עבור רמות הניסיוני הנוספות.
   שים לב: במסגרת תכנון הניסוי הזה, שלוש רמות DO שונות הוערכו.

5. ניתוח סטטיסטי

1. כדי לבצע שימוש בניתוח סטטיסטי המספר הממוצע של שכיבות סמיכה על פני ארבע stoneflies פני קבוצה למשפט DO נתון.
2. השתמש בתוכנת מחשוב סטטיסטי חינם R ¹² לבצע ניתוח שונות (ANOVA) על מספר שכיבות סמיכה ועל ריכוזי DO באמצעות הסדר של כל בדיקה ניסיונית (DO רמה) ואת הטמפרטורה כמו covariates. נתח DO כמו רמות דיסקרטיות של גורם יחיד.
3. השתמש מבחן נורמליות אנדרסון-דרלינג על שאריות לבדוק לנורמליות ^13.
4. בצע רגרסיה ליניארית על נתונים על ידי התוויית המספר הממוצע של שכיבות סמיכה כנגד ריכוזי DO.

Representative Results

ששת הניסויים של ההתקנה המתואר בוצעו על ידי 24 תלמידי שנה א סטודנטים לתואר ראשון במעבדה הגדרה ההוראה לכמת את מספר שכיבות סמיכה stoneflies לבצע בתגובה ריכוז DO שונים במים. המספר הממוצע של שכיבות סמיכה ביצע בתוך רמה DO ובתוך כל ניסוי היה ונקווה לתכנן שכיבות סמיכה נגד רמת DO באיור 2. ANOVA בוצע בתחילה ניצול ריכוז DO, בסדר רציף של ניסויים, טמפרטורה, וכן יחסי הגומלין בין כל המשתנים. מהתוצאות עולה כי רק לעשות ריכוז משמעותי השפיעו על מספר שכיבות סמיכה בביצוע stoneflies (R ² adj. = 0.322, p = 0.004) ולא אינטראקציה משתנה או אחרים היה מנבא משמעותי של שכיבות שמיכה. כל הנתונים המשמשים בניתוח זה אושר לנורמליות באמצעות מבחן אנדרסון-דרלינג.

התוכן "FO: keep-together.within-page =" 1 ">
איור 2. המספר הממוצע של שכיבות סמיכה בביצוע stoneflies מקובצים לפי המשפט זממו נגד ריכוז החמצן המומס. זה מראה קשר שלילי משמעותי (R ² adj. = 0.322, p = 0.004) בין שכיבות סמיכה וריכוז החמצן המומס (שיפוע -6.063). מספרים אדומים מציינים טמפרטורת מים (במעלות צלזיוס) למשפט. הטמפרטורות היו יציבות בין 3 תקופות ניסיון דק, אבל מגוונת ברחבי הניסוי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קובץ קוד משלימה:. קוד R עבור הניתוחים הסטטיסטיים אנא לחץ כאן כדי להוריד את זהקוֹבֶץ.

Discussion

צעדים קריטיים
הליך זה מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לתפעל DO במעבדת הגדרה לבצע מחקרים התנהגותיים על אורגניזמים ימיים. מצאנו שם כדי להיות מספר צעדים / פריטים קריטיים להיות מודע בעת ביצוע הניסוי הזה קשור ישירות את התוצאות. זוטא, הוא קריטי כדי לשמור על הלחץ הקאמרי להימנע משינויי הלחץ החלקי של גזים מעל פני המים, ולאחר DO תנודות. בעקבות הצעדים המפורטים בסעיף "בדיקת יציבות של סביבת הניסוי" קטן של הפרוטוקול הוא קריטי. בדיקת החותם של פקק עם הבקבוק, הבטחת השקיעה מלאה של צינורות ואקום לתוך הבקבוק 1 ליטר מים (כדי למנוע זרימה חוזרת של אוויר החדר), ומקומות ישיבה קו הגז ולעשות חוט חותם עם פקק יכול לעזור לשמור על יציבות סביבה קאמרית. בנוסף, למקסם את נפח המים בתא יש צורך לשפר את היציבות של DO בתוךמשפט כפי שמצאנו כי תוצאות נפח מעט מדי מניפולציות DO לא יציב ולא יציב.

שמירת מי טמפרטורה בתא הכרחית לאיזון טוב של רמות DO הפנימיות. בעוד הצלחנו לשמור על טמפרטורת מים קרים בתוך ניסויים קבוצה הפרט, וריאציה מינימלי כלשהו הטמפרטורה על פני ניסויים שונים ניכרה (איור 2). מאז המגוון של טמפרטורות הכוללת שלנו היה נמוך (11.8-13.5˚C) ובתוך הטווח האופייני stoneflies, היא לא הוכיחה להיות מנבא משמעותי במודל שלנו עבור שכיבות שמיכת Stonefly. עם זאת, טמפרטורת מים ידועה להשפיע על פוטנציאל רוויון חמצן של מים ^14,15, ולהיכשל כדי לשמור על טמפרטורת מים קאמרית תצטרך משפיע באופן ישיר על רמות DO. עם אטימה טובה, נפח נאות של מים, טמפרטורת מים יציבה, לחץ קאמרי פנימי ולעשות נשמר בקלות לאורך הניסוי והבקרה של DO בין הניסויים הוא sשולחן לשחזור.

מגבלות ושינויים
שתי מגבלות פוטנציאל של הניסוי הזה הן בגודל של החדר ואת אורך תקופת המעקב. נפח המים (~ 2 L) פתח קטן בצוואר של החדר מגביל את גודל האורגניזם מסוגל לשמש. בקנה המידה הזה, הפרוטוקול יאפשר החלפה קלה של stoneflies עבור חסר חוליות אחרות, דו-חיים, ודגים קטנים יותר, אך לא יהיה ישים עבור אורגניזמים גדולים יותר (כלומר, דגים טורפים, octopi). עם זאת, ניתן יהיה לשנות את קנה המידה הניסוי הזה עד באמצעות כלי זכוכית גדול יותר, והתאמת פרוטוקול הכולל כדי לעמוד ביעדים למידה / מחקר שונים עם אורגניזמים גדולים יותר. בנוסף, כל מצע הנדרש לתא של אורגניזמים גדולים יותר צריך להילקח בחשבון בעת ​​בחירת כלי זכוכית בשל גודל צוואר קטן ב -2 בקבוק L. בניסוי שלנו-בחלוקי נחל קטנים נאספו עם stoneflies ובתנאי קאמרית בשפע s ubstrate עבור stoneflies לבצע שכיבות שמיכה.

תנאי בתא פנימי לאורך תקופות תצפית זמן קצר היו מתוחזקים עם תנודות מינימאליות, לעומת זאת, חוסר ודאות להישאר על תקופות תצפית יותר. ניצול תקופת מעקב 3 דקות המתוארים טמפרטורת מי הפרוטוקול, קאמרי רמות DO נשמרו על ערכים קבועים. הצלחנו לשמור DO וטמפרטורת מים עד לתקופת תצפית 5 דקות, אבל בכל תקופת תצפית ארוכה 10 דקות, טמפרטורות מים בתא החלו לעלות. בפרוטוקול הנוכחי, זה לא ריאלי להאריך את תקופת התצפית מעבר 5 דקות. עם זאת, עיבודים לפרוטוקול הנוכחי (כגון שימוש בחדר האקלים מבוקר) עלולים לאפשר ליציבות ארוך טווח מוגבר טמפרטורות מים. יתר על כן, ניתוח חזק ומפורט יותר זמן תצפית לעומת תנאי מי סביבה (טמפרטורה, DO, לחץ חלקי) יעזור לקבוע גורמים מגבילים.

תוכן "> פרוטוקול זה יש את היכולת להיות שונה (כאמור לעיל) לפגוש מספר הצרכימים ומטרות שונים. שינוי אחד נוסף לפרוטוקול הקיים יהיה שינוי למערכת המבעבעת. בעוד אנו מנוצלים צינור נחושת קטן בלבד לבעבע המים, עשינו הודעה כי התוספת של בועות גז חנקן הגדולות לעתים קרובות וחלצה את stoneflies מ אחיזתם בחלוקי הנחל ושלחה אותם מרחף בחדר. ניסינו להשתמש אבן מבעבע לפיזור יותר אפילו של גז חנקן , אך נמצא כי המים בתא לא היה נסערים מספיק כדי לפזר את גז החנקן באופן שווה, ותוצאה היא עמודה של תנאי חוסר חמצן בתוך התא. חידוד נוסף של מערכת אספקת גז חנקן עשוי לספק תובנה שימושי, והסר את לבלבל הפוטנציאל של פירוק stoneflies מן המצע בין ניסויי DO.

יישומים משמעות ועתיד
ניסוי זה היה ראשון מסוגו בclude התפתחות פרוטוקול מפורט לתפעל רמות DO להסתכלות בהתנהגות בעלי חיים במעבדה הגדרה. בעוד עבודות אחרות שפורסמו הציעו את השימוש בגז חנקן לתפעל רמות DO ^7,8,16, פרט מתודולוגיים מספיק ניתן כדי לאפשר שכפול. עניין בפיתוח פרוטוקול זה נבע הרצון שלנו לתפעל רמות DO ולבחון התנהגות בעלי חיים לשימוש במעבדת אקולוגית היכרות ברמה במכללת Juniata המכללה. בתוך הכיתה של 24 תלמידים, פרוטוקול זה הוכיח לשחזור פני ניסויים עם רמות שונות DO ולאורך כל קבוצות התלמידים. יתר על כן, פרוטוקול זה מספק דרך רמת נגישות גבוהה, חסכונית לתפעל רמות DO לניסויים במעבדה.

בעוד פרוטוקול זה פותח במיוחד לשימוש עם stoneflies במעבדת הוראה, זה יכול בקלות להיות מותאם עבור מטרות אחרות. באופן ספציפי יותר, פרוטוקול זה יכול לשמש בקלות עם מים קטנים אחריםחסרי חוליות, דגים, דו חיים אפילו בהתאם למין של עניין. לחברי דוגמא הסדר Amphipodia אשר מזרזים פעילות הקטר שלהם בתגובה היפוקסיה ¹⁷ יכול לשמש, או דג זהב (Carassius auratus) כי תערוכת התנהגות "בולעת" על פני המים במהלך תנאי חוסר חמצן ^16. בנוסף,-שלבי חיים שונים של אורגניזמים ימיים יכולים לשמש גם עם פרוטוקול זה כדי לעזור לקדם את ההבנה שלנו של דרישות חמצן האורגניזם במהלך התפתחות. פרוטוקול זה יכול גם להיות מנוצל כדי ללמוד התגובות הביוכימיות היפוקסיה ידי עריכת ניסוי עם דו-חיים כגון mudpuppies (maculosus Necturus) ^18. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות scaled למעלה או למטה בגודל כדי לענות על הצרכים של אורגניזמים גדולים יותר או קטנים יותר ויישומי הוראה ומחקר. למרות שאנו חשים כי הפרוטוקול ואת היישום הספציפי עצמו הוא עניין אקולוגי רחב, כוחו הגדול של protoco זהl הוא בכך שהיא מספקת פיתוח תשתית מצוין בקבוצות טקסונומיות ויעדים ניסיוניים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filter flask 2 L	Pyrex	5340
Rubber Stopper size 6	Sigma-Aldrich	Z164534
Nalgene 180 Clear Plastic Tubing	Thermo Scienfitic	8001-1216
Whisper 60 air pump	Tetra
Standard flexible Air line tubing	Penn Plax	ST25
0.25 inch Copper tubing	Lowes Home Improvement	23050
Male hose barb	Grainger	5LWH1
Female Connector	Grainger	20YZ22
Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter	Extech	407510
Nitrogen gas	Matheson TRIGAS
Radnor AF150-580 Regulator	Airgas	RAD64003036