Summary
Ici, nous présentons un protocole pour tester l’efficacité des thérapies ciblées sélectionnées basées sur la composition génomique d’une tumeur. Le protocole décrit l’identification et la validation des réarrangements structurels d’ADN, l’engraftment des tumeurs des patients dans les souris et les réponses d’essai aux drogues correspondantes.
Abstract
Nous présentons ici une approche intégrative pour tester l’efficacité des thérapies ciblées qui combine la prochaine génération de séquençage technolo-gies, des analyses thérapeutiques de cible et la surveillance de la réponse médicamenteuse à l’aide de xénogreffes dérivées par le patient (PDX). Cette stratégie a été validée en utilisant des tumeurs ovariennes comme exemple. Le protocole de séquençage de la prochaine génération (MPseq) de la paire de partenaires a été utilisé pour identifier les altérations structurelles et suivi d’une analyse des altérations potentiellement ciblées. Les tumeurs humaines cultivées chez des souris immunocompromisées ont été traitées avec des médicaments sélectionnés sur la base des analyses génomiques. Les résultats ont démontré une bonne corrélation entre les réponses prévues et les réponses observées dans le modèle PDX. L’approche présentée peut être utilisée pour tester l’efficacité des traitements combinés et faciliter le traitement personnalisé pour les patients atteints d’un cancer récurrent, en particulier dans les cas où la thérapie standard échoue et il est nécessaire d’utiliser des médicaments hors étiquette.
Introduction
Les xénogreffes dérivées par le patient (PDX), qui sont générées par l’implantation de morceaux de tumeur de patient dans des souris immunodéficientes, ont émergé comme modèle préclinique puissant pour aider les soins anticancéreux personnalisés. Les modèles de PDX ont été développés avec succès pour une variété de malignités humaines. Il s’agit notamment des cancers du sein et de l’ovaire, du mélanome malin, du cancer colorectal, de l’adénocarcinome pancréatique et du cancer du poumon non à petites cellules1,,2,3,,4,5. Le tissu tumoral peut être implanté orthotopiquement ou hétérotopiquement. Le premier, considéré comme plus précis mais techniquement difficile, implique la transplantation directement dans l’organe d’origine tumorale. Ces types de modèles sont censés imiter précisément l’histologie de la tumeur d’origine en raison de la microenvironnement « ature » pour la tumeur6,7. Par exemple, la transplantation orthotopique dans la bourse de l’ovaire de souris a eu comme conséquence la diffusion de tumeur dans la cavité péritonéale et la production d’ascites, typique du cancer ovarien8. De même, l’injection de tumeurs mammaires dans le thoracique au lieu de la glande mammaire abdominale a affecté le taux de succès pdx et le comportement9. Cependant, les modèles orthotopiques nécessitent des systèmes d’imagerie sophistiqués pour surveiller la croissance tumorale. L’implantation hétérotopique de la tumeur solide est généralement effectuée en implantant le tissu dans le flanc sous-cutané d’une souris qui permet une surveillance plus facile de la croissance tumorale et est moins coûteux et chronophage7. Cependant, les tumeurs se sont développées sous-cutanéement rarement métastaser contrairement à ce qu’on observe dans le cas de l’implantation orthotopique10.
Le taux de réussite de l’engraftment a été montré pour varier et dépendent considérablement du type de tumeur. Des tumeurs plus agressives et des spécimens de tissus contenant un pourcentage plus élevé de cellules tumorales ont été signalés pour avoir de meilleurs taux de succès12,13. Compatible avec cela, les tumeurs dérivées de sites métastatiques ont été montrés à l’engraft à des fréquences de 50-80%, tandis que ceux des sites primaires engraft à des fréquences aussi basses que 14%12. En revanche, le tissu contenant des cellules nécrotiques et moins de cellules tumorales viables engraft mal. La croissance tumorale peut également être favorisée par l’ajout de protéines de matrice de membrane de sous-sol dans le mélange de tissu au moment de l’injection dans les souris14 sans compromettre les propriétés de la tumeur originale. La taille et le nombre de morceaux de tissu destinés à l’implantation se sont également avérés pour affecter le taux de succès de l’engraftment. Des taux de prise de tumeur plus élevés ont été rapportés pour l’implantation dans la capsule sub-rénale comparée à l’implantation sous-cutanée due à la capacité de la capsule sub-rénale de maintenir le stroma de tumeur original et de fournir les cellules stromales d’hôte aussi bien15.
La plupart des études utilisent des souris immunodéficientes NOD/SCID, qui manquent de cellules tueuses naturelles16 et ont été montrés pour augmenter l’engreftment de tumeur, la croissance et la métastase par rapport à d’autres souches14. Cependant, une surveillance supplémentaire est nécessaire car ils peuvent développer des lymphomes thymiques dès 3-4 mois del’âge 13. Dans les greffes de tumeur ovarienne cultivées chez les souris SCID, l’excroissance des cellules B a été avec succès inhibée par le rituximab, empêchant le développement des lymphomes mais sans impact sur l’engreffement des tumeurs ovariennes17.
Plus récemment, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) souris, portant une mutation nulle dans le gène codant la chaîne gamma récepteur interleukine 218, est devenu une souche fréquemment utilisée pour la génération de modèles PDX. Les tumeurs des modèles PDX établis passés aux générations futures de souris sont rapportées pour maintenir des propriétés histologiques et moléculaires pour 3 à 6 générations19,20. De nombreuses études ont montré que les résultats du traitement dans les modèles PDX imitent ceux de leurs patients correspondants2,3,4,21,22,23. Le taux de réponse à la chimiothérapie dans les modèles PDX pour le cancer du poumon non-petit et les carcinomes colorectal était similaire à celui des essais cliniques pour les mêmes médicaments24,25. Des études menées dans des modèles PDX, développés pour les patients inscrits dans des essais cliniques, ont démontré des réponses à des médicaments testés similaires à ceux observés cliniquement chez les patientscorrespondants 2,3,4.
Les analyses génomiques à haut débit d’une tumeur patiente en conjonction avec des modèles PDX fournissent un outil puissant pour étudier les corrélations entre des altérations génomiques spécifiques et une réponse thérapeutique. Ceux-ci ont été décrits dans quelques publications26,27. Par exemple, les réponses thérapeutiques à l’inhibiteur egfr cétuximab dans un ensemble de modèles de PDX colorectal portant l’amplification EGFR, les réponses cliniques parallèles au cétuximab dans les patients28.
Il y a quelques défis associés au développement et à l’application des modèles PDX. Parmi ceux-ci est l’hétérogénéité de tumeur29,30 qui peut compromettre l’exactitude de l’interprétation de réponse de traitement comme un clone de cellule simple avec une capacité proliférative plus élevée dans un PDX peut dépasser les autres31, ayant ainsi pour résultat une perte d’hétérogénéité. En outre, lorsque des biopsies de tumeur simple sont employées pour développer PDX, certaines des populations de cellules peuvent être manquées et ne seront pas représentées dans la greffe finale. Plusieurs échantillons de la même tumeur sont recommandés pour l’implantation pour résoudre ce problème. Bien que les tumeurs PDX tendent à contenir tous les types cellulaires de la tumeur originale du donneur, ces cellules sont progressivement substituées par ceux d’origine murine3. L’interaction entre le stroma murine et les cellules tumorales humaines dans les modèles PDX n’est pas bien comprise. Néanmoins, les cellules stromales ont été montrées pour récapituler le microenvironnement de tumeur33.
Malgré ces limitations, les modèles PDX demeurent parmi les outils les plus précieux pour la recherche translationnelle ainsi que la médecine personnalisée pour la sélection des thérapies pour les patients. Les principales applications des PDX comprennent la découverte de biomarqueurs et le dépistage des drogues. Les modèles PDX sont également utilisés avec succès pour étudier les mécanismes de résistance aux médicaments et identifier des stratégies pour surmonter la résistance aux médicaments34,35. L’approche décrite dans le présent manuscrit permet au chercheur d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles dans les tumeurs humaines et d’évaluer l’efficacité des médicaments correspondants in vivo, chez les souris hébergeant des tumeurs engraftées qui ont été initialement caractérisées par la génomique. Le protocole utilise des tumeurs ovariennes engraftées intrapéritoneally mais s’applique à n’importe quel type de tumeur suffisamment agressive pour se développer chez les souris2,3,12.
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Protocol
Les tissus frais des patients consentants présentant le cancer de l’ovaire ont été recueillis au moment de la chirurgie de débulking selon un protocole approuvé par Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB). Toutes les procédures et traitements animaux utilisés dans ce protocole ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Clinique Mayo (IACUC) et ont suivi les lignes directrices sur les soins aux animaux.
1. Séquençage et analyses de paires de mates
REMARQUE : Les tissus congelés frais ou flash doivent être utilisés pour le séquençage de la paire de mates (MPseq). Le matériau incorporé de paraffine n’est pas approprié parce qu’il contient de l’ADN fragmenté.
- Isoler l’ADN du tissu tumoral congelé. Utiliser un spécimen humain original obtenu à partir de matériel chirurgical ou biopsie36.
- Utilisez 1000 ng d’ADN pour faire des bibliothèques MPseq et séquencer comme 2 échantillons par voie sur le séquenceur de prochaine génération (voir tableau des matériaux)36.
- Analyser les données à l’aide d’un ensemble d’algorithmes pour détecter les grandes aberrations chromosomiques (suppressions, insertions, amplifications, inversions et translocations) comme décrit précédemment36,37.
2. Sélection de cibles thérapeutiques
- Utilisez l’outil Panda en libre accès (Pathway et Annotation) ou un outil analogue pour identifier les modifications cibles (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda).
- Dressez une liste des gènes identifiés par MSeq comme modifiés, comme un simple fichier délimité par onglet, à l’aide de symboles génétiques acceptés standard.
REMARQUE : L’exemple inclus comporte l’analyse des amplifications et des gains. - Ajoutez un signe « » à la ligne d’en-tête de la liste pour vous assurer que l’en-tête de la table est transféré à la vue niveau de la voie du logiciel.
- Téléchargez le fichier en cliquant sur l’onglet De navigation Télécharger le jeu d’annotation.
- Affectez une seule icône dans le menu pour représenter les données sous-jacentes en cliquant sur l’icône de choix, puis en cliquant sur l’onglet Finaliser.
- Une fois les fichiers d’annotation téléchargés, identifiez une colonne qui affiche le nombre de gènes annotés par voie. C’est la dernière colonne à droite.
- Utilisez pathway filter sur la partie supérieure gauche de la fenêtre principale pour afficher des voies contenant des gènes d’intérêt.
- Identifier les voies qui ont plus de gènes annotés que ce à quoi on s’attend par hasard. Utilisez la fonction située sous l’onglet Enrichissement.
- Sélectionnez une base de données pour afficher des gènes potentiellement druggables à partir de l’annotation prédéfinie en vérifiant une icône appropriée à gauche de la fenêtre principale (p. ex., DGIdb, PharmGKB).
- Sélectionnez la voie de visualisation en cliquant sur son nom affiché dans la page Observateur de sentiers.
REMARQUE : Les icônes représentant chaque ensemble d’annotation s’affichent à côté du gène associé. Cliquez sur le gène d’intérêt pour ouvrir la page Web GeneCards correspondante. - Sélectionnez les voies qui ont montré les gènes annotés d’intérêt (c.-à-d. modifiés dans une tumeur donnée) et « a » pour les médicaments potentiels pour une analyse plus approfondie.
- Dressez une liste des gènes identifiés par MSeq comme modifiés, comme un simple fichier délimité par onglet, à l’aide de symboles génétiques acceptés standard.
- Utiliser une base de données contenant des médicaments approuvés pour l’application clinique (https://clinicaltrials.gov/) pour recouper les cibles identifiées.
- Prioriser les altérations ciblées pour d’autres tests dans les modèles PDX en effectuant une revue de littérature (par exemple, PubMed) pour confirmer la pertinence à la biologie d’un type particulier de tumeur.
3. Validation des réarrangements génomiques par le séquençage PCR et Sanger
- Concevoir des amorces à l’aide de lectures de séquençage obtenues à partir des données MPseq.
- Choisissez une jonction d’intérêt pour la validation (c.-à-d. la cible thérapeutique potentielle) basée sur les analyses MPseq.
- Concevoir des amorces directionnellement de telle sorte que l’amplicon contient la jonction. Concevoir 2 amorces de chaque côté de la jonction, pour un total de 4, pour augmenter les chances d’amplifier la jonction.
REMARQUE : Amorces de nom selon l’emplacement du cas et du chromosome. - Utilisez des paramètres PCR standard pour la conception de l’amorce et un logiciel de choix. Sélectionnez la température de fusion (60-62 °C) et la teneur en GC (40-60%). Assurez-vous que la séquence d’amorce ne forme pas de dimers, de palindromes ou de boucles d’épingle à cheveux.
- Confirmez que la séquence d’amorce manque d’homologie à d’autres zones du génome humain en la vérifiant à l’aide de BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start).
- Exécutez un PCR pour amplifier la jonction d’intérêt.
- Diluer les amorces avec de l’eau à 10 mM et combiner 10 mL de chaque amorce de sorte que chaque amorce avant soit jumelée à chaque amorce inversée dans un mélange d’amorce.
REMARQUE : Les séquences des amorces de l’exemple sélectionné sont affichées dans le tableau 1. - Étiqueter les tubes à bande de 0,2 mL comme : C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 et T4 où c=contrôle l’ADN génomique humain (commercial), l’ADN tumoral, isolé de la tumeur du patient ou de PDX, et le nombre indique le mélange d’amorce.
- Ajouter 1 mL de chaque mélange d’amorces dans ses tubes étiquetés.
- Préparer le mastermix Taq en combinant les réactifs énumérés au tableau 2, en laissant l’enzyme dans le congélateur jusqu’à ce que nécessaire, en l’ajoutant au mélange à la toute fin.
- Faire 2 mélanges principaux, un pour chaque modèle d’ADN, contrôler l’ADN humain et l’ADN tumoral. Ajouter 24 ml de chaque mélange maître Taq à son tube à bande respectif. Le volume total de réaction est de 25 mL. Vortex très brièvement, puis faire tourner le tube de bande vers le bas.
- Exécutez un PCR dans un thermocycleur. Utilisez les paramètres indiqués dans le tableau 3. Ajuster la température d’anneaux de sorte qu’elle soit au moins 1 °C plus froide que la température de fusion des amorces.
- Conserver le produit PCR terminé à -20 °C (à long terme) ou réfrigéré à 4 °C (à court terme) jusqu’à ce que nécessaire.
- Effectuez une électrophorèse à 1-5 V/cm pour visualiser le produit PCR à l’aide d’un gel agarose de 1,5 %. Laissez 2 mL aliquot du produit à utiliser pour le séquençage Sanger.
- Diluer les amorces avec de l’eau à 10 mM et combiner 10 mL de chaque amorce de sorte que chaque amorce avant soit jumelée à chaque amorce inversée dans un mélange d’amorce.
- Effectuez le séquençage sanger pour confirmer la jonction et identifier le point d’arrêt exact38.
- Utilisez le produit PCR si le PCR a généré un seul produit (bande). Sinon, couper la bande de gel, purifier et soumettre pour le séquençage Sanger avec l’amorce utilisée pour l’amplification.
NOTE : Les tumeurs pour lesquelles des analyses génomiques ont été exécutées alors sont employées pour l’implantation chez la souris.
- Utilisez le produit PCR si le PCR a généré un seul produit (bande). Sinon, couper la bande de gel, purifier et soumettre pour le séquençage Sanger avec l’amorce utilisée pour l’amplification.
4. Engreffement et entretien des tumeurs
- Mettre en place des préparations pour engrafer les tumeurs dans les modèles de souris PDX. Sélectionnez pour les tumeurs d’engraftment pour lesquelles des analyses génomiques seront ou ont été effectuées.
- Assurez-vous qu’une infrastructure de soutien est en place au moment du début de l’élaboration de tous les modèles PDX, y compris des laboratoires et des installations pour animaux dédiés, du personnel technique qualifié et des procédures d’exploitation normalisées détaillées.
- Assurer le transport rapide et le traitement des spécimens car la vitesse est cruciale pour la viabilité cellulaire et l’engreffement réussi.
- Utilisez un environnement stérile pour réduire la contamination bactérienne et fongique des spécimens de traitement et d’engrafting.
- Manipuler les spécimens humains avec prudence, conformément aux politiques institutionnelles concernant les matériaux potentiellement biorisqueux, car ils peuvent abriter des agents pathogènes transmis par le sang.
- Préparer le tissu (0,5-0,7 cm3 en taille) pour l’engraftment en mettant le spécimen chirurgical dans un tube pré-réfrigéré de 50 ml avec 20 ml de milieux de culture tissulaire.
NOTE : Le tissu de tumeur peut être frais ou récupéré du matériel précédemment cryopreserved5. - Confirmer le contenu de la tumeur dans le spécimen en consultant un pathologiste.
- Placez le tissu tumoral dans un plat contenant 10-15 mL de PBS froid, ou des milieux de culture tissulaire tels que RPMI 1640 ou DMEM contenant des antibiotiques (1% de pénicilline et de streptomycine).
- Identifier et isoler le matériel de tumeur viable du tissu normal et nécrotique adjacent avec l’aide d’un pathologiste. Utilisez des forceps stériles et du scalpel pour enlever le matériel nécrotique souligné par un pathologiste.
NOTE : La tumeur peut être implantée intraperitoneally ou sous-cutanéement dans les souris. Suivez l’étape 4.2 pour effectuer une implantation intrapéritonéale ou passez à l’étape 4.3 pour effectuer une engreffement sous-cutanée. Dans cette étude, des thérapies ciblées sélectionnées sur la base d’analyses génomiques ont été testées dans une série de modèles PDX pour le cancer de l’ovaire sérous de haut grade avec l’implantation intrapéritonéale.
- Préparer le tissu pour l’implantation intrapéritoneal (IP) hacher le tissu avec des forceps stériles et un scalpel sur la glace pour faire des morceaux d’environ 1-1,5 mm3 en taille et le mélange avec milieu de culture froide. Injecter 0,3 à 0,5 mL de lisier tumoral à l’aide d’une aiguille de calibre 16-17.
REMARQUE : Toutes les interventions chirurgicales sont effectuées en utilisant des techniques aseptiques. Des gants stériles, des instruments stériles, des fournitures et des matériaux implantés ont été utilisés pour réduire la probabilité d’infection.- Mélanger les morceaux 1:1 avec le milieu de culture de glace-froid et injecter 100 mL intrapéritoneally dans au moins trois souris femelles SCID.
- Couper le tissu tumoral pour l’engrafage sous-cutané à l’aide de forceps stériles, de scalpel ou de ciseaux chirurgicaux en petits fragments, d’environ 2 x 2 mm de taille, et transférer les tissus fragmentés dans une boîte de Pétri pré-réfrigérée sur la glace.
- Ajouter la matrice de membrane froide du sous-sol dans le plat avec le tissu fragmenté (environ 200 mL pour 10 morceaux de tissu), bien mélanger, et laisser les fragments de tissu tremper dans la matrice de membrane du sous-sol froid pendant 10 min.
- Anesthétiser 5 souris femelles NOD/SCID pour les préparer à l’engreffement.
- Injectez chaque souris intrapéritoneally avec la kétamine (150 mg/kg) et la xylazine (10 mg/kg) combinaison.
- Confirmez que la souris est correctement anesthésiée en pinçant la pointe de la queue avec des forceps atraumatiques.
- Retirez doucement entièrement la souris anesthésiée de la chambre et mettez sur la souris un cône de nez qui a l’entrée du vaporisateur et de la sortie du système de récupération de gaz de déchets.
- Mettez l’onguent vétérinaire sur les yeux de souris pour empêcher la sécheresse pendant que sous anesthésie. Préparer la zone où la chirurgie sera effectuée. Utilisez la technique aseptique pour effectuer la chirurgie.
- Assurez-vous que la surface sur laquelle la chirurgie va prendre est non poreuse, scellée et désinfectée avant la chirurgie.
- Commencez la chirurgie avec des instruments stériles (par autoclave, gaz ou stérilisation chimique).
- Utilisez des gants pour manipuler les instruments et maintenir la stérilité des pointes de l’instrument tout au long de la procédure en les submergeant dans l’éthanol entre les étapes de la chirurgie.
- Stériliser le site chirurgical en appliquant 3 gommages alternatifs d’iode et d’alcool. Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles et des forceps pour faire une incision verticale de 5-10 mm sur les deux flancs d’une souris.
- Insérez doucement des forceps droits dans l’espace sous-cutanous pour créer une poche suffisamment grande pour qu’un fragment de tumeur soit placé sous le tampon de graisse.
- Utilisez les forceps droits stériles pour insérer des fragments de tumeur dans la poche préalablement préparée dans chacune des 5 souris.
REMARQUE : Placez 3-4 morceaux de tissu tumoral dans une poche. - Fermez les incisions cutanées à l’aide de colle tissulaire.
- Intraperitone injecter chaque souris avec 100 mL de Rituximab après l’implantation pour inhiber la prolifération des lymphocytes.
- Placez la souris dans une cage sous une lampe thermique pendant environ 20 min jusqu’à ce qu’elle soit récupérée de l’anesthésie. Surveillez les signes vitaux de la souris et assurez-vous d’une hydratation suffisante.
- Retournez la souris à la compagnie d’autres souris après qu’elle ait récupéré de l’anesthésie et ait commencé à avoir de la nourriture et de l’eau. Fournir des soins postopératoires et un suivi conformément aux lignes directrices institutionnelles. Vérifiez les signes de douleur et de détresse tous les jours pendant 3 jours consécutifs après la chirurgie.
REMARQUE : Les critères de douleur ou de détresse comprennent la nécrose ou l’ulcération, la perte de poids/notation de l’état du corps, les signes comportementaux tels que le niveau d’activité, la fonction motrice et la posture. - Vérifiez régulièrement les souris pour la formation de tumeur bi-hebdomadaire jusqu’à ce que les tumeurs atteignent la taille de 0.5 cm de diamètre tel que mesuré par un étrier.
- Évaluer le score de santé de chaque souris comme dérivé de l’apparence, le comportement et l’état du corps39. Utilisez des scores de ≤6 comme critères pour les souris moribondes à sacrifier par inhalation de dioxyde de carbone.
5. Tester les réponses aux cibles identifiées génomiquement dans les modèles PDX
- Commencez les traitements ciblés sélectionnés lorsque les tumeurs sont palpables et atteignent 0,5 cm3 selon une échographie.
- Avant d’effectuer une échographie de l’abdomen enlever la fourrure abdominale de la souris et d’appliquer lubrifiant stérile gelée.
- Utilisez une machine à ultrasons avec un transducteur pour obtenir des images avec la tumeur placée en coupe transversale. Faire 3 mesures par session pour chaque animal et la valeur moyenne pour une évaluation plus précise de la taille de la tumeur.
- Analyser les images à l’aide du logiciel disponible40.
- Administrer la chimiothérapie composée d’un mélange de carboplatine à 51 mg/kg et de paclitaxel à 15 mg/kg intrapéritoneally (IP) une fois par semaine pour une durée totale de traitement de 4-6 semaines. Assurez-vous que le volume total pour l’injection ne dépasse pas 0,2 mL.
- Faire une solution mk-220641 stock dans 30% cyclodextrine (par exemple, Captisol) et livrer par gavage oral à 120 mg/kg par jour pendant 4 semaines consécutives.
- Préparer la souris pour le gavage oral en la tenez en pinçant la peau du dos et en la mettant en arrière, de sorte que la tête et les membres de la souris sont immobilisés.
- Insérez la sonde de gavage à l’arrière de la gorge de la souris jusqu’à ce que la sonde atteigne l’œsophage. Assurez-vous que la sonde n’est pas insérée trop loin, car les poumons de la souris peuvent perforer, causant la mort.
- Faire une solution mk-866942 stock dans l’éthanol à 25 mg/mL. Diluer dans un véhicule contenant 5,2% Tween 80, 5,2% PEG400 dans de l’eau stérile pour les injections IP à 10 mg/kg pendant 5 jours toutes les deux semaines, avec une durée totale du traitement de 4 semaines.
REMARQUE : Le volume injecté chez les souris doit être de 50 à 120 mL, selon le poids de l’animal. - Utilisez 7-8 souris par groupe de traitement pour avoir assez de puissance statistique pour détecter les différences43,44.
- Évaluer le poids corporel et l’état général des souris en thérapie quotidienne. Retenir les médicaments si le poids d’un animal diminue de 20 % ou plus de son poids initial.
- Évaluez la taille de la tumeur chaque semaine en utilisant le balayage d’ultrason. Assurez-vous que l’individu effectuant la surveillance de la croissance de tumeur est aveuglé au traitement pour assurer la notation impartiale des réponses.
REMARQUE : Les petits laboratoires peuvent employer 2 personnes différentes pour administrer le traitement et la surveillance par ultrasons.
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Representative Results
Les tissus provenant de tumeurs ovariennes réséquées au moment des chirurgies de débulking ont été prélevés conformément aux directives de la CISR et utilisés pour 1) la caractérisation génomique et 2) l’engraftment chez les souris immunocompromisées (figure 1). Le protocole de séquençage de la paire demates 36,37 a été utilisé pour identifier les altérations structurelles de l’ADN, y compris les pertes, les gains et les amplifications. Une parcelle génomique représentative illustrant un paysage de changements génomiques dans une tumeur (désignée comme OC101) est présentée à la figure 2. Des tumeurs de sous-type séreuses de qualité supérieure, des gains multiples (lignes bleues) et des suppressions (lignes rouges) ont été trouvés, indiquant des niveaux élevés d’instabilité génomique, aussi bien que des pertes et des gains chromosomiques, indicatifs de l’aneuploïdy, ont été observés. Sur une moyenne 300-700 altérations totales sont identifiés dans les tumeurs de sous-type séreuse de haut grade45. Les analyses suivantes ont indiqué quelques modifications d’ADN qui étaient potentiellement targetables avec des drogues médicalement pertinentes. L’altération la mieux classée pour l’intervention thérapeutique dans la tumeur d’OC101 était une amplification au chromosome 17 impliquant ERBB2 (figure 2 et figure 3A). ERBB2 est un gène qui code pour le récepteur HER2 qui est connu lors de la dimréisation avec EGFR, HER3 ou HER4 pour activer ras /Erk et PI3K/AKT voies de signalisation et de promouvoir la croissance cellulaire, la migration cellulaire et l’invasion. Les inhibiteurs her2 (p. ex., les anticorps monoclonaux pertuzumab et le trastuzumab) sont efficaces dans le traitement des patientes atteintes d’un cancer du sein lorsque les tumeurs surexpriment la protéine HER2. La thérapie anti-HER2 pour le cancer de l’ovaire, cependant, n’est pas approuvée par la FDA.
La comparaison du profil génomique de la tumeur des patients donneurs (Figure 1) à celle d’un modèle PDX correspondant (non montré) a indiqué une similitude frappante, compatible avec toutes les études précédentes rapportant la proximité moléculaire des tumeurs originales à leurs dérivés pdx.
Pour valider les résultats de MPseq au niveau de l’ADN, plusieurs ensembles d’amorces spécifiques ont été conçus pour les bords de la région amplifiée contenant le gène ERBB2, et PCR a été réalisé à l’aide de l’ADN isolé de la tumeur d’origine ainsi que d’une tumeur propagée pendant plusieurs générations chez les souris. Une image de gel représentative des produits amplifiés utilisant deux ensembles différents d’amorces est indiquée à la figure 3B. Aucune bande n’a été détectée lorsque l’ADN génomique mis en commun normal (désigné comme C), qui ne contenait pas d’amplification du locus ERBB, a été amplifié. La purification des produits du séquençage du gel et de Sanger (non indiqué) a confirmé en outre l’altération prévue par MPseq. Une validation plus poussée a été effectuée en examinant l’expression de la protéine HER2 dans la tumeur PDX correspondante utilisant l’immunoblotting. L’analyse a révélé un niveau élevé de protéine HER2 (le résultat n’est pas montré), compatible avec l’amplification observée du gène ERBB2.
Dans l’ADN d’une tumeur ovarienne différente (désigné T14) de nombreux gains régionaux ont été observés. Il s’agissait notamment des gènes AKT2 et RICTOR (figure 3C). Les deux étaient d’un grand intérêt d’un point de vue thérapeutique que les inhibiteurs de AKT2 et mTOR, qui RICTOR associe avec, sont disponibles et actuellement dans les essais cliniques. Comme il n’y avait pas de lectures de paires de compagnons couvrant le voisinage de l’un ou l’autre gène, la simple validation pcr du gain tel que détecté par MPseq n’était pas possible. Nous avons donc testé le niveau d’expression des protéines correspondantes par immunoblotting. Des niveaux élevés d’AKT et de RICTOR ont été observés (Figure 3D) suggérant que le traitement avec des drogues ciblées est justifié.
Pour tester la sensibilité de cette tumeur aux inhibiteurs de l’AKT et du mTOR, les souris PDX atteintes d’une tumeur T14 implantée intrapéritone ont été élargies et randomisées pour ne recevoir que la chimiothérapie (carboplatine/paclitaxel) ou une combinaison de chimiothérapie avec l’inhibiteur de l’AKT MK-220641 ou inhibiteur mTOR MK-866942. La chimiothérapie a été administrée à des souris dans le bras combiné pendant 2 semaines avant l’ajout de la thérapie ciblée (figure 4). Des mesures d’ultrason ont été prises hebdomadairement pour surveiller la régression/croissance de tumeur.
Chaque bras de traitement contenait pas moins de 7 souris. Ce nombre était suffisant pour observer les différences de réponses entre les groupes tout en maintenant les coûts de l’étude à une note considérablement inférieure. Moins de souris (trois à quatre) peuvent être employées dans le groupe non traité de contrôle, car les variations individuelles du taux de croissance de tumeur sont négligeables et la croissance est normalisée à une taille de tumeur à laquelle le traitement dans d’autres bras commence.
Aucune différence n’a été observée entre les groupes traités par chimiothérapie et les groupes non traités au cours des 3 premières semaines d’observation (non indiqué). Une réduction significative de la charge de tumeur (médiane de 58%) a été observée dans le groupe traité de chimiothérapie par la fin de la semaine 6. Un avantage supplémentaire sur la chimiothérapie seule a été observé dans les groupes qui ont reçu une combinaison de chimiothérapie avec des thérapies ciblées. La différence est devenue évidente aux semaines 4 et 3 pour MK-8669 (figure 4A) et MK-2206 (figure 4B) respectivement.
Les animaux ont été euthanasiés et le tissu de tumeur a été recueilli pour des analyses moléculaires de la réponse de traitement à la fin de l’essai de traitement à la semaine 7. À cette fin, les quantités de S6 kinase totale et phosphorylée (figure 5A,B),AKT et mTOR (figure 5C,D) ont été déterminées à l’aide de l’immunoblotting. La protéine ribosomale S6 kinase est un messager en aval de la voie AKT-mTOR, connue pour être régulée et phosphorylée lors de la stimulation de l’axe AKT-mTOR par des facteurs de croissance pour favoriser la survie et la croissance des cellules. La comparaison des niveaux de ces protéines dans les tumeurs non traitées ou traitées avec la chimiothérapie PDX aux souris qui ont reçu des inhibiteurs d’AKT ou de mTOR a montré une diminution marquée dans les deux derniers (figure 5), indiquant l’efficacité de la thérapie ciblée au niveau moléculaire. Des ajustements au régiment de traitement, en ce qui concerne le moment de l’application des médicaments combinés et la durée de la thérapie, devraient être effectués et testés pour obtenir de meilleures réponses.
| Nom de l’amorce | Séquence | Primer Mix | Amorces combinées | ||
| OC101 17a-17b R1 | CTGGTCTCTGGGAAATAGACACTAGATAAATCATC | 1 | OC101 F1 et R1 | ||
| OC101 17a-17b R2 | GCTCAAGAACAACACCTAGTAGTTTTTTTTGC | 2 | OC101 F1 et R2 | ||
| OC101 17b-17a F1 | GGATTACKGGGAAGGTGCTACCICTTG | 3 | OC101 F2 et R1 | ||
| OC101 17b-17a F2 | AATGCCCTAGCATACTTTCCCCCACTG | 4 | OC101 F2 et R2 | ||
Tableau 1 : Amorces utilisées pour la validation de l’altération OC101chromosome 17.
| Réactif | Quantité à ajouter pour 1 réaction (μL) | Quantité à ajouter pour 4 réactions (μL). [Multipliez par 4,3 pour en faire assez pour chaque mélange d’amorces (4)] |
| Eau sans nucléase | 20.45 | 89.94 |
| Tampon 10x (Easy A) | 2.5 | 10.75 |
| dNTPs 10 mM | 0.5 | 2.15 |
| Modèle d’ADN (concentration >10 ng/μL) | 0.3 | 1.29 |
| Taq Polymerase | 0.25 | 1.08 |
Tableau 2 : configuration pcr pour valider une jonction.
| Temp (C) | Heure | |
| 94 | 5 min | |
| 94 | 40 s | 35 cycles |
| 59 | 40 s | |
| 72 | 2 min | |
| 72 | 5 min | |
| 4 | Tenir |
Tableau 3 : Conditions de vélo pour que le PCR valide une jonction.
Figure 1 : Représentation schématique de la stratégie de test de thérapie guidée par la génomique à l’aide de modèles PDX pour le carcinome ovarien sérous. La coloration de H&E de la tumeur ovarienne est montrée (en haut). Barre d’échelle =100 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Caractérisation génomique des tumeurs ovariennes à l’aide de MPseq. Graphique montrant le paysage des altérations structurelles et des changements de numéros de copie détectés par MPseq. L’axe X s’étend sur la longueur du chromosome avec le numéro de position du chromosome indiqué. Chaque chromosome est indiqué sur l’axe Y droit et gauche. La hauteur des traces horizontales pour chaque chromosome indique le nombre de lectures détectées pour les fenêtres de paire de base de 30 k. Les numéros de copie d’ADN sont indiqués par couleur, le gris représentant l’état normal de copie 2N, le rouge correspondant aux suppressions et les gains bleus. Les lignes noires de connexion correspondent aux réarrangements chromosomiques. Les modifications apportées au locus ERBB2 sont représentées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Sélection des modifications ciblées et validation. (A) Un segment en gros plan de l’intrigue du génome montré dans fig.1 illustrant une amplification du gène ERBB2 sur le chromosome 17 (en bleu). Les nombres de chromosomes sont comme indiqué. (B) Analyse de validation des points d’arrêt au locus ERBB2, telle qu’identifiée par MPseq à l’aide de l’amplification pcr. C est un contrôle de l’ADN génomique mis en commun, OC101 est l’ADN de la tumeur du patient, M est une échelle d’ADN. (C) Un gros plan des segments de la parcelle de génome pour une autre tumeur ovarienne montrant des gains (indiqués par la ligne bleue) au locus D’AKT (en haut) et au gène RICTOR (en bas). Les chromosomes sont comme indiqué. (D) Analyse de validation de l’expression des protéines de la voie AKT/mTOR par immunoblotting utilisant le tissu tumoral de PDX (T14), des altérations génomiques pour lesquelles sont représentées dans C. 30 mg de protéine totale et des anticorps spécifiques à AKT, RICTOR, p-mTOR ont été utilisés. MAPK a servi de contrôle de chargement. Pos con est une tumeur indépendante utilisée comme un contrôle positif. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Comparaison des réponses à la chimiothérapie seules et combinée avec la thérapie ciblée dans les gains de tumeur hébergeant aux gènes AKT2 et RICTOR avec des drogues correspondantes. Réponses de traitement à une combinaison de chimiothérapie et de médicament anti-mTOR MK-8669 (A) ou inhibiteur du pan-AKT MK2206 (B) par rapport à la chimiothérapie seule. Le temps d’administration pour chaque traitement et la durée sont indiqués par les flèches. Les volumes sont exprimés en pourcentage du volume initial au début du traitement en tant que moyenne +/- DS. La chimio est la chimiothérapie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Comparaison des changements moléculaires obtenus par chaque traitement tel que déterminé par l’analyse de l’immunoblotting. (A) Les niveaux de S6 et de phospho-S6, l’effecteur en aval de la voie AKT-mTOR sont indiqués. 30 mg de protéines totales et d’anticorps spécifiques à S6 et p-S6 ont été utilisés. GAPDH a été utilisé comme un contrôle de chargement. La quantification des niveaux de protéines normalisés au niveau GAPDH est indiquée dans (B) (C) Niveaux de mTOR, p-mTOR, AKT et p-AKT comme détecté par immunoblotting. GAPDH a été utilisé comme un contrôle de chargement. (D) Quantification des niveaux de protéines normalisés au niveau GAPDH. NT n’est pas traitée, la chimio est la chimiothérapie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous décrivons l’approche et les protocoles que nous avons utilisés pour mener un « essai clinique » dans des modèles PDX qui tirent parti des caractéristiques moléculaires de la tumeur obtenues par le profilage génomique pour déterminer le meilleur choix de médicaments pour le test. Plusieurs plates-formes de séquençage sont actuellement utilisées pour la caractérisation génomique des tumeurs primaires, y compris le séquençage du génome entier, RNAseq et des panneaux génétiques personnalisés. Pour le carcinome ovarien sérous de haut grade, MPseq pour identifier des changements structurels, des réarrangements d’ADN et des changements de nombre de copie, est particulièrement utile en raison du degré élevé d’instabilité génomique observé dans ce type de tumeur. Le deuxième avantage de la plate-forme MPseq est qu’elle couvre l’ensemble du génome, mais coûte beaucoup moins cher que d’autres technologies de séquençage complètes. MPseq, cependant, n’est pas approprié pour la détection de mutation de point car la couverture de base n’est pas suffisante, atteignant seulement 8-10x. L’une des limites de l’utilisation de MPseq seul pour la caractérisation génomique d’une tumeur est la présence de réarrangements chromosomiques complexes en grappes, dont l’analyse ne prédit pas l’expression de gènes d’intérêt touchés. Une jonction détectée par MPseq prédite pour créer un gène de fusion putative qui valide dans l’ADN par PCR peut ne pas être exprimée en raison d’un décalage de cadre ou de petites suppressions et insertions dans la région de promoteur. De même, les gains chromosomiques et les amplifications pour les cibles thérapeutiques potentielles doivent être soigneusement évalués et validés sur le niveau d’ARN ou de protéines afin d’assurer l’expression du gène d’intérêt.
Bien que, la compose moléculaire de la tumeur est largement préservée après propagation chez les souris pendant plusieurs générations, des changements dans les niveaux d’expression des gènes clés peuvent se produire au fil du temps soit reflétant l’évolution tumorale, la sélection clonale ou la réponse adaptative à l’environnement murine. Ainsi, la validation d’une altération destinée à l’intervention thérapeutique dans la tumeur originale de donneur et la tumeur de PDX est critique. Pour la tumeur isolée des modèles de PDX l’ARN et la protéine peuvent être utilisés pour interroger le niveau d’expression car le matériel est abondant. L’un ou l’autre peut être choisi pour recouper l’expression dans la tumeur d’origine, selon la disponibilité et le type du tissu stocké, et la disponibilité d’anticorps pour la détection de protéine correspondante. Le modèle PDX est particulièrement précieux dans les thérapies de combinaison de test que le réglage in vivo permet la surveillance des effets indésirables, ainsi que des ajustements de dosage ou de durée dans le régime de traitement.
Le choix entre l’engrafage orthotopique et sous-cutadé peut être fait en fonction des questions spécifiques abordées dans l’étude. Cependant, il est important de garder à l’esprit que la sensibilité des tumeurs xénogreffed à la thérapeutique peut être modulée par le site de l’implantation46. D’autre part, aucune preuve n’a encore été rapportée sur la découverte de médicaments montrant une réponse thérapeutique dans les modèles orthotopiques, mais absents dans le PDX9sous-implanté sous-implanté .
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr Lin Yang et Faye R. Harris, MS, pour leur aide dans la conduite d’expériences. Ce travail a été appuyé par le don de M. et Mme Neil E. Eckles au Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
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