Summary
В данной статье описывается простой и воспроизводимый протокол манипулировать растворенные условия кислорода в лабораторных условиях для исследования поведения животных. Этот протокол может быть использован в обоих учебных и научно-исследовательской лаборатории условиях для оценки реакции организменном макробеспозвоночных, рыб, земноводных или к изменениям в концентрации растворенного кислорода.
Abstract
Способность манипулировать растворенного кислорода (DO) в лабораторных условиях имеет значительное применение для исследования ряда экологических и организменном вопросов поведения. Протокол, описанный здесь, обеспечивает простой, воспроизводимый, и контролируемый способ манипулировать DO изучать поведенческую реакцию в водных организмов, являющихся результатом гипоксических и бескислородных условиях. При выполнении дегазацию воды с азотом обычно используется в лабораторных условиях, не явный метод экологического (водной) применения не существует в литературе, и этот протокол является первым, чтобы описать протокол дегазировать воду, чтобы наблюдать реакцию организменном. Этот метод и протокол были разработаны для непосредственного применения для водных беспозвоночных; Тем не менее, мелкая рыба, амфибии и другие водные позвоночные могут быть легко заменены. Это позволяет легко манипулировать уровнями DO в диапазоне от 2 мг / л до 11 мг / л, стабильность в течение периода до животного наблюдения 5 мин.За период 5 мин наблюдения температуры воды начал подниматься, и в 10 мин DO уровни стали слишком нестабильными для поддержания. Протокол является масштабируемым для исследуемого организма, воспроизводимым и надежным, позволяя для быстрого внедрения в вводных учебных лабораторий и исследовательских приложений высокого уровня. Ожидаемые результаты этого метода следует отнести изменения растворенного кислорода в поведенческих реакциях организмов.
Introduction
Растворенный кислород (DO) является одним из ключевых параметров физико-химическая важную роль в опосредовании ряда биологических и экологических процессов в пределах водных экосистем. Воздействия острой и хронической сублетального гипоксии снижения темпов роста в некоторых водных насекомых и уменьшить выживание насекомых при 1. Этот протокол был разработан, чтобы обеспечить контролируемый способ манипулировать уровнями DO в потоке воды, чтобы наблюдать воздействие на поведение животных. Поскольку выживание всех аэробных водных организмов "зависит от концентрации кислорода для того, чтобы жить и размножаться, изменения в концентрации DO часто отражаются в поведенческих изменениях организмов. Более мобильные водные беспозвоночные и рыбы наблюдались реагировать на низких концентраций кислорода (гипоксии) путем поиска локалей с более высоким DO 2,3. Для менее подвижных водных организмов, поведенческие адаптации увеличить потребление DO может быть единственным жизнеспособным вариантом. Водной макробеспозвоночных порядок ПлекOPTera (веснянок) было отмечено для выполнения "Push-Up" движения , чтобы увеличить поток воды, и поглощение кислорода, через их внешние жабры 4 - 6. Эти адаптивные модели поведения наблюдаются в естественных условиях и в лабораторных экспериментах.
Лабораторные манипуляции DO в воде открывает значительные возможности для исследований поведения животных, но существенные пробелы в методологическом развертывании существуют. Например, в одном исследовании были использованы большие аквариумы для оценки физиологического времени отклика окуня (Micropterus salmoides) в гипоксических условиях следующей барботировании азотом, но скудный подробно дается на методологии 7. Другое исследование , проведенное на Зебра рыбы (Danio rerio) описывается с использованием газообразного азота и пористый камень , чтобы поставлять газ в воду и уменьшить DO воды 8. Для применения химии на основе методов дегазацию растворителей используют специализированныеУстройство 9 - 11 для удаления кислорода из растворителей, но не подходит для изучения поведения животных. В то время как эти исследования используют методы для удаления кислорода из воды, не описательный метод не может быть определено, что позволило бы для оценки поведения животных в ответ на изменения DO.
Этот метод описан далее попытка полностью описать протокол для манипулирования DO воды с использованием газообразного азота. Кроме того, этот метод был разработан в направлении наблюдения взаимосвязи между поведением Stonefly (отжимания) и DO, который был использован в биологии лаборатории первокурсник уровня. Одним из основных преимуществ этого метода является то, что она легко может быть выполнена в лаборатории с общей стеклянной посуды и материалов, доступных для большинства средних и высших учебных заведений. Протокол также легко адаптируется, что позволяет людям масштабировать процедуру для достижения целей, изложенных в научных или учебных приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот эксперимент не использовали позвоночных животных и поэтому не требуют одобрения института Juniata колледжа по уходу и использованию животных комитета. Однако для людей, адаптирующихся этот метод для использования с позвоночных, утверждение IACUC следует искать.
1. Поле для сбора проб
- Определить и оценить потенциальные участки поля для возможности сбора, хранения и транспортировки веснянки быстро, чтобы минимизировать время в пути с максимальной рекомендуется время в пути 1 ч.
- Выполните кик-сеть выборки на выбранном участке поля в соответствии со стандартными кик-нетто процедур достаточное количество раз , чтобы собрать по меньшей мере 35 веснянок 12.
- Соберите 50 л потока воды и горных пород с максимальным диаметром 2 см от потоков.
- Поместите аквариумы в холодильник установлен на температуру участка потока. Распределить пород, собранных на месте потока в аквариумах и залить 4 л потока воды в аквариуме. Поместите 20-30 Собранные веснянки в аквариум и поместить пузырящуюся камень, прикрепленный к аквариума барботер в каждый бак и включите барботерах непрерывно добавлять воздуха в помещении в воду.
- Разрешить веснянки, чтобы приспособиться к новым условиям в аквариумах в течение периода 48 ч.
Рисунок 1. Установка для растворенного кислорода манипуляции. (A) 1) Установка для медной трубы к мужскому шланг бородки 2) Расположение стопора уплотнения для изучения для обеспечения герметизации и флягу. (В) 1) 2 л бокового рычага колба заполнена 1,9 л воды 2) трубки газа и воздуха барботера (синий) для использования в пропускании азота и барботировании воздуха комнатной соответственно 3) резервуар с азотом и калиброванных значений 4) 2 - литровую колбу заполнен 0,4 л воды с вакуумной трубкой под водой 5) Растворенный метр кислорода. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобыпросмотреть большую версию этой фигуры.
2. Экспериментальная установка
- На скамейке сверху, подключите стандартный огороженный вакуумную трубку к боковой ручке 2 л боковой рукоятки колбы , как показано (1 на рисунке 1В).
- Наполните колбу с 1,9 л воды из потока 3 л пластиковых контейнеров, содержащих собранную струей воды в холодильнике установлен на 12 ° C.
- Поместите колбу и трубку на лоток, достаточно большой, чтобы провести ледяную баню вокруг колбы боковой рукоятки, не заслоняя вид внутренней колбы и заполнить лоток со льдом.
- Просверлите два отверстия диаметром 3 мм в резиновой пробке , чтобы обеспечить проход 1) медной трубки для доставки газа в сосуд , и 2) зонд метра DO в 2 л противодавлением колбу (1 на рисунке 1В) ,
- Делают боковой разрез от края пробки к одному из отверстий, чтобы позволить размещение провода зонда DO в пробке.
- Подключите переходник с наружной шлангом 3 ммЗубец к части 2 мм диаметр медной трубы (1 на рис 1А). Убедитесь, что эта труба достаточно долго, чтобы достичь в пределах 10 см от дна колбы при достижении через пробку.
- Поместите трубу с соединителем, хотя второе отверстие в пробке до длины от нижней части пробки достаточно, чтобы добраться до пределах 10 см от дна колбы.
- Подключение 0,75 м длины, тонкостенная полиэтиленовая газовая труба с диаметром от 3 мм до муфты на трубе.
- Вставьте оба зонда DO и медные трубы в колбу и запечатать колбу с пробкой.
- Проверка на безопасное уплотнение между пробкой и колбы, а также плотное прилегание между трубой и зондом проволоки в пробке.
- Наполните колбу емкостью 1 л с 0,4 л водопроводной воды и место, соседнее с лотком с ледяной бани и вакуумной колбы.
- Погрузитесь полиэтиленовой трубки Исходя из большого термоса в воду в колбе объемом 1 л. ЗакрепитеТрубка с лентой таким образом, что она будет оставаться под водой с помощью эксперимента.
- Соедините диаметром 3 мм линию газа из вакуумной колбы аквариума помещение воздуха барботер. Начинают пузырь воды в 2-литровую колбу, вставив в аквариуме барботер, который вводит комнатный воздух и кислород в воду.
- Мониторинг концентрации DO и температуру воды с измерителем DO в течение 5 минут или пока равновесие DO не установлено внутри камеры таким образом, что небольшое изменение DO происходит.
3. Проверка устойчивости Экспериментальная установка
- Проверьте каждую установку для стабильности сделать перед добавлением веснянки.
- Добавьте три или четыре скалы в 2-литровую колбу так, что веснянки имеют подложку, благоприятную для отжимания.
- Начните пробный манипуляции DO, отсоединив газовую трубу из барботера и присоединение его к линии газообразного азота.
- Начните пропускании азота со скоростью 20 кубических футов в час (CFH) в течение приблизительно 40сек до 1 мин.
- После того, как DO упала с точностью до 0,5 мг / л целевой концентрации, уменьшить поток до 15 CFH и позволяют уменьшить концентрацию до цели.
- Прекратить подачу азота сразу после того, как целевая концентрация достигается.
- Используйте аквариум комнате воздуха барботер, чтобы вернуть концентрацию до целевой концентрации, если DO уменьшается ниже цели.
- Если DO неустойчив во время тестирования подстроено затем проверьте объем воды по-прежнему на уровне 1,9 л и вода не ыми вне, температура воды стабильна и не меняется, и уплотнения на всех фитингов, как представляется, плотно и запечатывают.
- После того, как три испытания были проведены и экспериментатор имеет уверенность в способности контролировать DO, присоединить газопровод к барботер и пузырь снова равновесие.
- Пузырь к равновесию, прилагая диаметром 3 мм газовую линию в аквариум барботер и началом добавления комнатного воздуха в воде до концентрациикислорода в воде не приводит к увеличению или изменения в течение 3 мин.
- После того, как в состоянии равновесия, остановить бурлит и распечатывания колбу.
4. Stonefly Push-эксперимент
- Следует разделить общее количество веснянок по количеству наблюдателей, чтобы определить количество испытаний, чтобы выполнить.
- Определить различные уровни DO между 2 и 10 мг / л, чтобы оценить поведенческие реакции веснянки (количество отжимания).
- Установить одну колбу в испытание и добавить равное количество веснянки, поскольку есть наблюдатели в колбу (4 веснянки в этой конструкции), поместите зонд и трубку обратно в колбу, затем запечатайте колбу с резиновой пробкой.
Примечание: начальная DO концентрации 10 мг / л был выбран в качестве первой точки наблюдения, так как она была концентрация DO потока, откуда были семплируется веснянками. - После того, как вода в количестве 10 мг / л путем барботирования следующие шаги 2.10-2.11, регистрируют температуру исходного воды и даютвеснянки прикрепить к каменной подложке в колбе.
- Назначают только один наблюдатель, чтобы наблюдать одну Stonefly для обеспечения точного подсчета пуш-ап поведения, который является вверх и вниз, движение тела выставлены на веснянок.
- Граф и записывать количество отжиманий, наблюдаемых в течение периода наблюдения 3 мин.
- Манипулирование DO к следующему экспериментальном уровне DO и повторить 3 мин период наблюдения для дополнительных экспериментальных уровней.
Примечание: В рамках этого эксперимента, три различных уровня DO были оценены.
5. Статистический анализ
- Для того, чтобы выполнить статистический анализ использования среднее число отжиманий через четыре веснянки через группу для данного DO суда.
- Используйте свободное R статистическое программное обеспечение вычислительной 12 для выполнения анализа отклонений (ANOVA) от количества отжиманий и концентрации DO , используя порядок каждого экспериментального исследования (DO уровень) и температуры , как соуariates. Исследуемый DO как дискретные уровни одного фактора.
- Используйте тест нормальности Андерсона-Дарлинга на невязок для проверки на нормальность 13.
- Выполните линейной регрессии по данным, откладывая среднее число отжиманий от концентрации DO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шесть испытания описанной установки были выполнены 24 первокурсников студентов в учебно лабораторных условиях для количественного определения количества отжиманий веснянки выполнение в ответ на различные концентрации DO в воде. Среднее количество отжиманий осуществляется в пределах уровня DO и в каждом испытании объединяли для построения отжимания от уровня DO на рисунке 2. ANOVA проводили сначала с использованием концентрации DO, последовательный порядок испытаний, температуры, а также взаимодействие между всеми переменными. Результаты показывают , что только концентрация DO существенное влияние на количество отжиманий , выполняемых веснянки (R 2 прил. = 0,322, р = 0,004) и никакой другой переменной или взаимодействие является важным прогностическим фактором отжимания. Все данные, используемые в этом анализе было подтверждено на нормальность с использованием теста Андерсона-Дарлинга.
Содержание "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 ">
Рисунок 2. Среднее количество отжиманий , выполняемых веснянки , сгруппированных методом проб заговор против концентрации растворенного кислорода. Это показывает значительное отрицательное отношение (R 2 прил. = 0,322, р = 0,004) между отжиманий и концентрации растворенного кислорода (наклон -6,063). Красные цифры указывают на температуру воды (в ° C) для испытания. Температуры были стабильными в 3 -х периодов мин испытаний, но разнообразны по эксперимента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Дополнительный код файла:. R - код для статистического анализа Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этотфайл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги
Эта процедура обеспечивает простой и эффективный способ управления DO в лабораторных условиях для выполнения поведенческих исследований на водные организмы. Мы нашли там быть несколько критических шагов / пунктов, чтобы быть в курсе при выполнении этого эксперимента, который непосредственно связаны с результатами. В рамках судебного процесса, он имеет решающее значение для поддержания давления в камере, чтобы избежать изменений в парциального давления газов над водой, и последующее DO колебания. Следуя инструкциям, приведенным в «Тестирование стабильности экспериментальной установки" части протокола имеет решающее значение. Осмотрев печать пробкой с колбы, обеспечивая полное погружение вакуумной трубки в колбу емкостью 1 л воды (для предотвращения обратного потока воздуха в помещении), а также сидения газовую линию и DO проволочную уплотнение с пробкой может помочь сохранить стабильное камера окружающей среды. Кроме того, максимально увеличивая объем воды в камере необходимо для повышения стабильности DO в пределахсуд, как мы обнаружили, что слишком мало результатов объема в хаотичным и нестабильным DO манипуляциям.
Поддержание температуры воды в камере необходимо для хорошего управления внутренних уровней DO. В то время как мы были в состоянии поддерживать температуру холодной воды в рамках отдельных экспериментов группы, некоторое минимальное изменение температуры поперек различных испытаний было видно (рис 2). Так как наш общий диапазон температур была низкой (11.8-13.5˚C) и в обычном диапазоне для веснянки, это не оказаться значимым предиктором в нашей модели для Stonefly отжимания. Тем не менее, температура воды , как известно, влияет на потенциал насыщения кислородом воды 14,15, и не в состоянии поддерживать температуру в камере воды будет иметь прямое воздействие на уровни DO. С хорошим уплотнением, соответствующим объемом воды, и стабильной температуры воды, внутреннего давления в камере и DO легко поддерживается в течение всего эксперимента и контроль DO между испытаниями является sстол и воспроизводимым.
Ограничения и Модификации
Два возможных ограничений этого эксперимента являются размеры камеры и продолжительность периода наблюдения. Объем воды (~ 2 л) и небольшое отверстие в горловине камеры ограничивает размер организма в состоянии использоваться. В этом масштабе, протокол позволит легко замещения веснянки для других макробеспозвоночных, земноводных и мелких рыб, но не были бы применимы для более крупных организмов (например, хищные рыбы, осьминоги). Тем не менее, можно было бы масштабировать этот эксперимент вверх, используя большую стеклянную посуду, и адаптировать общий протокол для удовлетворения различных учебных / исследовательских целей с более крупными организмами. Кроме того, любой субстрат, необходимый в камере для более крупных организмов следует принимать во внимание при выборе изделий из стекла из-за небольшого размера шеи на 2-литровую колбу. В нашем эксперименте небольшие речные камни были собраны с веснянки и при условии достаточно камеры с ubstrate ибо веснянки выполнять отжимания.
Внутренние условия в камере в течение периода наблюдения короткого времени поддерживались с минимальными колебаниями, однако, сохраняется неопределенность относительно длительного периода наблюдения. 3 путем использования мин периода наблюдения, изложенные в протоколе, температура в камере воды и делать уровни сохранялись при постоянных значениях. Мы были в состоянии поддерживать DO и температуру воды до периода наблюдения 5 мин, но на длительный период наблюдения за 10 мин, температура воды в камере начали расти. В текущем протоколе, это не представляется возможным продлить период наблюдения за 5 мин. Тем не менее, адаптация к текущему протоколу (например, с помощью контролируемого микроклимата в помещении), делает возможным для повышения долгосрочной стабильности температур воды. Кроме того, более надежный и детальный анализ времени наблюдения в сравнении с условиями окружающей среды (температура воды, DO, парциальное давление) поможет определить ограничивающие факторы.
Содержание "> Этот протокол имеет возможность изменять (как упоминалось выше), чтобы удовлетворить ряд различных потребностей и целей. Еще одна модификация существующего протокола будет модификация системы восходящей цепочки. В то время как мы использовали исключительно небольшой медной трубы пузыриться вода, мы заметили, что добавление больших газовых азотных пузырьков часто выбила веснянки из их удержания на речных камней и послал их плавающими вокруг камеры. мы попытались использовать кипящий камень для более равномерного рассеивания газообразного азота , но обнаружил, что камера вода не перемешивается достаточно, чтобы равномерно рассеять газообразный азот, в результате чего в колонке гипоксических условий в камере. Дальнейшее совершенствование системы доставки газа азота может предоставить полезную информацию и устранить потенциальный посрамить из выбивании веснянки от подложки между DO испытаний. Значение и будущих приложений
Этот эксперимент был первым в своем роде вразработку протокола заключить, подробно манипулировать уровни сделать для наблюдения за поведением животных в лабораторных условиях. В то время как другая опубликованная работа предложил использовать газообразный азот , чтобы манипулировать уровни DO 7,8,16, недостаточная методологическая подробно дается , чтобы для репликации. Интерес к этой разработке протокола вытекает из нашего стремления манипулировать уровни DO и наблюдать за поведением животных для использования в вводный экологической лаборатории на уровне колледжа в Джуниата колледже. В классе 24 учеников, этот протокол оказалось воспроизводимым через испытания с различными уровнями DO и во всех группах студентов. Кроме того, этот протокол обеспечивает высокую доступность и экономически эффективный способ управления уровней сделать для лабораторных экспериментов.
Хотя этот протокол был разработан специально для использования с веснянки в обучающей лаборатории, она легко может быть адаптирована и для других целей. Более конкретно, этот протокол легко может быть использован с другими мелкими воднымимакробеспозвоночные, рыбы и даже амфибии в зависимости от вида, представляющих интерес. Например членов порядка Amphipodia , которые повышают их двигательной активности в ответ на гипоксию 17 может быть использована, или золотая рыбка (карась Auratus) , которые демонстрируют "глотая" поведение на поверхности воды при гипоксических условиях 16. Кроме того, различные периоды жизни водных организмов также может быть использован с этим протоколом, чтобы помочь углубить наше понимание организменном требований кислорода в течение всего развития. Этот протокол также может быть использован для изучения биохимических реакций организма к гипоксии, экспериментируя с амфибий , таких как Mudpuppies (американские протеи maculosus) 18. Кроме того, этот протокол может быть увеличен или уменьшен в размерах, чтобы удовлетворить потребности больших или меньших организмов и учебных или исследовательских целях. В то время как мы считаем, что протокол и сам конкретное применение имеет широкий экологический интерес, самая большая сила этого Protocoл в том, что он обеспечивает большое развитие фундамент через таксономических групп и экспериментальных целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter flask 2 L | Pyrex | 5340 | |
| Rubber Stopper size 6 | Sigma-Aldrich | Z164534 | |
| Nalgene 180 Clear Plastic Tubing | Thermo Scienfitic | 8001-1216 | |
| Whisper 60 air pump | Tetra | ||
| Standard flexible Air line tubing | Penn Plax | ST25 | |
| 0.25 inch Copper tubing | Lowes Home Improvement | 23050 | |
| Male hose barb | Grainger | 5LWH1 | |
| Female Connector | Grainger | 20YZ22 | |
| Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter | Extech | 407510 | |
| Nitrogen gas | Matheson TRIGAS | ||
| Radnor AF150-580 Regulator | Airgas | RAD64003036 |
References
- Hoback, W., Stanley, D. Insects in hypoxia. J. Insect Physiol. 47 (6), 533-542 (2001).
- Craig, J., Crowder, L. Hypoxia-induced habitat shifts and energetic consequences in Atlantic croaker and brown shrimp on the Gulf of Mexico shelf. Mar Ecol-Prog Ser. 294, 79-94 (2005).
- Gaulke, G., Wolfe, J., Bradley, D., Moskus, P., Wahl, D., Suski, C. Behavioral and Physiological Responses of Largemouth Bass to Rain-Induced Reductions in Dissolved Oxygen in an Urban System. T Am Fish Soc. 144 (5), 927-941 (2015).
- Genkai-Kato, M., Nozaki, K., Mitsuhashi, H., Kohmatsu, Y., Miyasaka, H., Nakanishi, M. Push-up response of stonefly larvae in low-oxygen conditions. Ecol Res. 15 (2), 175-179 (2000).
- McCafferty, W. Aquatic Entomology: The Fishermen's and Ecologists' Illustrated Guide to Insects and Their Relatives. , Jones and Bartlett. (1983).
- Chapman, L., Schneider, K., Apodaca, C., Chapman, C. Respiratory ecology of macroinvertebrates in a swamp-river system of east Africa. Biotropica. 36 (4), 572-585 (2004).
- Suski, C., Killen, S., Kieffer, J., Tufts, B. The influence of environmental temperature and oxygen concentration on the recovery of largemouth bass from exercise implications for live - release angling tournaments. J Fish Biol. 68, 120-136 (2006).
- Abdallah, S., Thomas, B., Jonz, M. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218 (11), 1777-1786 (2015).
- Ciba Geigy Ag. Method and apparatus for degassing viscous liquids and removing gas bubbles suspended therein. US patent. Gassmann, H., Chen, C., Vermot, M. , 3,853,500 (1974).
- Hewlett-Packard Company. Apparatus for degassing liquids. US patent. Berndt, M., Schomburg, W., Rummler, Z., Peters, R., Hempel, M. , 6,258,154 (2001).
- Sims, C., Gerner, Y., Hamberg, K. Systec inc.,. Vacuum degassing. US patent. , 6494938 (2002).
- Barbour, M., Gerritsen, J., Snyder, B., Stribling, J. Report number EPA 841-B-99-002. Rapid bioassessment protocols for use in streams and wadeable rivers. , USEPA. Washington. (1999).
- Anderson, T., Darling, D. A Test of Goodness of Fit. J Am Stat Assoc. 49 (268), 765-769 (1954).
- Rounds, S., Wilde, F., Ritz, G. Chapter A6 Field Measurements. Section 6.2 DISSOLVED OXYGEN. National Field Manual for the Collection of Water-Quality Data. , U.S. Geological Survery. Virginia, U.S. (2013).
- Hem, J. Study and Interpretation of the Chemical Characteristics of Natural. , U.S. Geological Survery. (1985).
- Burggren, W. 34;Air Gulping" Improves Blood Oxygen Transport during Aquatic Hypoxia in the Goldfish Carassius auratus. Physiol Zool. 55 (4), 327-334 (2015).
- Frederic, H., Mathieu, J., Garlin, D., Freminet, A. Behavioral, Ventilatory, and Metabolic Responses to Severe Hypoxia and Subsequent Recovery of the Hypogean Niphargus rhenorhodanensis and the Epigean Gammarus fossarum (Crustacea: Amphipoda). Physiol Zool. 68 (2), 223-244 (2015).
- Ultsch, G., Duke, J. Gas Exchange and Habitat Selection in the Aquatic Salamanders Necturus maculosus and Cryptobranchus alleganiensis. Oecologia. 83 (2), 250-258 (1990).
