Summary
この記事では、動物行動研究のための実験室の設定で溶存酸素条件を操作するためのシンプルで再現性のあるプロトコルについて説明します。このプロトコルは、溶存酸素濃度の変化に大型無脊椎動物、魚類、または両生類の生物応答を評価するために、両方の教育と研究室の設定で使用してもよいです。
Abstract
実験室環境中の溶存酸素（DO）を操作する能力は、生態系と生物行動の質問の数を調査する重要なアプリケーションを持っています。ここで説明するプロトコルは、低酸素と無酸素状態に起因する水生生物における行動反応を研究するために、DO操作するための、簡単な再現性、および制御方法を提供します。窒素は、一般的に実験室の設定で使用されていると、水の脱ガスを行いながら、生態（水生）アプリケーションのための明示的な方法は、文献中に存在せず、このプロトコルは、生物応答を観察するために水をdegasifyするためのプロトコルを記述する最初のものです。この技術およびプロトコルは、水生無脊椎動物のために直接適用するために開発されました。しかし、小魚、両生類、および他の水生脊椎動物を簡単に置き換えることができます。これは、2 mg / Lでから5分の動物観察期間までのための安定した11ミリグラム/ Lの範囲のDOレベルを簡単に操作することができます。5分間の観察期間を超えて水の温度が上昇し始め、10分にはDOでレベルが維持するにはあまりにも不安定になりました。プロトコルは、入門教育ラボや高レベルの研究用途への迅速な実装を可能にし、研究の生物へのスケーラブルな再現性、および信頼性があります。この技術の期待される結果は、生物の行動応答に溶存酸素の変化を関連付ける必要があります。
Introduction
溶存酸素（DO）、水生生態系内の生物学的および生態学的プロセスの数を媒介するのに重要な鍵と生理化学的パラメータです。急性および慢性の致死低酸素に対するエクスポージャーは、特定の水生昆虫の成長率を低下させ、1さらさ昆虫の生存率を低下させます。このプロトコルは、動物の行動への影響を観察するために河川水にDOレベルを操作する制御方法を提供するために開発されました。すべての好気性水生生物の生存が住んでいて、再生するためには、酸素濃度に依存するため、DOの濃度の変化は、多くの場合、生物による行動の変化に反映されます。複数のモバイル水生無脊椎動物や魚は高いDO 2,3でロケールを求めることにより、低酸素濃度（低酸素）に応答することが観察されています。あまり携帯水生生物については、DOの摂取量を増加させるための行動適応が唯一の現実的な選択肢かもしれません。 PLECの水生大型無脊椎動物順6 - optera（カワゲラ）は、それらの外鰓4渡って、酸素の水の流れ、および取り込みを増加させるために「プッシュアップ」の動きを実行するために注目されています。これらの適応行動は、自然環境および実験室の実験で観察されています。
水中のDOの実験室での操作は、動物行動研究のための重要な機会を開きますが、方法論の展開で大きなギャップが存在します。例えば、ある研究では、窒素でガス処理以下の低酸素環境にオオクチバス（ オオクチバス ）の生理学的な応答時間を評価するために、大きな水槽を使用したが、わずかな詳細は方法論7について与えられています。ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）で実行別の研究では、水にガスを供給し、水8のDOを低減するために、窒素ガスと多孔質石を使用します。化学ベースのアプリケーションの場合は、溶剤の脱ガスのための方法は、特殊な利用します装置9から11の溶剤から酸素を除去するが、動物の行動研究には適していません。これらの研究は、水から酸素を除去する方法を採用しているが、何の記述方法は、変更を行うために応答して、動物の行動の評価を可能にするであろうが同定されませんでした。
以下に説明するこの方法は、十分に窒素ガスを用いて水のDOの操作のためのプロトコルを説明するための試みです。さらに、この方法は、新入生レベルの生物学実験室で使用したカワゲラの振る舞い（腕立て伏せ）とDOとの関係を観察することに向けて開発されました。この方法の主な利点の1つは、それが簡単に一般的なガラス製品、ほとんどの二次および高等教育機関へのアクセスの材料と実験室内で実行することができるということです。プロトコルは、個人が研究や教育用途のために記載された目標を達成するための手順をスケーリングするためにできるように、また容易に適応可能です。
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Protocol
注：この実験は、脊椎動物を使用していなかったため、動物実験委員会のためのジュニアータカレッジの研究所による承認を必要としませんでした。しかし、脊椎動物で使用するために、この方法を適応個人のために、IACUCの承認が求められるべきです。
1.フィールドのサンプル採取
- 1時間のトランジットでの最大推奨時間で輸送中の時間を最小限にするために迅速に決定し、評価収集する機能のための潜在的なフィールドサイトを、店舗、および輸送カワゲラ。
- 少なくとも35カワゲラ12を収集するために、標準的なキック-netの手順に従って、選択したフィールドサイトで十分な時間をキックネットサンプリングを行います。
- ストリームから2センチメートルの最大径と河川水と岩の50 Lを収集します。
- ストリームサイトの温度に設定し冷蔵庫に水槽を置きます。水族館にストリームサイトで収集した岩を配布し、水槽ごとの河川水4Lで埋めます。場所20-30水族館あたりカワゲラを収集し、各タンクに水族館バブラーに取り付けられたバブリングの石を配置し、継続的に水に室内空気を追加するバブラーをオンにします。
- カワゲラは、48時間の期間のための水族館で新しい環境に調整することができます。
図1.溶存酸素操作のために設定します。（A）1）男性のホースバーブ2）ストッパーシールの場所に銅管用の継手はよく確保フラスコを密封するために検討しました。 （B）1）サイドアームフラスコに1.9水2）ガス管とそれぞれ窒素バブリングと室内空気のバブリングで使用するための空気バブラー（青）、3）窒素タンクのLとゲージ値4）2リットルのフラスコを充填した2 L真空管5水没）溶存酸素計で水0.4 Lで満たされた。 にはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
2.実験のセットアップ
- （ 図1Bの1）に示されているように作業台の上に、2 Lサイドアームフラスコのサイドアームに標準壁の真空管を接続します。
- 12℃に設定し、冷蔵庫に集め河川水を保持する3 Lのプラスチック容器からの河川水の1.9リットルでフラスコを埋めます。
- フラスコ内部のビューを不明瞭にすることなく、サイドアームフラスコの周りに氷浴を保持し、氷でトレイを満たすのに十分な大きさのトレイ上のフラスコやチューブを置きます。
- 容器にガスを提供し、するには、1）銅管の通過を可能にするためにゴム栓二つ直径3mmの穴をドリル2） 図1Bの2 LサイドアームフラスコにDO計のプローブ（1） 。
- ストッパーにDOプローブのワイヤーの着座を可能にするために、穴の一つにストッパーの端から横方向の切開を行います。
- 3ミリメートルオスホースとカプラーを接続バーブ（ 図1A中1）直径2mmの銅管の一部に。このパイプは、ストッパーを介して到達しながら、フラスコの底から10cm以内に到達するのに十分な長さであることを確認してください。
- ストッパーの底部からの長さまでのストッパーにおける第二の穴は、フラスコの底から10cm以内に到達するのに十分ですが、カプラーとのパイプを配置します。
- パイプ上のカプラに3ミリメートルの直径0.75メートルの長さ、薄壁ポリエチレンガス管を接続します。
- フラスコにDOプローブと銅管の両方をスライドさせ、ストッパー付きフラスコを密封します。
- ストッパーとフラスコ、ならびにパイプとストッパ内のプローブ線との間にぴったりとフィットとの間のセキュアシールを確認してください。
- 水道水0.4リットルで1リットルのフラスコを記入し、氷浴と真空フラスコとトレイに隣接して配置します。
- 1Lのフラスコの水中に大きな真空フラスコからのポリエチレンチューブを浸します。確保しますそれは、実験を通して沈めたままになりますようにテープでチューブ。
- 水族館室内空気バブラーに真空フラスコから3ミリメートルの直径のガスラインを接続します。水に室内空気と酸素を紹介する水族館バブラーに接続することによってバブルに2リットルのフラスコ内の水を開始します。
- 5分間またはDOの平衡がDOにほとんど変化が発生していることなど、チャンバ内に確立されるまで、DO計で水のDO濃度と温度を監視します。
3.実験のセットアップの安定性試験
- カワゲラの添加前にDOの安定性のための各セットアップをテストします。
- カワゲラは腕立て伏せの助けとなる基板を有するように、2リットルのフラスコに3つまたは4つの岩を追加します。
- バブラーからのガス管を切断し、窒素ガスラインに取り付けることにより、DOのトライアル操作を開始します。
- 約40のために時間あたり20立方フィート（CFH）で窒素をバブリング開始1分秒。
- DOは、標的濃度の0.5ミリグラム/ Lの範囲内まで低下した後、15 CFHに流れを減少し、濃度がターゲットに減少することを可能にします。
- 目標濃度に達するとすぐに、窒素の流れを止めます。
- DOは目標を下回った場合に目標濃度に濃度を返すために水槽室内空気バブラーを使用してください。
- DOは、セットアップのテスト時に不安定である場合には、水温が安定して変化していない、水量は1.9 Lのままであると水が出て泡立てていない確認、およびすべての付属品にシールがしっかりと密封されたように見えます。
- 3試験が行われており、実験者は、DOを制御する能力に自信を持っていたら、再び平衡状態にバブラーバブルにガスラインを取り付けます。
- 水族館バブラーに直径3mmのガスラインを取り付けての濃度まで水に室内空気の追加を開始することにより、平衡にバブル水中の酸素が増加または3分間変更されません。
- 平衡状態でたら、バブリングを停止し、フラスコを開封。
4.カワゲラプッシュアップ実験
- 実行するための試行回数を決定するために、観察者の数でカワゲラの合計数を割ります。
- カワゲラ（腕立て伏せの回数）の行動反応を評価するために、2および10mg / Lの間で異なるDOレベルを決定します。
- ゴム栓でフラスコを再シール、その後、裁判ごとに1フラスコを設定し、フラスコ（この設計内の4カワゲラ）へのオブザーバーがあるとしてカワゲラの同じ番号を追加し、バックフラスコにプローブとのパイプを配置します。
注：それはカワゲラがサンプリングされた場所からのストリームのDO濃度だったので、最初は10ミリグラムの濃度をDO / Lは、最初の観測点として選ばれました。 - 水は以下に2.10から2.11までステップバブリングすることによっての10mg / Lになったら、開始水温を記録可能フラスコ内の岩の基板に取り付けるためのカワゲラ。
- カワゲラが示す上下身体の動きであるプッシュアップ動作の正確なカウントを保証するために、単一のカワゲラを見るためにだけ1オブザーバーを割り当てます。
- 3分間の観察期間にわたって観察された腕立て伏せの回数をカウントし、記録します。
- 次の実験DOレベルにDOを操作し、追加実験のレベルの3分の観察期間を繰り返します。
注記：この実験計画の範囲内で、三つの異なるDOレベルを評価しました。
5.統計解析
- 統計分析を実行するには、指定されたDOの裁判のためのグループ全体の4カワゲラ全体で腕立て伏せの平均数を使用します。
- COVとして各実験試験の順序（レベルDO）と温度を使用して、腕立て伏せやDO濃度の数に分散分析（ANOVA）を実行するために無料のR統計計算ソフトウェア12を使用してくださいariates。単一因子の離散レベルとしてDOを分析しました。
- 正常13をチェックするために、残差にアンダーソン・ダーリングの正規性検定を使用してください。
- DO濃度に対する腕立て伏せの平均数をプロットすることにより、データに線形回帰を実行します。
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Representative Results
説明セットアップの6件の試験は、カワゲラが水の中に別のDO濃度に応じて行う腕立て伏せの回数を定量化するために教育実験室の設定で24新入生学部学生によって行われました。 DOレベル内および各試行内で行わ腕立て伏せの平均数は、図2にDOレベルに対する腕立て伏せをプロットするためにプールした。ANOVAとしてだけでなく、DO濃度、試験の順序、温度を利用して、最初に行きましたすべての変数間の相互作用。結果は、唯一の濃度が大幅にカワゲラによって行わ腕立て伏せの回数の影響を受けないことを示唆している（R 2 ADJを。= 0.322、P = 0.004）と無他の変数または相互作用は、腕立て伏せの有意な予測因子でした。この分析で使用されるすべてのデータはアンダーソン・ダーリン検定を使用して正規性が確認されました。
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裁判でグループ化されカワゲラによって行わ腕立て伏せの図2.平均数は。これは、有意な負の関係を示して溶存酸素濃度に対してプロット （R 2 ADJを。= 0.322、P = 0.004）プッシュアップと溶存酸素濃度の間（の傾き-6.063）。赤数字は試験のために（°C）での水の温度を示しています。温度は3分のトライアル期間全体で安定したが、実験全体で変化させた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足コードファイル： 統計分析のためのRコード。 これをダウンロードするにはこちらをクリックしてくださいファイル。
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Discussion
重要なステップ
この手順では、水生生物の行動研究を実行するために実験室の設定でDOを操作するための簡単かつ効率的な方法を提供します。私たちは、直接成果に関連し、この実験を行う際に注意すべきいくつかの重要なステップ/アイテムがあることが見つかりました。試験内では、水、上記ガスの分圧の変化、及びそれに続くDO変動を回避するためにチャンバ圧力を維持するために重要です。プロトコルの「実験の安定性をテストする」の項で説明する手順に従うことが重要です。ストッパーで水1Lフラスコに真空管の完全な水没を確保し、フラスコと栓のシールを点検（室内空気の逆流を防止するために）、およびガスラインを着座し、ワイヤシールをDOは、安定を維持するのを助けることができますチャンバ環境。さらに、チャンバ内の水の量を最大にすること内DOの安定性を向上させる必要があります我々は不規則で不安定なDO操作で、あまりにも少しボリューム結果を発見したとして裁判。
チャンバ内の水の温度を維持することは、内部DOレベルの良好な制御のために不可欠です。私たちは、個々のグループの実験内の冷水の温度を維持することができましたが、別の試験全体の温度における最小限の変動が（ 図2）明らかでした。温度の私達の全体の範囲は、（11.8-13.5˚C）低く、カワゲラのための典型的な範囲内であったので、カワゲラの腕立て伏せのための我々のモデルで有意な予測因子であることを証明しませんでした。しかし、水の温度は、水14,15の酸素飽和度の可能性をもたらすことが知られており、チャンバの水の温度を維持するために失敗すると、DOレベルに直接影響を与えるであろう。試験間のDOの実験と制御をsを通じて良好なシール、水の適切な量、および安定した水温、内部チャンバ圧力とDOは容易に維持されるとテーブルと再現性。
制限事項および修正
この実験の二つの潜在的な制限は、チャンバのサイズおよび観察期間の長さです。チャンバの首の水（〜2 L）の体積と小さな開口部を使用することができる生物のサイズを制限します。このスケールでは、プロトコルは、他の大型無脊椎動物、両生類、および小さい魚のためのカワゲラの容易な置換を可能にするであろうが、より大きな生物（ すなわち、捕食魚、タコ）には適用されないだろう。しかし、より大きなガラス製品を使用して、より大きな生物と異なる学習/研究目的を達成するために全体的なプロトコルを適合させることにより、この実験をスケールアップすることが可能です。 2リットルのフラスコに、小さなネックサイズに起因するガラス製品を選択する際に加えて、より大きな生物のためにチャンバ内に必要な基板が考慮されるべきです。我々の実験では、小さな川、石は十分な室内秒カワゲラで収集し、提供されました腕立て伏せを実行するためのカワゲラのためubstrate。
短い時間の観察期間にわたって内部チャンバ条件は最小限の変動で維持された、しかし、不確実性は、より長い観察期間について残ります。プロトコル、チャンバ水温に概説3分の観察期間を利用し、DOレベルが一定値に維持しました。私たちは、5分の観察期間までのDOと水の温度を維持することができましたが、10分長い観察期間で、チャンバー内の水の温度が上昇し始めました。現在のプロトコルでは、5分を超えて観察期間を延長することは不可能です。しかし、（このような気候制御された部屋を使用するなど）、現在のプロトコルへの適応は、水の温度の増加長期安定性を可能にすることができます。また、周囲の水の条件（温度、DO、分圧）に対する観測時間のより堅牢かつ詳細な分析が制限要因を決定するのに役立つだろう。
内容は ">このプロトコルは、様々なニーズや目標の数を満たすために（上記のように）変更することができる能力を持っています。既存のプロトコルに1つの追加変更がバブリングシステムに変更になります。私たちはもっぱら小さな銅パイプを利用しているがバブルに水、我々は大規模な窒素ガスの気泡の添加は、多くの場合、川の石にそれらの保留からカワゲラを追い出され、チャンバの周りに浮遊して送信された旨の通知をした。我々は、窒素ガスのより均一な分散のためにバブリングの石を使用しようとしましたしかし、チャンバーの水が均等にチャンバ内の低酸素条件の欄に、その結果、窒素ガスを分散させるのに十分に攪拌されなかったことを見出した。窒素ガス供給システムのさらなる改良をカワゲラを取り除くの潜在的な交絡に有用な洞察を提供し、除去することができますDO試験との間で基板から。意義と今後の応用
この実験は、内にその種の最初でした実験室の設定で動物の行動観察用のDOレベルを操作するために、詳細なプロトコル開発をclude。他の公開作品はDOレベル7,8,16を操作するための窒素ガスの使用を示唆しているが、不十分な方法論の詳細は、レプリケーションを可能にするために与えられています。このプロトコル開発への関心はDOレベルを操作し、ジュニアータカレッジで大学レベルの入門生態学研究室での使用のために動物の行動を観察するために私たちの願い茎から。 24学生のクラスの中では、このプロトコルは、DOレベルが異なると学生のグループ間比較試験全体の再現性が証明されました。また、このプロトコルは、実験室での実験のためのDOレベルを操作するための非常にアクセスし、費用対効果の高い方法を提供します。
このプロトコルは、教育ラボでカワゲラで使用するために特別に開発されたが、それは簡単に他の目的のために適合させることができます。より具体的には、このプロトコルは、容易に他の小さな水中で使用することができ大型無脊椎動物、魚、および対象の種に依存しても両生類。例に使用することができる低酸素17に応答して、それらの機関車の活性を高めるためAmphipodiaのメンバー、または金魚（ キンギョ）低酸素状態16中にその展示水面で"gulping"行動のため。また、水生生物の様々なライフステージは、開発を通じて生物酸素要求の我々の理解を促進するために、このプロトコルで使用することができます。このプロトコルはまた、18 mudpuppies（Necturusのmaculosus）などの両生類で実験することにより低酸素に対する生化学的応答を研究するために利用することができます。さらに、このプロトコルは、より大きな又はより小さな生物及び教育又は研究用途のニーズを満たすようにサイズを拡大または縮小することができます。我々は、プロトコルおよび特定のアプリケーション自体が、広範な生態系の関心のこのprotocoの最大の強みであると感じているがlは、それが分類群と実験の目的全体の偉大な基盤の開発を提供することです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter flask 2 L | Pyrex | 5340 | |
| Rubber Stopper size 6 | Sigma-Aldrich | Z164534 | |
| Nalgene 180 Clear Plastic Tubing | Thermo Scienfitic | 8001-1216 | |
| Whisper 60 air pump | Tetra | ||
| Standard flexible Air line tubing | Penn Plax | ST25 | |
| 0.25 inch Copper tubing | Lowes Home Improvement | 23050 | |
| Male hose barb | Grainger | 5LWH1 | |
| Female Connector | Grainger | 20YZ22 | |
| Heavy Duty Dissolved Oxygen Meter | Extech | 407510 | |
| Nitrogen gas | Matheson TRIGAS | ||
| Radnor AF150-580 Regulator | Airgas | RAD64003036 |
References
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