Summary
Questo articolo descrive un protocollo semplice e riproducibile per manipolare le condizioni di ossigeno disciolto in un ambiente di laboratorio per gli studi di comportamento animale. Questo protocollo può essere utilizzato in entrambe le impostazioni di insegnamento e laboratorio di ricerca per valutare la risposta organismal di macroinvertebrati, pesci, anfibi o alle variazioni di concentrazione di ossigeno disciolto.
Abstract
La capacità di manipolare ossigeno disciolto (DO) in un ambiente di laboratorio ha un'applicazione significativo per indagare su una serie di domande comportamento ecologico e degli organismi. Il protocollo qui descritto fornisce un metodo semplice, riproducibile e controllato per manipolare DO per studiare risposta comportamentale in organismi acquatici ottenuti da ipossia e condizioni anossiche. Durante l'esecuzione di degassificazione di acqua con azoto è comunemente usato in laboratorio, nessun metodo esplicita per ecologica applicazione (acquatico) esiste nella letteratura, e questo protocollo è il primo a descrivere un protocollo per degassano acqua per osservare risposta organica. Questa tecnica e il protocollo sono stati sviluppati per l'applicazione diretta di macroinvertebrati acquatici; Tuttavia, piccoli pesci, anfibi e altri vertebrati acquatici potrebbero essere facilmente sostituiti. Esso consente una facile manipolazione dei livelli DO vanno da 2 mg / L a 11 mg / L con stabilità fino ad un periodo di osservazione animali-5 min.Al di là di un periodo di 5 minuti di osservazione la temperatura dell'acqua ha cominciato a salire, ed a 10 min DO livelli è diventato troppo instabile per mantenere. Il protocollo è scalabile per l'organismo studio, riproducibile e affidabile, consentendo una rapida implementazione in laboratori didattici introduttivi e applicazioni di ricerca di alto livello. I risultati attesi di questa tecnica dovrebbe riferirsi sciolto modifiche ossigeno alle risposte comportamentali degli organismi.
Introduction
ossigeno disciolto (DO) è un parametro fisico-chiave importante nel mediare una serie di processi biologici ed ecologici all'interno degli ecosistemi acquatici. Le esposizioni verso ipossia acuta e cronica sub-letali di ridurre i tassi di crescita in certi insetti acquatici e riducono la sopravvivenza degli insetti esposti 1. Questo protocollo è stato sviluppato per fornire un metodo controllato per manipolare i livelli facciamo in acqua corrente per osservare gli effetti sul comportamento animale. Dal momento che la sopravvivenza tutti gli organismi acquatici aerobici che dipende dalla concentrazione di ossigeno per vivere e riprodursi, i cambiamenti nella concentrazione di DO sono spesso riflettono in cambiamenti comportamentali da parte di organismi. Altri invertebrati acquatici mobili e pesci sono stati osservati per rispondere a basse concentrazioni di ossigeno (ipossia) attraverso la ricerca di locali con una maggiore DO 2,3. Per gli organismi acquatici mobili meno, adattamenti comportamentali per aumentare l'assunzione di DO può essere l'unica opzione praticabile. L'ordine di macroinvertebrati acquatici di PlecOPTera (Stonefly) è stato notato per eseguire movimenti "push-up" per aumentare il flusso di acqua, e l'assorbimento di ossigeno, attraverso le loro branchie esterne 4 - 6. Tali comportamenti adattativi sono stati osservati negli ambienti naturali e in esperimenti di laboratorio.
manipolazione Laboratorio di DO in acqua apre notevoli opportunità per gli studi del comportamento animale, ma esistono lacune significative nella distribuzione metodologica. Per esempio, uno studio ha utilizzato grandi acquari per valutare il tempo di risposta fisiologica di persico trota (Micropterus salmoides) per ambienti di ipossia seguito gassificazione con l'azoto, ma i dettagli scarsa è dato per la metodologia 7. Un altro studio condotto su Zebra pesce (Danio rerio) descritta utilizzando gas di azoto e una pietra porosa per fornire il gas per l'acqua e ridurre il DO dell'acqua 8. Per applicazioni chimica basata, metodi per la degasificazione di solventi utilizzano specializzatoApparecchi 9 - 11 per rimuovere ossigeno da solventi, ma non sarebbe adatto per studi sul comportamento animale. Mentre questi studi impiegano metodi per rimuovere ossigeno da acqua, nessun metodo descrittivo potrebbe essere identificato che permetterebbe valutazione del comportamento animale in risposta ai cambiamenti DO.
Questo metodo descritto qui di seguito è un tentativo di descrivere completamente un protocollo per la manipolazione di DO di acqua utilizzando gas azoto. Inoltre, questo metodo è stato sviluppato verso osservando le relazioni tra comportamento Stonefly (flessioni) e DO che è stato impiegato in un laboratorio di biologia a livello di matricola. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che può facilmente essere eseguita all'interno di un laboratorio con vetro e di prodotti accessibili alla maggior parte degli istituti di istruzione secondaria e superiore comune. Il protocollo è anche facilmente adattabile, permettendo alle persone di scalare la procedura per raggiungere gli obiettivi stabiliti per le applicazioni di ricerca e di insegnamento.
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Protocol
Nota: Questo esperimento non ha utilizzato i vertebrati e quindi non richiede l'approvazione da parte dell'Istituto di Juniata College for Animal Care e del Comitato Usa. Tuttavia per gli individui adattano questo metodo per l'utilizzo con i vertebrati, l'approvazione IACUC dovrebbe essere cercato.
1. Campo Raccolta del campione
- Determinare e valutare potenziali siti di campo per la capacità di raccogliere, memorizzare e plecotteri trasporto rapidamente per ridurre al minimo il tempo in transito con un tempo massimo raccomandato in transito di 1 ora.
- Eseguire il campionamento calcio-net nel sito campo selezionato seguendo le procedure di kick-net standard di volte sufficiente a raccogliere almeno 35 stoneflies 12.
- Raccogliere 50 L di acqua corrente e rocce con un diametro massimo di 2 cm dai flussi.
- Posizionare acquari in frigorifero è impostato sulla temperatura del sito stream. Distribuire rocce raccolti nel sito di flusso in acquari e riempire con 4 litri di acqua corrente per acquario. Mettere 20-30 Plecotteri raccolti per acquario e mettere un pietra spumeggiante collegato a un gorgogliatore acquario in ogni serbatoio e si accendono bubblers aggiungere continuamente aria ambiente per l'acqua.
- Lasciare le plecotteri per regolare al nuovo ambiente negli acquari per un periodo di 48 ore.
Figura 1. Configurare per la manipolazione di ossigeno disciolto. (A) 1) Raccordo per tubo rame per tubo maschio sbavatura 2) Posizione di tenuta del tappo di esaminare per garantire ben pallone di tenuta. (B) 1) 2 L pallone braccio laterale riempito con 1,9 L di acqua 2) tubo del gas e bubbler aria (blu) per l'utilizzo in gorgogliamento di azoto e camera d'aria spumeggiante, rispettivamente, 3) serbatoio di azoto e valori calibrate 4) 2 L pallone riempita con 0,4 L di acqua con tubo a vuoto sommerso 5) disciolto misuratore di ossigeno. cliccate qui pervisualizzare una versione più grande di questa figura.
2. set up sperimentale
- Su un banco, collegare un tubo a vuoto murata standard al braccio laterale di un pallone braccio laterale 2 L come mostrato (1 nella Figura 1B).
- Riempire il pallone con 1,9 L di acqua corrente da contenitori di plastica 3 L in possesso di flusso di acqua raccolta in frigorifero impostato a 12 ° C.
- Porre il pallone e il tubo su un vassoio abbastanza grande da contenere un bagno di ghiaccio attorno al pallone di braccio laterale senza oscurare la vista dell'interno pallone e riempire il vassoio con ghiaccio.
- Praticare due fori di diametro 3 mm in un tappo di gomma per consentire il passaggio di 1) un tubo di rame per trasportare il gas nel contenitore e 2) la sonda di metro DO nel pallone braccio laterale 2 L (1 nella Figura 1B) .
- Effettuare una incisione laterale dal bordo del tappo ad uno dei fori per consentire sedere del filo della sonda DO nel tappo.
- Collegare un accoppiatore con un tubo maschio 3 millimetriardiglione ad un pezzo di tubo di rame del diametro di 2 mm (1 nella Figura 1A). Assicurarsi che il tubo è abbastanza lungo da raggiungere entro 10 cm dal fondo del pallone mentre raggiunge attraverso il tappo.
- Posizionare il tubo con accoppiatore se il secondo foro nel tappo finché la lunghezza dalla parte inferiore del tappo è sufficiente a raggiungere entro 10 cm dal fondo del pallone.
- Collegare un 0,75 m di lunghezza, sottile tubo parete gas polietilene con un diametro di 3 mm al raccordo sul tubo.
- Far scorrere sia la sonda DO e tubo di rame nel pallone e sigillare il pallone con il tappo.
- Vedi per una tenuta sicura tra il tappo e il matraccio, nonché una perfetta aderenza tra il tubo e la sonda all'interno del tappo.
- Riempire un pallone da 1 L con 0,4 L di acqua di rubinetto e posizionare adiacente al vassoio con il bagno di ghiaccio e pallone di vuoto.
- Immergere il tubo di polietilene proveniente dalla beuta a vuoto su nell'acqua del pallone 1 L. Fissare iltubo con nastro adesivo tale che rimanga sommersa attraverso l'esperimento.
- Collegare la linea del gas diametro di 3 mm dalla boccetta di vuoto ad un gorgogliatore camera con aria acquario. Inizia a bolla l'acqua nel pallone da 2 L collegando il gorgogliatore acquario, che introduce aria ambiente e ossigeno all'acqua.
- Monitorare la concentrazione DO e temperatura dell'acqua con il misuratore DO per 5 minuti o fino a quando si stabilisce l'equilibrio della DO all'interno della camera in modo tale che pochi cambiamenti in DO sta avvenendo.
3. testare la stabilità del set up sperimentale
- Testare ogni setup per DO stabilità prima dell'aggiunta di stoneflies.
- Aggiungere tre o quattro pietre nel pallone 2 L in modo che plecotteri hanno substrato favorevole per flessioni.
- Iniziare una manipolazione di prova di DO staccando il tubo del gas dal gorgogliatore e di collegarlo alla linea del gas di azoto.
- Inizia gorgogliare azoto a 20 piedi cubi per ora (CFH) per circa 40sec a 1 min.
- Una volta che la DO è scesa entro 0,5 mg / L della concentrazione target, ridurre il flusso a 15 CFH e consentire la concentrazione per ridurre al bersaglio.
- Cessate flusso di azoto non appena viene raggiunta la concentrazione target.
- Utilizzare l'acquario bubbler stanza con aria per riportare la concentrazione la concentrazione target se la DO si riduce al di sotto dell'obiettivo.
- Se il DO è instabile durante il controllo di un set-up quindi controllare il volume d'acqua è ancora a 1,9 L e l'acqua non è bollito fuori, la temperatura dell'acqua è stabile e non cambia, e sigilli su tutti i raccordi sembrano essere stretto e sigillato.
- Una volta che tre prove sono state eseguite e lo sperimentatore ha fiducia nella capacità di controllare DO, collegare la linea del gas nel gorgogliatore e bolla all'equilibrio di nuovo.
- Bubble all'equilibrio collegando la linea del gas 3 mm di diametro nel gorgogliatore acquario e iniziare l'aggiunta di aria ambiente in acqua fino alla concentrazione diossigeno nell'acqua non aumenta o cambiate per 3 min.
- Una volta in equilibrio, fermare spumeggiante e unseal del pallone.
4. Stonefly Esperimento Push-up
- Dividere il numero totale di stoneflies per il numero di osservatori per determinare il numero di prove da eseguire.
- Determinare diversi livelli di DO tra 2 e 10 mg / L per valutare la risposta comportamentale di plecotteri (numero di flessioni).
- Impostare un pallone per ogni prova e aggiungere un numero uguale di plecotteri in quanto vi sono osservatori il recipiente (4 stoneflies all'interno di questo disegno), posizionare la sonda e il tubo di nuovo nel pallone, poi richiudere il pallone con il tappo di gomma.
Nota: Un primo DO concentrazione di 10 mg / L è stato scelto come il primo punto di osservazione in quanto era la concentrazione DO del torrente da cui sono stati campionati i stoneflies. - Una volta che l'acqua è a 10 mg / L facendo gorgogliare di seguito i passaggi 2,10-2,11, registrare la temperatura dell'acqua a partire e lasciare laplecotteri da allegare al substrato di roccia nel pallone.
- Assegnare solo un osservatore a guardare un singolo Stonefly per garantire un conteggio preciso del comportamento push-up, che è il movimento del corpo su e giù esibita dal Stonefly.
- Contare e registrare il numero di flessioni osservate nel corso di un periodo di osservazione di 3 min.
- Manipolare DO al livello successivo sperimentale DO e ripetere periodo di osservazione di 3 minuti per i livelli sperimentali aggiuntivi.
Nota: All'interno di questo progetto sperimentale, tre diversi livelli di DO sono stati valutati.
5. Analisi statistica
- Per eseguire numero medio uso l'analisi statistica dei push-up attraverso le quattro plecotteri in un gruppo per un determinato processo DO.
- Utilizzare la libera R software di calcolo statistico 12 per eseguire una analisi della varianza (ANOVA) sul numero di push-up e le concentrazioni di DO con l'ordine di ogni prova sperimentale (DO livello) e la temperatura come COVariates. Analizzato DO come livelli discreti di un singolo fattore.
- Utilizzare un test di normalità di Anderson-Darling residui per verificare la normalità 13.
- Eseguire una regressione lineare sui dati tracciando il numero medio di push-up contro le concentrazioni di fare.
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Representative Results
Sei prove del setup descritto sono stati eseguiti da 24 matricole studenti universitari in un ambiente di laboratorio didattico per quantificare il numero di push-up plecotteri in atto in risposta a differenti concentrazioni DO in acqua. Il numero medio di push-up eseguito all'interno di un livello di DO e all'interno di ogni processo è stato riunito per tracciare push-up contro il livello di DO nella figura 2. Un'ANOVA è stata eseguita inizialmente utilizzando la concentrazione DO, ordine sequenziale di prove, la temperatura, così come le interazioni tra tutte le variabili. I risultati suggeriscono che fare solo la concentrazione significativamente influenzato il numero di push-up eseguiti da plecotteri (R 2 agg. = 0,322, p = 0,004) e nessun altra interazione variabile o era un predittore significativo di flessioni. Tutti i dati utilizzati in questa analisi è stata confermata per la normalità utilizzando un test di Anderson-Tesoro.
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Figura 2. numero medio di push-up eseguiti da plecotteri raggruppati per tentativi tracciata contro la concentrazione di ossigeno disciolto. Questo dimostra una relazione negativa significativa (R 2 agg. = 0,322, p = 0,004) tra il push-up e concentrazione di ossigeno disciolto (pendenza -6,063). numeri rossi indicano la temperatura dell'acqua (in ° C) per una prova. Le temperature sono stabili in 3 periodi min di prova, ma varia in tutto l'esperimento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Supplementare Codice File:. Codice R per le analisi statistiche Clicca qui per scaricarefile.
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Discussion
passaggi critici
Questa procedura fornisce un modo semplice ed efficace per manipolare fare in un ambiente di laboratorio per eseguire studi comportamentali sugli organismi acquatici. Abbiamo trovato lì per essere diversi critici passi / oggetti di essere a conoscenza di quando si esegue questo esperimento che direttamente correlata ai risultati. All'interno di un processo, è fondamentale per mantenere la pressione della camera per evitare variazioni della pressione parziale del gas sopra l'acqua, e la successiva DO fluttuazioni. Seguendo la procedura descritta nel "testare la stabilità del setup sperimentale" sottosezione del protocollo è critica. Controllo il sigillo del tappo con il pallone, assicurando completa sommersione del tubo a vuoto in 1 L boccetta di acqua (per impedire il riflusso di aria ambiente), e posti a sedere la linea del gas e DO guarnizione del legare con il tappo può aiutare a mantenere una stabile ambiente della camera. Inoltre, massimizzando il volume di acqua nella camera è necessario per migliorare la stabilità di DO all'internoun processo che abbiamo trovato che troppo poco i risultati del volume di irregolare e instabile DO manipolazioni.
Mantenere la temperatura dell'acqua nella camera è di importanza fondamentale per il buon controllo dei livelli interni fare. Mentre eravamo in grado di mantenere la temperatura di acqua fredda all'interno di esperimenti di gruppo individuali, qualche variazione minima temperatura attraverso diverse prove era evidente (Figura 2). Dal momento che la nostra gamma globale di temperature è stata bassa (11.8-13.5˚C) e all'interno della gamma tipica per plecotteri, non ha dimostrato di essere un predittore significativo nel nostro modello per flessioni Stonefly. Tuttavia, la temperatura dell'acqua è noto per effettuare il potenziale saturazione di ossigeno dell'acqua 14,15, e non riuscendo a mantenere la temperatura dell'acqua della camera avrebbe impatti diretti sui livelli di fare. Con una buona tenuta, adeguato volume di acqua, e la temperatura dell'acqua stabile, pressione della camera interna e DO è facilmente mantenuta durante tutto l'esperimento e controllo di DO tra prove è stavolo e riproducibile.
Limitazioni e modifiche
Due possibili limitazioni di questo esperimento sono le dimensioni della camera e la lunghezza del periodo di osservazione. Il volume di acqua (~ 2 L) e piccola apertura nel collo della camera limita la dimensione del microrganismo in grado di essere utilizzato. A questa scala, il protocollo permetterebbe una facile sostituzione di plecotteri per altri macroinvertebrati, anfibi e pesci più piccoli, ma non sarebbe applicabile per gli organismi più grandi (ad esempio, pesci predatori, polpi). Tuttavia, sarebbe possibile scalare questo esperimento fino utilizzando bicchieri più grandi, e adattando il protocollo generale per soddisfare diversi obiettivi di apprendimento / di ricerca con organismi più grandi. Inoltre, qualsiasi substrato richiesta nella camera per gli organismi più grandi dovrebbe essere preso in considerazione quando si sceglie in vetro a causa di piccole dimensioni sul collo del pallone 2 L. Nel nostro esperimento piccolo fiume-pietre sono stati raccolti con plecotteri e hanno fornito ampia camera di s ubstrate per le plecotteri per eseguire flessioni.
condizioni di camera interna oltre periodi di osservazione breve tempo sono stati mantenuti con fluttuazioni minime, tuttavia, permangono incertezze su periodi di osservazione più lunghi. Utilizzando il periodo di osservazione 3 min delineato nel protocollo, la temperatura dell'acqua della camera e fare i livelli sono stati mantenuti a valori costanti. Siamo stati in grado di mantenere DO e la temperatura dell'acqua fino ad un periodo di osservazione 5 min, ma in un periodo di osservazione lungo 10 minuti, la temperatura dell'acqua nella camera ha cominciato a salire. Nel protocollo attuale, non è possibile estendere il periodo di osservazione oltre 5 min. Tuttavia, gli adattamenti al protocollo corrente (come l'utilizzo di un ambiente controllata clima) potrebbero consentire una maggiore stabilità a lungo termine della temperatura dell'acqua. Inoltre, un'analisi più robusta e dettagliata del tempo di osservazione rispetto a condizioni ambientali (temperatura dell'acqua, DO, pressione parziale) aiuterebbe a determinare fattori limitanti.
content "> Questo protocollo ha la capacità di essere modificato (come detto sopra) per soddisfare diverse esigenze e obiettivi. Un ulteriori modifiche al protocollo esistente sarebbe una modifica al sistema di gorgogliamento. Mentre abbiamo utilizzato solo un piccolo tubo di rame a bollire l'acqua, abbiamo notato che l'aggiunta di grandi bolle di gas azoto spesso sloggiato i plecotteri dalla loro presa sulle pietre di fiume e ha inviato loro galleggia intorno alla camera. abbiamo cercato di usare una pietra spumeggiante per più anche la dispersione di gas di azoto , ma ha trovato che la camera dell'acqua non è stato agitato abbastanza per disperdere uniformemente il gas di azoto, causando una colonna di condizioni ipossiche all'interno della camera. ulteriore affinamento del sistema di erogazione di gas azoto può fornire indicazioni utili, e rimuovere il potenziale confondente di sloggiare stoneflies dal substrato tra le prove fare. Significato e future applicazioni
Questo esperimento è stato il primo del suo genere ad aclude uno sviluppo dettagliato protocollo di manipolare i livelli di fare per l'osservazione del comportamento animale in un ambiente di laboratorio. Mentre altri lavori pubblicati suggerito l'uso di azoto per manipolare livelli DO 7,8,16, insufficiente dettaglio metodologico è dato per consentire per la replica. L'interesse per questo sviluppo protocollo derivava dal desiderio di manipolare i livelli di DO e osservare il comportamento degli animali per l'uso in un livello di college laboratorio di ecologia introduttivo a Juniata College. All'interno della classe di 24 studenti, questo protocollo ha dimostrato riproducibile in tutti gli studi con diversi livelli di DO e tra gruppi di studenti. Inoltre, questo protocollo fornisce un modo altamente accessibile e conveniente per manipolare i livelli di fare per la sperimentazione in laboratorio.
Anche se questo protocollo è stato sviluppato appositamente per l'uso con plecotteri in un laboratorio didattico, potrebbe facilmente essere adattato per altri obiettivi. Più specificamente, questo protocollo potrebbe facilmente essere usato con altri piccoli acquaticamacroinvertebrati, pesci, anfibi e anche a seconda delle specie di interesse. Ad esempio membri dell'ordine Amphipodia che aumentano la loro attività locomotiva in risposta all'ipossia 17 potrebbe essere usato, o pesci rossi (Carassius auratus), che presentano un "ingoiando" comportamento sulla superficie dell'acqua in condizioni di ipossia 16. Inoltre, varie fasi di vita degli organismi acquatici potrebbero essere utilizzati anche con questo protocollo per aiutare ulteriormente la nostra comprensione delle esigenze di ossigeno organismal durante lo sviluppo. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato anche per studiare le risposte biochimiche di ipossia con la sperimentazione di anfibi come mudpuppies (Necturus maculosus) 18. Inoltre, questo protocollo può essere scalato verso l'alto o verso il basso in termini di dimensioni per soddisfare le esigenze di organismi più o meno grandi e applicazioni di insegnamento o di ricerca. Mentre riteniamo che il protocollo e la specifica applicazione in sé è di grande interesse ecologico, la più grande forza di questa protocol è che fornisce un grande sviluppo fondamento nei vari gruppi tassonomici e gli obiettivi sperimentali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter flask 2 L | Pyrex | 5340 | |
| Rubber Stopper size 6 | Sigma-Aldrich | Z164534 | |
| Nalgene 180 Clear Plastic Tubing | Thermo Scienfitic | 8001-1216 | |
| Whisper 60 air pump | Tetra | ||
| Standard flexible Air line tubing | Penn Plax | ST25 | |
| 0.25 inch Copper tubing | Lowes Home Improvement | 23050 | |
| Male hose barb | Grainger | 5LWH1 | |
| Female Connector | Grainger | 20YZ22 | |
| Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter | Extech | 407510 | |
| Nitrogen gas | Matheson TRIGAS | ||
| Radnor AF150-580 Regulator | Airgas | RAD64003036 |
References
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