Summary
L’objectif de ce protocole est de manipuler directement les récepteurs de la zone tegmentale ventrale pour étudier leur contribution à la libération subseconde de dopamine.
Abstract
La libération phasique de dopamine (DA) de la zone tegmentale ventrale (VTA) vers le noyau accumbens joue un rôle central dans le traitement de la récompense et l’apprentissage par renforcement. Comprendre comment les diverses entrées neuronales dans la libération phasique de DA de contrôle VTA peuvent fournir une meilleure image des circuits qui contrôlent le traitement des récompenses et l’apprentissage par renforcement. Nous décrivons ici une méthode qui combine des perfusions intra-VTA d’agonistes et d’antagonistes pharmacologiques avec une libération phasique de DA évoquée par stimulation (perfusion et stimulation combinées, ou CIS) mesurée par voltampérométrie cyclique à balayage rapide in vivo (FSCV). En utilisant CIS-FSCV chez des rats anesthésiés, une réponse DA phasique peut être évoquée en stimulant électriquement le VTA avec une électrode bipolaire équipée d’une canule tout en enregistrant dans le noyau accumbens. Les agonistes ou antagonistes pharmacologiques peuvent être perfusés directement au site de stimulation pour étudier les rôles spécifiques des récepteurs VTA dans la libération phasique de DA. Un avantage majeur de CIS-FSCV est que la fonction du récepteur VTA peut être étudiée in vivo, en s’appuyant sur des études in vitro.
Introduction
La libération phasique de dopamine (DA) de la zone tegmentale ventrale (VTA) vers le noyau accumbens (NAc) joue un rôle vital dans les comportements liés à la récompense. Les neurones VTA DA passent d’un tir de type tonique (3-8 Hz) à un tir de type rafale (>14 Hz)1, qui produit une libération phasique de DA dans le NAc. Le VTA exprime une variété de récepteurs somatodendritiques qui sont bien positionnés pour contrôler le passage du tonique au déclenchement en rafale2,3,4,5. L’identification de ceux de ces récepteurs, et de leurs entrées respectives, contrôle la libération phasique de DA approfondira notre compréhension de la façon dont les circuits liés à la récompense sont organisés. Le but de la méthodologie décrite ici, combinée à la perfusion et à la stimulation avec la voltampérométrie cyclique à balayage rapide (CIS-FSCV), est d’évaluer rapidement et de manière robuste la fonctionnalité des récepteurs VTA dans la conduite de la libération phasique de DA.
Le terme perfusion et stimulation combinées (CIS) fait référence à la manipulation pharmacologique des récepteurs sur un groupe de neurones (ici le VTA) et à la stimulation de ces neurones pour étudier la fonction du récepteur. Chez le rat anesthésié, nous stimulons électriquement le VTA pour évoquer un grand signal DA phasique (1-2 μM) dans le noyau NAc, tel que mesuré par voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV). Les perfusions de médicaments pharmacologiques (c.-à-d. agonistes/antagonistes des récepteurs) au site de stimulation peuvent être utilisées pour mesurer la fonction des récepteurs VTA en observant le changement subséquent dans la libération phasique évoquée de DA. FscV est une approche électrochimique qui bénéficie à la fois d’une résolution spatiale (50-100 μm) et temporelle (10 Hz) élevée, et est bien adaptée pour mesurer les événements DA phasiques liés à la récompense6,7. Cette résolution est plus fine que d’autres mesures neurochimiques in vivo, telles que la microdialyse. Ainsi, ensemble, CIS-FSCV est bien adapté pour évaluer la régulation des récepteurs VTA de la libération phasique de dopamine.
Une façon courante d’étudier la fonction du récepteur VTA consiste à utiliser une combinaison d’approches électrophysiologiques qui traitent de la façon dont ces récepteurs modifient la vitesse de tir des neurones1,8. Ces études sont très utiles pour comprendre quels récepteurs sont impliqués dans le déclenchement de DA lors de l’activation. Cependant, ces études ne peuvent que suggérer ce qui pourrait se produire en aval au terminal axonal (c.-à-d. libération d’un neurotransmetteur). CIS-FSCV s’appuie sur ces études électrophysiologiques en répondant à la façon dont la sortie du déclenchement en rafale de VTA, la libération phasique de DA, est régulée par des récepteurs situés sur les dendrites VTA et les corps cellulaires. Ainsi, CIS-FSCV est bien adapté pour s’appuyer sur ces études d’électrophysiologie. À titre d’exemple, l’activation des récepteurs nicotiniques peut induire un déclenchement en rafale dans le VTA9,et le CIS-FSCV chez le rat anesthésié a été utilisé pour montrer que l’activation du récepteur nicotinique de l’acétylcholine (nAChR) dans le VTA contrôle également la libération phasique de DA dans le NAc10,11.
L’examen mécaniste de la régulation phasique de l’AD est également couramment étudié en utilisant des préparations de tranches parallèlement à l’application de médicaments au bain. Ces études se concentrent souvent sur la régulation présynaptique de la libération phasique de DA par les terminaux dopaminergiques, car les corps cellulaires sont souvent retirés de la tranche12. Ces préparations sont précieuses pour étudier les effets des récepteurs présynaptiques sur les terminaux dopaminergiques, tandis que cis-FSCV est mieux adapté pour étudier les effets des récepteurs somatodendritiques sur les neurones dopaminergiques, ainsi que les entrées présynaptiques à la VTA. Cette distinction est importante, car l’activation du récepteur somatodendritique dans l’ATV peut avoir un effet différent de celui de l’activation du récepteur présynaptique NAc. En effet, le blocage des nAChRs présynaptiques dopaminergiques dans le NAc peut élever la libération phasique de dopamine lors du tir en rafale13,alors que l’inverse est vrai chez VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV est une approche idéale pour étudier la capacité des récepteurs VTA à réguler la libération phasique de DA. Il est important de noter que cette approche peut être effectuée chez un rat intact, qu’il soit anesthésié ou en mouvement libre. Cette approche convient aux études aiguës, à l’étude de la fonction des récepteurs dans son état de base10,14 ainsi qu’aux études à long terme qui peuvent évaluer les changements fonctionnels dans un récepteur après une exposition à un médicament ou une manipulation comportementale11,15.
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Protocol
Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (NIH) et ont été approuvées par le Elizabethtown College et le Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Ce protocole est spécifique à la préparation anesthésiée du rat à l’aide de CIS-FSCV.
1. Préparations préchirurgicales
- Préparation de la solution d’électrode
- Pour faire la solution de remblayage de l’électrode, préparer une solution d’acétate de potassium 4 M avec 140 mM de chlorure de potassium16.
- Préparation des électrodes
- À l’aide de l’aspiration sous vide, insérez une fibre de carbone T-650 (7 μm de diamètre) dans un capillaire en verre borosilicate (longueur = 100 mm, diamètre = 1,0 mm, diamètre intérieur = 0,5 mm).
- Une fois que la fibre de carbone a été placée à l’intérieur du capillaire en verre, placez le capillaire en verre dans un extracteur d’électrode vertical, avec l’élément chauffant à peu près au milieu du capillaire. Réglez le chauffage sur 55 avec l’aimant éteint.
- Une fois le capillaire tiré, soulevez soigneusement le support capillaire supérieur afin que l’extrémité de l’électrode ne soit pas entourée par l’élément chauffant.
- À l’aide de ciseaux tranchants, coupez la fibre de carbone qui relie encore les deux morceaux du capillaire. Il en résultera deux microélectrodes distinctes en fibre de carbone.
- Sous un microscope optique, coupez soigneusement la fibre de carbone exposée avec un scalpel pointu, de sorte que la fibre de carbone s’étende environ 75-100 μm au-delà de l’extrémité du verre.
- À l’aide d’un microscope optique, assurez-vous que l’électrode est exempte de fissures le long du capillaire. Assurez-vous également que le joint, où la fibre de carbone sort du capillaire, est difficile à remarquer et exempt de fissures.
REMARQUE: Un bon joint aidera à réduire le bruit pendant les enregistrements. Voir les études publiées17,18,19 pour un protocole plus détaillé.
- Fabrication d’électrodes de référence
- Souder une épingle en or à un fil d’argent de 5 cm.
- Fixez l’anode à un trombone métallique ou à un autre conducteur, la cathode à une broche et appliquez une tension (~ 2 V) pendant que le trombone et le fil d’argent sont immergés dans 0,1 M HCl.
- Arrêtez la tension une fois qu’un revêtement blanc (AgCl) apparaît sur le fil d’argent.
- Préparation de l’électrode pour l’implantation
- Souder une broche en or à un mince fil isolé (~10 cm de longueur, <0,50 mm de diamètre).
- Retirez ~5 cm d’isolant du fil opposé à la broche en or.
- Remplissez l’électrode environ à mi-chemin avec une solution d’électrode.
- Insérez du fil isolé dans l’électrode.
REMARQUE: Le fil doit entrer en contact avec la fibre de carbone à l’intérieur de l’électrode.
2. Implantations d’électrodes
- Administrer aux rats Sprague Dawley adultes et mâles (250−450 g) une injection intrapéritonéale (1,5 g/kg ou 1 mL/kg de volume) de 0,5 g/mL d’uréthane dissous dans une solution saline stérile. Commencez par une dose initiale d’uréthane de 1,0−1,2 g/kg. Si l’animal réagit toujours au test de stimulation nocif (pincement de la queue) 20 minutes après l’administration d’uréthane, administrer une dose supplémentaire de 0,3 à 0,5 g/kg d’uréthane pour une dose totale de 1,5 g/kg.
REMARQUE: Pour la préparation de la solution d’uréthane à 0,5 g / mL, ajouter 10 g d’uréthane à 10 g (~ 10 mL) de solution saline. L’uréthane est cancérigène et doit être manipulé avec précaution. L’uréthane est un anesthésique important, car il ne modifie pas les niveaux de dopamine, comme le font d’autres anesthésiques tels que la kétamine / xylazine et l’hydrate de chloral20,21. - Une fois que l’animal est profondément anesthésié et qu’il ne réagit pas aux stimuli nocifs (p. ex., pincement des orteils), placez-le dans le cadre stéréotaxique. Appliquez un lubrifiant ophtalmique sur chaque œil du rat.
REMARQUE: Il s’agit d’une chirurgie de non-survie, mais une bonne technique aseptique est encouragée. - Nettoyez le cuir chevelu du rat à l’aide d’un gommage en deux étapes (c’est-à-dire un gommage à l’iodopovidone suivi d’un gommage à l’éthanol à 70%; effectuez avec une répétition en 3 cycles).
- Coupez le tissu du cuir chevelu à l’aide d’une pince à épiler à aiguille stérilisée et de ciseaux chirurgicaux. Retirez une quantité importante de tissu pour faire de la place pour les différentes implantations décrites ci-dessous.
- Nettoyez doucement la surface du crâne à l’aide d’applicateurs de pointe en coton stérilisé. Appliquez ensuite 2−3 gouttes de peroxyde d’hydrogène à 3% pour aider à identifier le lambda et le bregma.
- À l’aide d’une perceuse stéréotaxique ou manuelle (1,0 mm, ~20 000 tr/min), percez un trou de 1,5 mm de diamètre, 2,5 mm avant la bregma et latéral de 3,5 mm à la bregma. Implantez partiellement (environ à mi-chemin, jusqu’à ce qu’elle soit fermement en place) une vis (1,59 mm O.D., 3,2 mm de long) dans ce trou. Il est recommandé d’utiliser une solution saline stérile pour irriguer pendant le forage afin de prévenir les blessures thermiques.
- Pour l’électrode de référence, percer un trou de 1,0 mm de diamètre 1,5 mm avant et 3,5 mm latéral à la bregma, dans l’hémisphère gauche.
- À la main, insérez ~ 2 mm de fil de référence dans ce trou, tout en enroulant le fil de référence autour et sous la tête de la vis implantée.
- Implantez complètement la vis en épinglant l’électrode de référence en place.
- Dans l’hémisphère droit, percer un trou de 1,5 mm de diamètre 1,2 mm avant et 1,4 mm latéral à la bregma.
- Retirez doucement la dure-mère à l’aide d’une pince à épiler.
- Pour l’électrode stimulante, percer un trou carré (2 mm antérieur-postérieur, 5 mm médial-latéral) centré à 5,2 mm postérieur et 1,0 mm latéral à la bregma.
- À l’aide des barres de bras stéréotaxiques, abaissez l’électrode stimulante bipolaire / canule de guidage à 5 mm sous la dure-mère. En cas de saignement lors de l’implantation de l’électrode, utilisez des cotons-tiges stériles et de la gaze pour minimiser les saignements.
REMARQUE: L’électrode stimulante bipolaire utilisée dans cette méthode est préinstallée avec une canule guide (Table des matériaux). La canule interne utilisée avec cet article doit être rincée avec les broches de l’électrode stimulante bipolaire lorsqu’elle est complètement insérée dans la canule guide. Cela permettra à la canule interne de s’asseoir directement entre les deux broches du stimulateur, qui se trouvent à environ 1 mm l’une de l’autre. Un protocole similaire est décrit ailleurs14. - À l’aide des barres de bras stéréotaxiques, abaissez la microélectrode en fibre de carbone de 4 mm sous la dure-pierre. Cet emplacement se trouve dans la partie la plus dorsale du striatum.
- Connectez le fil de référence et la fibre de carbone à un potentiostat.
- Appliquer une forme d’onde triangulaire (-0,4−1,3 V, 400 V/s) pendant 15 min à 60 Hz, puis à nouveau pendant 10 min à 10 Hz.
REMARQUE: En règle générale, lors de l’application de formes d’onde sur des microélectrodes en fibre de carbone dans le cerveau, des groupes d’oxyde sont ajoutés à la surface de la fibre de carbone. L’équilibre de cette réaction doit être atteint avant l’enregistrement; sinon, une dérive importante se produira19. Le cycle de l’électrode à des fréquences plus élevées (60 Hz) permet à la fibre de carbone d’atteindre l’équilibre plus rapidement.
3. Optimiser la fibre de carbone et stimuler l’emplacement des canules d’électrode/guide
- Réglez le stimulateur pour produire une forme d’onde électrique bipolaire, avec une fréquence de 60 Hz, 24 impulsions, un courant de 300 μA et une largeur d’impulsion de 2 ms / phase.
- Abaissez doucement le stimulateur par incréments de 0,2 mm de 5 mm à 7,8 mm sous la dure-mère. À chaque incrément, stimulez le VTA.
REMARQUE: À des profondeurs plus dorsales (5−6 mm), la stimulation du cerveau provoquera généralement (~ 80% du temps) des contractions des moustaches du rat. À d’autres profondeurs, les moustaches cesseront de se contracter, ce qui se produit entre 7,5 et 8,2 mm sous la dure-mère. Lorsque les moustaches cessent de se contracter, l’électrode stimulante sera près ou au niveau du VTA. Cela ne se produira pas chez tous les rats, et l’absence de contractions de moustaches ne doit pas être considérée comme un signe que l’électrode stimulant bipolaire / canule de perfusion est déplacée. Les contractions des moustaches peuvent ne pas se produire pour tous les anesthésiques (p. ex. isoflurane). - Continuer à abaisser l’électrode stimulante bipolaire / canule guide jusqu’à ce qu’une stimulation produise une libération phasique de DA au niveau de la microélectrode en fibre de carbone (actuellement dans le striatum dorsal).
REMARQUE: La libération de DA dans le striatum dorsal ne se produira pas toujours si l’électrode bipolaire est implantée dans le VTA, mais l’observation de la libération de DA dans le striatum dorsal lors de la stimulation VTA est généralement un bon signe qu’un bon signal sera observé dans le noyau NAc. - Abaissez la microélectrode en fibre de carbone jusqu’à ce qu’elle se trouve à au moins 6,0 mm sous la dure-pierre. C’est la partie la plus dorsale du noyau NAc.
- Stimulez le VTA et enregistrez l’amplitude maximale du pic DA.
- Abaissez ou soulevez la microélectrode de fibre de carbone sur le site qui produit la plus grande libération de DA.
- Assurez-vous que le pic de la réponse DA est un pic d’oxydation clair à 0,6 V et un pic de réduction à -0,2 V. Ces pics sont révélateurs de DA.
4. Combinaison de perfusion et de stimulation enregistrement FSCV
REMARQUE : La figure 1 montre la chronologie de l’enregistrement avant et après la microinfusion VTA.
- Une fois que la fibre de carbone et l’emplacement de la canule de stimulation de l’électrode / du guide ont été optimisés, stimulez pendant environ 20 à 30 minutes.
REMARQUE: Sous les paramètres de stimulation actuels, ne pas stimuler plus d’une fois toutes les 3 minutes, pour permettre le rechargementvésiculeux 22. - Après avoir atteint une base de référence stable (variation de <20% sur cinq stimulations), abaissez doucement la canule interne à la main dans la canule guide qui est préinstallée dans le stimulateur bipolaire.
- Prenez 2−3 enregistrements de base supplémentaires pour vous assurer que l’insertion de la canule elle-même n’a pas provoqué de changement dans le signal évoqué. Dans certains cas, l’insertion et le retrait de la canule interne peuvent endommager le VTA. Si le signal change radicalement au cours de cette période de référence (>20 %), prenez 3 à 4 enregistrements supplémentaires jusqu’à ce que la ligne de base se restabilise.
- À l’aide d’une pompe à seringue et d’une microsyringe, infuser 0,5 μL de solution (p. ex. solution saline à 0,9 %, N-méthyl-D-aspartate [NMDA], acide (2R)-amino-5-phosphonovalérique [AP5]) dans le VTA sur une période de 2 minutes.
- Après la perfusion, laissez la canule interne pendant au moins 1 min avant le retrait.
REMARQUE: Certains médicaments peuvent nécessiter de quitter la canule interne pendant une période plus longue en fonction de la cinétique du médicament, et le retrait de la canule interne peut faire remonter le médicament à travers la canule interne. En cas de préoccupation, on pourrait laisser la canule interne dans la canule de guidage pendant toute la durée de l’enregistrement. Sinon, l’enregistrement peut commencer après cet intervalle de 1 min. - Continuez à enregistrer toutes les 3 minutes pour mesurer les effets post-infusion.
REMARQUE: Si vous infusez une solution témoin et qu’aucun effet n’est observé, il est possible d’infuser une deuxième fois10. S’il y a une libération altérée de DA causée par l’insertion de la canule interne ou de la perfusion saline, le signal se rétablit généralement à la ligne de base dans les 30 minutes.
5. Vérification histologique du placement des électrodes
- À la fin de l’expérience, créez une petite lésion sur le site d’enregistrement à l’aide de la microélectrode en fibre de carbone.
- Si l’électrode doit être conservée pour l’étalonnage post-expérience, utilisez un fil de tungstène placé dans un capillaire en verre dépassant d’environ 100 μm au-delà de la pointe capillaire. Dans ce cas, soulevez l’électrode du cerveau, remplacez l’électrode d’enregistrement par l’électrode en tungstène et abaissez-la à la même coordonnée dorsoventrale.
REMARQUE: La fibre de carbone peut également être utilisée pour lésionr le cerveau et fournira une représentation plus précise de l’emplacement du site d’enregistrement; cependant, l’expérimentateur perdra la capacité de calibrer ces électrodes.
- Si l’électrode doit être conservée pour l’étalonnage post-expérience, utilisez un fil de tungstène placé dans un capillaire en verre dépassant d’environ 100 μm au-delà de la pointe capillaire. Dans ce cas, soulevez l’électrode du cerveau, remplacez l’électrode d’enregistrement par l’électrode en tungstène et abaissez-la à la même coordonnée dorsoventrale.
- Pour lésionr le site d’enregistrement, appliquez une tension à l’aide d’une alimentation. Commencez à 1 V et augmentez de 1 V toutes les 10 s jusqu’à ce que 10 V soient atteints.
- Euthanasier l’animal à l’aide d’une injection intrapéritonéale létale de pentobarbital (150 mg/kg).
- Perfuser le rat à l’aide d’une solution de formol à 4%.
- Retirez la tête du rat à l’aide d’une guillotine aiguisée.
- À l’aide de rongeurs, retirez le tissu conjonctif et le crâne entourant le cerveau et délogez doucement le cerveau de tout tissu restant.
- Stockez le cerveau dans 4% de formol pendant 1 jour, puis transférez-le à 30% de saccharose.
REMARQUE: La perfusion avec 4% de formol n’est pas nécessaire pour voir le site de la lésion, bien qu’en tant que meilleure pratique, elle améliorera la reconstruction du site de la lésion. - Créez des tranches de 30 μm du cerveau à l’aide d’un cryostat.
- Montez les tranches sur des diapositives et couvrez-les avec un bordereau de couverture.
- Indiquez l’emplacement de la lésion de microélectrode en fibre de carbone et l’emplacement de la canule bipolaire du stimulateur / perfusion à l’aide d’un microscope optique.
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Representative Results
CIS-FSCV a été utilisé pour étudier la fonction des récepteurs VTA N-méthyl-D-aspartate (NMDAR), des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (nAChR) et des récepteurs muscariniques de l’acétylcholine (mAChR) dans la conduite de la libération phasique de DA dans le noyau NAc. La figure 2 montre des données représentatives pour un témoin négatif, perfusion d’une solution saline à 0,9 %, avant (valeur initiale) et 9 min après l’infusion (solution saline). La figure 2 montre un diagramme de couleurs avec un potentiel sur l’axe des y, le temps sur l’axe des x et le courant (représenté par une fausse couleur) sur l’axe z, le courant par rapport aux traces temporelles (IvT), ainsi qu’une voltammographie cyclique prise au pic de réponse évoquée pour démontrer que l’analyte mesuré correspond à DA. Comme prévu, la perfusion de solution saline n’a pas modifié la libération phasique de DA stimulée.
Pour démontrer que le CIS-FSCV peut produire des effets bidirectionnels lors de l’utilisation d’agonistes et d’antagonistes, nous avons comparé les effets de la perfusion de l’agoniste NMDAR, NMDA (500 ng; Figure 3A) à l’antagoniste NMDAR, AP5 (1 μg; Figure 3B). La perfusion de NMDA a produit une forte augmentation de la libération phasique stimulée de DA(Figure 3A,9 min après la perfusion) tandis que l’antagoniste compétitif nmDAR, AP5 (1 μg), a produit une forte diminution(Figure 3B,9 min après perfusion). Pour démontrer l’utilité du CIS-FSCV à l’aide d’antagonistes qui ciblent différentes classes de récepteurs de l’acétylcholine, nous avons comparé les effets de la perfusion de la mécamylamine, antagoniste non sélective et non compétitive de la nAChR (3 μg; Figure 4A) et la scopolamine, antagoniste non sélective et compétitive du mAChR (67 μg; Figure 4B). Les deux médicaments ont produit des diminutions robustes de la libération phasique stimulée de DA(Figure 4, 9 min post-perfusion). Un résumé des résultats de la figure 2,de la figure 3et de la figure 4 est reproduit à la figure 5,où la période de référence est calculée en moyenne sur cinq stimulations et la période de traitement est affichée en pourcentage de la moyenne de référence.
Figure 1 : Chronologie de l’enregistrement avant et après la microinfusion VTA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Diagrammes représentatifs de couleur et de TIv de perfusion initiale (à gauche) et de perfusion saline (véhicule) (à droite) sur libération phasique stimulée de DA dans le noyau de NAc chez un seul rat Sprague Dawley mâle. La barre bleue représente la stimulation. L’enregistrement de base a lieu à t = 0, avant que la canule interne ne soit placée dans la canule guide du stimulateur bipolaire. L’enregistrement de la solution saline a été pris 9 min (t = 9) après la perfusion. Les encarts de voltammographie cyclique correspondent au pic des diagrammes IvT, montrant un pic d’oxydation à 0,6 V et une réduction de crête à -0,2 V, indiquant da. Aucun changement dans la libération évoquée stimulée ne doit être observé après la perfusion de VTA saline. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Effets de la perfusion de l’agoniste NMDAR (NMDA) et de l’antagoniste (AP5). (A) Diagrammes représentatifs de couleur et d’IvT de la ligne de base (à gauche) et de 500 ng de la perfusion d’agonistes NMDAR (à droite) lors de la libération phasique stimulée de DA dans le noyau de NAc chez un seul rat mâle Sprague Dawley. La perfusion de NMDA a augmenté la libération phasique stimulée de DA (enregistrement pris 9 min après la perfusion). (B) Diagrammes représentatifs de couleur et d’IvT de la ligne de base (à gauche) et de 1 μg de perfusion d’acide amino-5-phosphonovalérique (AP5) antagoniste du NMDAR (2R) (à droite) lors de la libération phasique stimulée de DA dans le noyau de NAc chez un seul rat Sprague Dawley mâle. La perfusion d’AP5 a réduit la libération phasique stimulée de DA (enregistrement pris 9 min après la perfusion). Les enregistrements de base ont eu lieu à t = 0, avant que la canule interne ne soit placée dans la canule guide du stimulateur bipolaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effets de la perfusion de mécamylamine et de scopolamine. (A) Diagrammes représentatifs de couleur et d’IvT de la ligne de base (à gauche) et de 3 μg de la perfusion non sélective de mécamylamine (MEC), antagoniste des récepteurs nicotiniques nicotiniques antagonistes (MEC) (à droite) lors de la libération phasique stimulée de DA dans le noyau de NAc chez un seul rat Sprague Dawley mâle. (B) Diagrammes représentatifs de couleur et de TIv de la ligne de base (à gauche) et 67 μg de la perfusion non sélective de scopolamine (SCOP), antagoniste muscarinique des récepteurs de l’acétylcholine (à droite) lors de la libération phasique stimulée de DA dans le noyau de NAc chez un seul rat Sprague Dawley mâle. L’enregistrement de base a eu lieu à t = 0, avant que la canule interne ne soit placée dans la canule guide du stimulateur bipolaire. Les enregistrements MEC et SCOP ont été pris 9 min après la fusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Résumé des données montrant les effets des médicaments au fil du temps. La période pré-perfusion (ligne de base) a été calculée en moyenne sur cinq stimulations, et la période post-infusion (à partir de t = 3) est présentée en pourcentage de la période initiale. À 9 minutes après la perfusion, nous avons observé que le signal DA évoqué était de 103 % de l’inclusion après perfusion saline, de 196 % après perfusion de NMDA, de 18 % après perfusion d’AP5, de 49 % après perfusion de MEC et de 43 % après perfusion de SCOP. n = 1 par condition. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
CIS-FSCV offre une occasion unique d’étudier les mécanismes des récepteurs VTA sous-jacents à la libération phasique de DA. Il y a deux étapes critiques afin d’assurer un enregistrement correct. Tout d’abord, un enregistrement de base stable doit être réalisé, avec peu de dérive dans le signal DA évoqué. Un moyen important d’augmenter la probabilité d’établir un enregistrement stable est de s’assurer que l’électrode a eu suffisamment de temps pour tourner à la fois à 60 Hz et 10 Hz (généralement 15 min à 60 Hz et 10 min à 10 Hz). Au fur et à mesure que la fibre de carbone est recyclée, la fibre de carbone elle-même s’oxyde et se grave, diminuant la surface mais produisant une nouvelle surface pour l’adsorption de la dopamine23. Cela peut entraîner une augmentation de la sensibilité à la DA. Ainsi, on pourrait voir une légère augmentation de la libération de dopamine stimulée au fil du temps dans l’expérience en raison de cette gravure accrue, plutôt que de toute manipulation pharmacologique. De plus, commencer un enregistrement dans les 90 à 120 minutes suivant l’anesthésie initiale augmentera la probabilité d’un enregistrement stable sur de longues périodes de temps. En tant que tel, comme le rat approche de la mort par anesthésie, il est typique que la libération évoquée de DA diminue lentement.
La deuxième étape critique de cette procédure consiste à s’assurer que la canule de perfusion est doucement insérée dans l’électrode stimulante bipolaire. Les aisselles stéréotaxiques peuvent bouger si trop de pression est exercée lors de l’insertion de la canule interne, et par conséquent, le signal de dopamine peut augmenter ou diminuer artificiellement, car le site de stimulation peut être différent. S’il y a un changement significatif dans le signal évoqué après l’insertion de la canule, une nouvelle période de référence doit être établie. De plus, s’il y a une altération de la libération de DA causée par l’insertion de la canule interne ou de la perfusion du véhicule, le signal revient généralement à la ligne de base dans les 30 minutes. S’il y a des modifications importantes dans la libération de DA à la perfusion du véhicule, le débit ou le volume de perfusion pourrait être réduit. Les chercheurs peuvent également effectuer un enregistrement supplémentaire après avoir inséré la canule interne avant la perfusion pour évaluer si l’insertion de la canule elle-même peut altérer la libération. Dans le même ordre d’idées, il est important de vérifier que la perfusion a eu lieu et qu’il n’y a pas de blocage de la canule interne. Une façon de le faire est de faire une petite bulle dans le tube de perfusion et de la marquer avec un stylo ou un marqueur. La bulle doit être plus éloignée du marqueur après la perfusion. Une autre façon de s’assurer que la perfusion s’est produite correctement est d’allumer la pompe à perfusion après que la canule interne a été retirée du cerveau, et s’il y a encore une solution en formation à l’extrémité, une perfusion réussie s’est probablement produite.
CIS-FSCV peut être adapté pour étudier les récepteurs VTA chez les animaux naïfs sur le plan comportemental et les animaux entraînés afin d’étudier les changements dans la fonction des récepteurs au fil du temps11. CIS-FSCV peut également être modifié pour mesurer le 5-HT et la noradrénaline (NE)24,25. CIS-FSCV est également très approprié pour les expériences de comportement éveillé et peut être intégré aux approches optogénétiques26,27. Il est important de noter que les événements de libération évoqués électriquement sont distincts des événements de libération transitoire souvent observés dans les études en mouvement libre, et moins souvent dans la préparation anesthésiée. Les événements de libération transitoires, par exemple, ne peuvent pas nécessairement être entraînés par la dépolarisation directe des neurones dopaminergiques contrairement aux événements de libération évoqués électriquement28. En tant que tel, l’activité neuronale phasique pourrait être dissociable des événements de libération de dopamine détectés via fscV. De plus, il a été démontré que la libération de DA évoquée optiquement diffère des événements de libération de DA évoqués électriquement. Une comparaison récente entre la stimulation évoquée optiquement et électriquement a révélé que la stimulation évoquée électriquement produit une régulation multisynaptique de la libération phasique de DA, alors que la stimulation évoquée optiquement peut limiter la stimulation à des circuits plus spécifiques29.
Certaines approches récentes ont utilisé des méthodes optogénétiques et fluorescentes pour étudier les circuits sous-jacents à la dynamique rapide de la dopamine in vivo30. Par exemple, des travaux récents de Sun et de ses collègues ont montré que la stimulation optogénétique des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra produit des élévations rapides de DA dans le striatum, mesurées par l’expression de capteurs DA basés sur l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (GRABDA)30. Des approches optogénétiques et de fluorescence combinées pourraient être utilisées pour stimuler ou inhiber des entrées afférentes spécifiques à la VTA tout en mesurant la libération de DA dans le NAc. CiS-FSCV ne peut pas stimuler les afférences aussi spécifiquement que la stimulation optogénétique, mais il a l’avantage de pouvoir répondre aux questions sur les récepteurs présynaptiques et postsynaptiques au sein de la VTA. Bien que les approches fluorescentes et FSCV aient une résolution temporelle (subseconde) et une sensibilité au DA (1-10 nM) suffisantes pour mesurer de manière comparable les changements dans la libération phasique de DA30,31, un avantage que le FSCV peut avoir par rapport à la surveillance fluorescente du DA phasique in vivo est qu’aucune manipulation génétique n’est nécessaire pour l’enregistrement. En effet, une expérience CIS-FSCV peut être réalisée en quelques heures, alors que les approches combinées optogénétiques et de fluorescence nécessitent suffisamment de temps (semaines) pour une expression suffisante à l’aide de constructions virales.
L’un des principaux avantages du CIS-FSCV est que la régulation spécifique des récepteurs VTA de la libération phasique de DA peut être étudiée dans le cerveau intact, en s’appuyant sur d’autres études in vivo qui mesurent les propriétés électrophysiologiques des neurones VTA ou des études in vitro qui évaluent la régulation présynaptique de la libération phasique de DA3,12. Une mise en garde de CIS-FSCV est que ces enregistrements doivent être effectués dans une zone relativement riche en DA. Ceci pour deux raisons: Premièrement, il existe certaines limites à la sensibilité fscV, qui ne peut détecter que les concentrations de DA dans la gamme nanomolaire et au-dessus de6,19. Deuxièmement, le FSCV a du mal à dissocier la noradrénaline de la DA, car leurs voltammographies cycliques sont presque identiques. Ainsi, ces études peuvent se limiter à évaluer les zones à DA élevé, telles que certaines parties du cortex préfrontal médian, le NAc, le striatum et le tubercule olfactif32. Des études futures pourraient être en mesure d’utiliser certaines des avancées approches FSCV qui permettent une meilleure discrimination entre DA et NE, ainsi que d’autres neurotransmetteurs électroactifs tels que l’adénosine33 et la sérotonine12.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les travaux ont été soutenus par Elizabethtown College (R.J.W, M.L. et L.M.), par une bourse d’études supérieures de la NSF (R.J.W.) et par la Yale School of Medicine (N.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
- Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
- Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
- Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
- Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
- Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
- Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
- Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
- John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
- Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
- Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
- Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
- Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14 (2002).
- Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
- Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
- Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M.
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
- Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
- Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
- Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
- Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).
