Summary
Målet med denne protokol er at direkte manipulere ventral tegmental område receptorer til at studere deres bidrag til subsekund dopamin frigivelse.
Abstract
Phasic dopamin (DA) frigivelse fra ventral tegmental område (VTA) til kernen accumbens spiller en afgørende rolle i belønning behandling og forstærkning læring. Forståelse af, hvordan de forskellige neuronale input i VTA kontrol phasic DA frigivelse kan give et bedre billede af kredsløb, der styrer belønning behandling og forstærkning læring. Her beskriver vi en metode, der kombinerer intra-VTA kanyle infusioner af farmakologiske agonister og antagonister med stimulation-fremkaldte phasic DA frigivelse (kombineret infusion og stimulation, eller CIS) målt ved in vivo hurtigscanning cyklisk voltammetry (FSCV). Ved hjælp af CIS-FSCV i bedøvede rotter kan et phasic DA-respons fremkaldes ved elektrisk at stimulere VTA med en bipolar elektrode udstyret med en kanyle, mens der registreres i kernen accumbens kerne. Farmakologiske agonister eller antagonister kan infunderes direkte på stimuleringsstedet for at undersøge specifikke VTA-receptorers roller i kørselsfasisk DA-udgivelse. En stor fordel ved CIS-FSCV er, at VTA receptor funktion kan studeres in vivo, der bygger på in vitro undersøgelser.
Introduction
Phasic dopamin (DA) frigivelse fra ventral tegmental område (VTA) til kernen accumbens (NAc) spiller en afgørende rolle i belønning-relaterede adfærd. VTA DA neuroner skifte fra en tonic-lignende fyring (3-8 Hz) til en burst-lignende fyring (>14 Hz)1, som producerer phasic DA frigivelse i NAc. VTA udtrykker en række somatodendritiske receptorer , der er godt positioneret til at styre skiftet fra tonic til burst-fyring2,3,4,5. Identificere, hvilke af disse receptorer, og deres respektive input, kontrol phasic DA frigivelse vil uddybe vores forståelse af, hvordan belønning-relaterede kredsløb er organiseret. Formålet med den metode, der er beskrevet her, kombineret infusion og stimulering med hurtigscanning cyklisk voltammetri (CIS-FSCV), er hurtigt og robust at vurdere funktionaliteten af VTA-receptorer i kørselsphasic DA-frigivelse.
Udtrykket kombineret infusion og stimulering (CIS) refererer til farmakologisk manipulerende receptorer på en gruppe neuroner (her VTA) og stimulere disse neuroner til at studere receptorens funktion. I bedøvelsesrotteren stimulerer vi elektrisk VTA'en til at fremkalde et stort fasisk DA-signal (1-2 μM) i NAc-kernen målt ved hurtigscanning af cyklisk voltammetri (FSCV). Infusioner af farmakologiske lægemidler (dvs. receptoragonister/antagonister) på stimuleringsstedet kan bruges til at måle funktionen af VTA-receptorer ved at observere den efterfølgende ændring i fremkaldte phasic DA-frigivelse. FSCV er en elektrokemisk tilgang, der har både høj rumlig (50-100 μm) og tidsmæssig (10 Hz) opløsning, og er velegnet til at måle belønningsrelaterede, phasic DA-hændelser6,7. Denne opløsning er finere end andre in vivo neurokemiske målinger, såsom mikrodialyse. Således er CIS-FSCV tilsammen velegnet til at vurdere VTA-receptorregulering af phasic dopaminfrigivelse.
En almindelig måde at undersøge VTA receptor funktion er ved hjælp af en kombination af elektrofysiologiske tilgange, der omhandler, hvordan disse receptorer ændre fyring sats af neuroner1,8. Disse undersøgelser er meget værdifulde i at forstå, hvilke receptorer der er involveret i at køre DA fyring ved aktivering. Men, disse undersøgelser kan kun foreslå, hvad der kan ske nedstrøms på axon terminal (dvs. frigivelse af en neurotransmitter). CIS-FSCV bygger på disse elektrofysiologiske undersøgelser ved at besvare, hvordan produktionen af VTA burst-fyring, phasic DA frigivelse, er reguleret af receptorer placeret på VTA dendritter og celle organer. Cis-FSCV er således velegnet til at bygge videre på disse elektrofysiologistudier. Som et eksempel kan nicotinisk receptoraktivering fremkalde burst-firing i VTA9, og CIS-FSCV i den bedøvede rotte blev brugt til at vise, at nicotinisk acetylcholin receptor (nAChR) aktivering i VTA også styrer phasic DA-frigivelsen i NAc10,11.
Mekanistisk undersøgelse af phasic DA regulering er også almindeligt undersøgt ved hjælp af skive præparater sammen med bad anvendelse af narkotika. Disse undersøgelser fokuserer ofte på den præsynaptiske regulering af phasic DA frigivelse fra dopamin terminaler, som cellelegemer er ofte fjernet fra skiven12. Disse præparater er værdifulde til at studere præsynaptiske receptoreffekter på dopaminterminaler, mens CIS-FSCV er bedre egnet til at studere somatodendritiske receptoreffekter på dopaminneuroner samt præsynaptiske input til VTA. Denne sondring er vigtig, fordi somatodendritisk receptor aktivering i VTA kan have en anden effekt end NAc præsynaptisk receptor aktivering. Faktisk, blokering dopaminergic presynaptic nAChRs i NAc kan forhøjephasic dopamin frigivelse under burst-fyring13, mens det modsatte er tilfældet på VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV er en ideel tilgang til at studere VTA-receptorers evne til at regulere phasic DA-frigivelse. Det er vigtigt, at denne tilgang kan udføres i en intakt rotte, enten bedøvet eller fri bevægelse. Denne tilgang er velegnet til akutte undersøgelser, at studere receptor funktion i sin baseline tilstand10,14 samt langsigtede undersøgelser, der kan vurdere funktionelle ændringer i en receptor efter eksponering af narkotika eller adfærdsmanipulation11,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i henhold til National Institutes of Health (NIH) Guide for Care and Use of Laboratory Animals og blev godkendt af både Elizabethtown College og Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Denne protokol er specifik for bedøvet rotte forberedelse af at udnytte CIS-FSCV.
1. Presurgiske præparater
- Forberedelse af elektrodeopløsning
- For at gøre elektrode backfill opløsning, forberede en opløsning af 4 M kaliumacetat med 140 mM kaliumchlorid16.
- Elektrodepræparat
- Ved hjælp af vakuumsugning skal du indsætte en T-650 kulfiber (7 μm i diameter) i en borolicatglaskapillær (længde = 100 mm, diameter = 1,0 mm, indvendig diameter = 0,5 mm).
- Når kulfiberen er blevet placeret inde i glaskapillæren, skal du placere glaskapillæren i en lodret elektrodetrækker med varmeelementet groft i midten af kapillæren. Indstil varmeapparatet til 55 med magneten slukket.
- Når kapillæren er trukket, skal du forsigtigt hæve den øverste kapillærholder, så spidsen af elektroden ikke er omgivet af varmeelementet.
- Ved hjælp af skarp saks skæres kulfiberen, der stadig forbinder kapillærens to stykker. Dette vil resultere i to separate kulfiber mikroelektroder.
- Skær forsigtigt den udsatte kulfiber med en skarp skalpel, så kulfiberen strækker sig ca. 75-100 μm ud over glassets ende.
- Brug et let mikroskop, sikre, at elektroden er fri for revner langs kapillær. Sørg også for, at forseglingen, hvor kulfiberen forlader kapillæren, er vanskelig at bemærke og fri for revner.
BEMÆRK: En god forsegling vil hjælpe med at reducere støj under optagelser. Se offentliggjorte undersøgelser17,18,19 for en mere detaljeret protokol.
- Referenceelektrode fabrikation
- Lodde en guldnål til en 5 cm sølvtråd.
- Fastgør anoden til en metalpapirclips eller en anden leder, katoden på en nål, og påfør en spænding (~ 2 V), mens papirclipsen og sølvtråden er nedsænket i 0,1 M HCl.
- Stop spændingen, når der vises en hvid belægning (AgCl) på sølvtråden.
- Forberedelse af elektrode til implantation
- Lodde en guldstift til en tynd isoleret ledning (~ 10 cm i længden, <0,50 mm diameter).
- Fjern ~ 5 cm isolering fra ledningen modsat guldstiften.
- Fyld elektroden ca. halvvejs med elektrodeopløsning.
- Sæt isoleret ledning ind i elektroden.
BEMÆRK: Ledningen skal komme i kontakt med kulfiberen inde i elektroden.
2. Elektrodeimplantater
- Giv voksne, hanner, Sprague Dawley-rotter (250−450 g) en intraperitoneal injektion (1,5 g/kg eller 1 mL/kg volumen) på 0,5 g/mL urethan opløst i steril saltvand. Start med en indledende urethandosis på 1,0−1,2 g/kg. Hvis dyret stadig reagerer på den skadelige stimulustest (haleknib) 20 min efter urethans administration, skal der gives yderligere 0,3−0,5 g/kg urethan for en samlet dosis på 1,5 g/kg.
BEMÆRK: Til fremstilling af 0,5 g/mL urethanopløsningen tilsættes 10 g urethan til 10 g saltholdige. Urethan er kræftfremkaldende og skal håndteres med forsigtighed. Urethan er et vigtigt bedøvelsesmiddel, da det ikke ændrer niveauet af dopamin, ligesom andre bedøvelsesmidler som ketamin / xylazine og chloralhydrat20,21. - Når dyret er dybt bedøvet og ikke er lydhør over for skadelige stimuli (f.eks. tåspids), skal du placere det i den stereotaxiske ramme. Påfør oftalmisk smøremiddel på hvert øje af rotten.
BEMÆRK: Dette er en ikke-overlevelsesoperation, men god aseptisk teknik opmuntres. - Rengør rottens hovedbund ved hjælp af en to-trins krat (dvs. en iodopovidone krat efterfulgt af en 70% ethanol krat; udføre med en 3 cyklus gentagelse).
- Skær hovedbundsvævet væk ved hjælp af steriliseret nålenæse pincet og kirurgisk saks. Fjern en betydelig mængde væv for at gøre plads til de forskellige implantationer, der er skitseret nedenfor.
- Rengør forsigtigt kraniets overflade ved hjælp af steriliserede bomuldsspidsapplikatorer. Derefter påføres 2−3 dråber på 3% hydrogenperoxid for at hjælpe med at identificere lambda og bregma.
- Ved hjælp af en stereotaxisk eller håndbor (1,0 mm, ~ 20.000 rpm), bore en 1,5 mm diameter hul 2,5 mm forreste til bregma og 3,5 mm lateral til bregma. Delvist (ca. halvvejs, indtil den er fast på plads) implanterer en skrue (1,59 mm O.D., 3,2 mm lang) i dette hul. Det anbefales at bruge steril saltvand til at vande under boring for at forhindre termisk skade.
- For referenceelektroden bores et hul med en diameter på 1,0 mm med en diameter på 1,5 mm forreste og 3,5 mm lateralt til bregmaen på venstre halvkugle.
- I hånden skal du indsætte ~ 2 mm referencetråd i dette hul, mens du pakker referencetråden rundt og under hovedet på den implanterede skrue.
- Skruen skal implanteres helt, så referenceelektroden er på plads.
- På højre halvkugle bores et hul med en diameter på 1,5 mm på 1,2 mm forreste og 1,4 mm lateralt til underdelen.
- Fjern forsigtigt duraen ved hjælp af pincet.
- Til den stimulerende elektrode bores et firkantet hul (2 mm forreste-posterior, 5 mm mediale-laterale) centreret ved 5,2 mm posterior og 1,0 mm lateral til bregma.
- Ved hjælp af de stereotaktiske armstænger sænkes den bipolare stimulerende elektrode/styrekanyle 5 mm under duraen. I tilfælde af blødning under implantation af elektroden skal du bruge sterile vatpinde og gaze for at minimere blødningen.
BEMÆRK: Den bipolare stimulerende elektrode, der anvendes i denne metode, er præfitted med en guidekanyle (Materialetabel). Den interne kanyle, der anvendes sammen med dette element, skal skylles med tangen på den bipolare stimulerende elektrode, når den er helt indsat i styrekanylen. Dette vil gøre det muligt for den interne kanyle at sidde direkte mellem de to ben af stimulatoren, som sidder ca. 1 mm fra hinanden. En lignende protokol er beskrevet andetsteds14. - Ved hjælp af de stereotaktiske armstænger sænkes kulfibermikroelektroden 4 mm under duraen. Denne placering er på den mest dorsale del af striatum.
- Tilslut referencetråden og kulfiberen til en potentiostat.
- Anvend en trekantet bølgeform (-0,4−1,3 V, 400 V/s) i 15 min ved 60 Hz og igen i 10 min ved 10 Hz.
BEMÆRK: Typisk, når du anvender bølgeformer til kulfiber mikroelektroder i hjernen, oxid grupper tilsættes til overfladen af kulfiber. Ligevægten i denne reaktion skal opnås forud for optagelsen. ellers vil der forekomme betydelig afdrift19. Cykling elektroden ved højere frekvenser (60 Hz) gør det muligt for kulfiber at opnå ligevægt hurtigere.
3. Optimering af kulfiber og stimulerende elektrode/guide kanyle steder
- Indstil stimulatoren til at producere en bipolar elektrisk bølgeform med en frekvens på 60 Hz, 24 pulser, 300 μA-strøm og pulsbredde på 2 ms / fase.
- Sænk forsigtigt stimulatoren i trin på 0,2 mm fra 5 mm til 7,8 mm under duraen. Ved hver forøgelse stimulere VTA.
BEMÆRK: Ved mere dorsale dybder (5−6 mm) vil stimulering af hjernen typisk (~ 80% af tiden) få rottens knurhår til at spjætte. Ved yderligere dybder vil whiskers ophøre med at trækninger, hvilket sker mellem 7,5−8,2 mm under duraen. Når knurhårene ophører med at trækninger, vil den stimulerende elektrode være i nærheden af eller ved VTA. Dette vil ikke forekomme i hver rotte, og mangel på whisker trækninger bør ikke tages som et tegn på, at den bipolare stimulerende elektrode / infusion kanyle er malplaceret. Knurhår trækninger kan ikke forekomme for alle bedøvelsesmidler (f.eks isoflurane). - Fortsæt med at sænke den bipolare stimulerende elektrode / guide kanyle, indtil en stimulering producerer phasic DA frigivelse på kulfiber mikroelektrode (i øjeblikket i dorsal striatum).
BEMÆRK: DA frigivelse i dorsal striatum vil ikke altid forekomme, hvis den bipolare elektrode er implanteret i VTA, men observation af DA frigivelse i dorsal striatum ved VTA stimulation er normalt et godt tegn på, at et godt signal vil blive observeret i NAc kerne. - Sænk kulfibermikroelektroden, indtil den er mindst 6,0 mm under duraen. Dette er den mest dorsale del af NAc-kernen.
- Stimulere VTA og registrere peak amplitud af DA peak.
- Sænk eller hæv kulfiber mikroelektroden på det sted, der producerer den største DA frigivelse.
- Sørg for, at toppen af DA-responsen er en klar oxidationstop ved 0,6 V og en reduktionstop ved -0,2 V. Disse toppe er tegn på DA.
4. Kombinationsinfusion og stimulering af FSCV-optagelse
BEMÆRK: Figur 1 viser tidslinjen for optagelse før og efter VTA-mikroinfusion.
- Når kulfiber og stimulerende elektrode / guide kanyle placering er blevet optimeret, stimulere til ~ 20−30 min.
BEMÆRK: Under de nuværende stimuleringsparametre må du ikke stimulere mere end én gang hvert 3. minut for at give mulighed for at genindlæse22køretøjer . - Efter at have opnået en stabil baseline (<20% variation over fem stimuleringer), sænk forsigtigt den indre kanyle i hånden ind i den guidede kanyle, der er præfitted i den bipolare stimulator.
- Tag yderligere 2−3 baseline optagelser for at sikre, at kanylen indsættelse selv ikke forårsage en ændring i det fremkaldte signal. I nogle tilfælde kan indsættelse og fjernelse af den interne kanyle forårsage skade på VTA. Hvis signalet ændres drastisk i løbet af denne oprindelige periode (>20%), skal du tage yderligere 3−4 optagelser, indtil den oprindelige restabilizes.
- Ved hjælp af en sprøjtepumpe og mikrosyringe indsprøjtes 0,5 μL opløsning (f.eks. 0,9 % saltvand, N-methyl-D-aspartat [NMDA], (2R)-amino-5-fosfonovalersyre [AP5]) i VTA'en over en periode på 2 min tid.
- Postinfusion, lad den interne kanyle i mindst 1 minut før fjernelse.
BEMÆRK: Nogle stoffer kan kræve at forlade den indre kanyle i længere tid baseret på stoffet kinetiker, og fjernelse af den interne kanyle kan forårsage stoffet til at rejse tilbage op gennem den indre kanyle. Hvis der er bekymring, kan man efterlade den interne kanyle i guide kanylen under hele optagelsen. Ellers kan optagelsen begynde efter dette interval på 1 min. - Fortsæt optagelsen hvert 3. minut for at måle postinfusionseffekter.
BEMÆRK: Hvis der tilføres en kontrolopløsning, og der ikke observeres nogen effekt, er det muligt at indgyde en anden gang10. Hvis der er ændret DA-frigivelse forårsaget af indsættelse af den interne kanyle eller saltvandsinfusion, genoprettes signalet typisk til baseline inden for 30 min.
5. Histologisk verifikation af elektrodeplacering
- I slutningen af eksperimentet skal du oprette en lille læsion på registreringsstedet ved hjælp af kulfibermikroelektroden.
- Hvis elektroden skal bevares til kalibrering efter erfaring, skal du bruge en wolframtråd placeret i en glaskapillær, der stikker ~ 100 μm ud over kapillærspidsen. I dette tilfælde hæve elektroden fra hjernen, erstatte optagelsen elektrode med wolfram elektroden, og sænke den til den samme dorsoventral koordinat.
BEMÆRK: Kulfiberen kan også bruges til læsion hjernen og vil give en mere præcis repræsentation af registreringsstedets placering; Forsøgspersonen vil dog miste evnen til at kalibrere disse elektroder.
- Hvis elektroden skal bevares til kalibrering efter erfaring, skal du bruge en wolframtråd placeret i en glaskapillær, der stikker ~ 100 μm ud over kapillærspidsen. I dette tilfælde hæve elektroden fra hjernen, erstatte optagelsen elektrode med wolfram elektroden, og sænke den til den samme dorsoventral koordinat.
- For at læsion optagelsesstedet, anvende spænding ved hjælp af en strømforsyning. Start ved 1 V og øge med 1 V hver 10 s indtil 10 V er nået.
- Aflive dyret ved hjælp af en dødelig intraperitoneal injektion af pentobarbital (150 mg/kg).
- Gennemgå rotten ved hjælp af en 4% formalinopløsning.
- Fjern hovedet fra rotten ved hjælp af en skærpet guillotinen.
- Brug rongeurs, fjerne bindevæv og kraniet omkring hjernen, og forsigtigt løsne hjernen fra eventuelle resterende væv.
- Opbevar hjernen i 4% formalin i 1 dag og overfør den derefter til 30% saccharose.
BEMÆRK: Perfusion med 4% formalin er ikke nødvendigt at se læsionsstedet, selv om det som en bedste praksis vil forbedre genopbygningen af læsionsstedet. - Opret 30 μm skiver af hjernen ved hjælp af en cryostat.
- Monter skiverne på dias og dæk med et dæksel slip.
- Angiver placeringen af kulfiber mikroelektrode læsion og bipolar stimulator / infusion kanyle placering ved hjælp af et let mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CIS-FSCV blev brugt til at studere funktionen af VTA N-methyl-D-aspartatreceptorer (NMDAR), nicotinske acetylcholinreceptorer (nAChRs) og muscariniske acetylcholinreceptorer (mAChRs) i kørsel af phasic DA-frigivelse i NAc-kernen. Figur 2 viser repræsentative data for en negativ kontrol, infusion af 0,9% saltvand, før (baseline) og 9 min postinfusion (saltvand). Figur 2 viser et farveplot med potentiale på y-aksen, tiden på x-aksen og strøm (repræsenteret som falsk farve) på z-aksen, strøm versus tidsspor (IVT) samt et cyklisk voltammogram taget på toppen fremkaldt respons for at vise, at den målte analysand svarer til DA. Som forventet ændrede saltvandsinfusionen ikke den stimulerede phasic DA-udgivelse.
For at vise, at CIS-FSCV kan producere tovejseffekter, når vi bruger agonister og antagonister, sammenlignede vi virkningerne af infusion af NMDAR-agonisten NMDA (500 ng; Figur 3A) til NMDAR-antagonisten AP5 (1 μg; Figur 3B. Infusion af NMDA medførte en robust stigning i stimuleret fasisk DA-udløsning (Figur 3A, 9 min efter infusion), mens NMDAR's konkurrencemæssige antagonist, AP5 (1 μg), gav et robust fald (Figur 3B, 9 min efter infusion). For at demonstrere nytten af CIS-FSCV ved hjælp af antagonister, der er rettet mod forskellige klasser af acetylcholinreceptorer, sammenlignede vi virkningerne af infusion af den ikke-selektive, ikke-konkurrencedygtige nAChR antagonistiske mecamylamin (3 μg; Figur 4A) og den ikke-selektive, konkurrencedygtige mAChR antagonist scopolamin (67 μg; Figur 4B. Begge lægemidler gav et robust fald i stimuleret phasic DA-frigivelse (Figur 4, 9 min postinfusion). En oversigt over resultaterne fra figur 2, figur 3og figur 4 genbefumres i figur 5, hvor basisperioden i gennemsnit er over fem stimuleringer, og lægemiddelperioden vises som en procentdel af basisgennemsnittet.
Figur 1: Tidslinje for optagelse før og efter VTA-mikroinfusion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentativ farve og IVT parceller af baseline (venstre) og saltvand (køretøj) infusion (højre) på stimuleret phasic DA frigivelse i NAc kerne i en enkelt mandlig Sprague Dawley rotte. Blå bjælke repræsenterer stimulering. Basisregistreringen forekommer ved t = 0, før den interne kanyle blev placeret i fører kanylen i den bipolare stimulator. Saltvandsoptagelsen blev taget 9 min (t = 9) postinfusion. Cyklisk voltammogram insets svarer til toppen af IvT parceller, viser en peak oxidation på 0,6 V og peak reduktion på -0,2 V, tegn på DA. Der bør ikke observeres nogen ændring i den stimulerede fremkaldte frigivelse efter saltvands-VTA-infusion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Virkninger af infusion af NMDAR-agonisten (NMDA) og antagonisten (AP5). (A) Repræsentativ farve og IVT plots af baseline (venstre) og 500 ng af NMDAR agonist infusion (højre) på stimuleret phasic DA frigivelse i NAc kerne i en enkelt mandlig sprague Dawley rotte. NMDA infusion øget stimuleret phasic DA frigivelse (optagelse taget 9 min postinfusion). (B) Repræsentative farve- og ivT-parceller af baseline (venstre) og 1 μg af NMDAR-antagonisten (2R)-amino-5-fosfonovalersyre (AP5) infusion (højre) ved stimuleret fasisk DA-frigivelse i NAc-kernen i en enkelt hanforstunde Dawley-rotte. AP5 infusion reduceret stimuleret phasic DA frigivelse (optagelse taget 9 min postinfusion). Basisoptagelserne fandt sted ved t = 0, før den interne kanyle blev placeret i fører kanylen i den bipolare stimulator. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Virkninger af infusion af mecamylamin og scopolamin. (A) Repræsentative farve- og ivt-parceller af baseline (venstre) og 3 μg af den ikke-selektive nicotinske acetylcholinreceptorantagonistmetagonistisk mecamylamin (MEC) infusion (højre) ved stimuleret phasic DA-frigivelse i NAc-kernen i en enkelt mandlig Sprague Dawley-rotte. (B) Repræsentative farve- og ivt-parceller af baseline (venstre) og 67 μg af den ikke-selektive muscariniske acetylcholinrereceptorantagonist scopolamin (SCOP) infusion (højre) ved stimuleret phasic DA-frigivelse i NAc-kernen i en enkelt mandlig Sprague Dawley-rotte. Baseline-registreringen fandt sted ved t = 0, før den interne kanyle blev placeret i fører kanylen i den bipolare stimulator. MEC- og SCOP-optagelserne blev taget 9 min postinfusion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Dataoversigt, der viser narkotikavirkninger over tid. Præinfusionsperioden (baseline) blev i gennemsnit over fem stimuleringer, og postinfusionsperioden (startende ved t = 3) præsenteres som en procentdel af baseline. Ved 9 min postinfusion observerede vi, at det fremkaldte DA-signal var 103% af baseline efter saltvandsinfusion, 196% efter NMDA infusion, 18% efter AP5 infusion, 49% efter MEC infusion og 43% efter SCOP infusion. n = 1 pr. betingelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CIS-FSCV giver en unik mulighed for at undersøge VTA receptor mekanismer underliggende phasic DA frigivelse. Der er to kritiske trin for at sikre en korrekt optagelse. For det første skal der opnås en stabil baseline-optagelse med lidt drift i det fremkaldte DA-signal. En vigtig måde at øge sandsynligheden for at etablere en stabil optagelse er at sikre, at elektroden har haft masser af tid til at cykle på både 60 Hz og 10 Hz (typisk 15 min ved 60 Hz og 10 min ved 10 Hz). Som kulfiber bliver cyklet, kulfiber selv oxiderer, og bliver ætset, faldende overfladearealet, men producerer ny overflade for dopamin adsorption23. Dette kan føre til en stigning i følsomheden over for DA. Således kan man se en lille stigning i stimuleret dopamin frigivelse over tid i eksperimentet på grund af denne øgede ætsning, snarere end nogen farmakologisk manipulation. Derudover vil påbegyndelse af en optagelse inden for 90 til 120 min af indledende anæstesi øge sandsynligheden for en stabil optagelse over lange perioder. Som sådan, som rotten nærmer sig døden fra anæstesi, det er typisk for fremkaldt DA frigivelse til at falde langsomt.
Det andet kritiske trin i denne procedure er at sikre, at infusionskanylen forsigtigt indsættes i den bipolare stimulerende elektrode. De stereotaxiske armstænger kan bevæge sig, hvis der lægges for meget tryk, mens du indsætter den interne kanyle, og som følge heraf kan dopaminsignalet kunstigt stige eller falde, da stimuleringsstedet kan være anderledes. Hvis der sker en betydelig ændring i fremkaldt signal efter indsættelsen af kanyle, bør der fastsættes en ny basisperiode. Hvis der desuden er ændret DA-frigivelse forårsaget af indsættelse af den interne kanyle eller køretøjsinfusion, genoprettes signalet typisk til baseline inden for 30 min. Hvis der sker omfattende ændringer i DA-frigivelsen til infusion af køretøjer, kan infusionshastigheden eller -volumen reduceres. Efterforskere kan også udføre en yderligere optagelse efter indsættelse af den interne kanyle før infusionen for at vurdere, om indsættelsen af kanylen selv kan ændre frigivelsen. Relateret er det vigtigt at kontrollere, at infusionen opstod, og at der ikke er nogen blokade af den interne kanyle. En måde at gøre dette på er at lave en lille boble i infusionsslangen og markere dette med en pen eller markør. Boblen skal være længere væk fra markøren efter infusionen. En anden måde at sikre, at infusionen opstod korrekt, er at tænde infusionspumpen, efter at den indre kanyle er blevet fjernet fra hjernen, og hvis der stadig dannes opløsning ved spidsen, er der sandsynligvis opstået en vellykket infusion.
CIS-FSCV kan tilpasses til at studere VTA receptorer i både adfærdsmæssigt naive og uddannede dyr til at studere ændringer i receptor funktion over tid11. CIS-FSCV kan også ændres til at måle 5-HT og noradrenalin (NE)24,25. CIS-FSCV er også meget velegnet til vågen, adfærd eksperimenter og kan integreres med optogenetiske tilgange26,27. Det er vigtigt at bemærke, at elektrisk fremkaldte frigivelseshændelser adskiller sig fra forbigående frigivelseshændelser, der ofte observeres i frie undersøgelser og sjældnere i det bedøvede præparat. Forbigående frigivelseshændelser, for eksempel, kan ikke nødvendigvis være drevet af direkte depolarisering af dopamin neuroner i modsætning til elektrisk fremkaldte frigivelseshændelser28. Som sådan, phasic neural aktivitet kan være adskilt fra dopamin frigivelse begivenheder opdaget via FSCV. Desuden har optisk fremkaldt DA frigivelse vist sig at afvige fra elektrisk fremkaldte DA release begivenheder. En nylig sammenligning mellem optisk og elektrisk fremkaldt stimulation har afsløret, at elektrisk fremkaldt stimulation producerer multisynaptisk regulering af phasic DA-frigivelse, mens optisk fremkaldt stimulering kan begrænse stimulering til mere specifikke kredsløb29.
Nogle nylige tilgange har anvendt optogenetiske og fluorescerende metoder til at undersøge kredsløbet, der ligger til grund for hurtig dopamindynamik i vivo30. For eksempel viste nylige arbejde af Sun og kolleger, at optogenetisk stimulering af dopamin neuroner i substantia nigra producerer hurtige stigninger af DA i striatum, målt via udtryk for G-protein koblet receptor-aktivering-baserede DA (GRABDA)sensorer30. Kombinerede optogenetiske og fluorescens tilgange kan anvendes til at stimulere eller hæmme specifikke afferent input til VTA, mens måling DA frigivelse i NAc. CIS-FSCV kan ikke stimulere de afferents så specifikt som optogenetisk stimulation, men det har en fordel i, at det kan løse spørgsmål om præsynaptiske og postsynaptiske receptorer inden for VTA. Mens både fluorescerende og FSCV tilgange har tilstrækkelig tidsmæssig opløsning (subsekund) og følsomhed over for DA (1-10 nM) til sammenligneligt måle ændringer i phasic DA frigivelse30,31, en fordel FSCV kan have over fluorescerende overvågning af phasic DA in vivo er, at ingen genetiske manipulationer er nødvendige for optagelse. Faktisk kan et CIS-FSCV-eksperiment afsluttes inden for få timer, mens kombinerede optogenetiske og fluorescenserende tilgange kræver tilstrækkelig tid (uger) til tilstrækkeligt udtryk ved hjælp af virale konstruktioner.
En vigtig fordel ved CIS-FSCV er, at specifik VTA receptor regulering af phasic DA frigivelse kan studeres i den intakte hjerne, der bygger på andre in vivo undersøgelser, der enten måler de elektrofysiologiske egenskaber af VTA neuroner eller in vitro undersøgelser, der evaluerer den præsynaptiske regulering af phasic DA frigivelse3,12. En advarsel af CIS-FSCV er, at disse optagelser skal gøres i et relativt DA-rige område. Dette er af to grunde: For det første er der nogle grænser for FSCV-følsomhed, som kun kan detektere DA-koncentrationer i nanomolarområdet og over6,19. For det andet har FSCV problemer med at adskille noradrenalin fra DA, fordi deres cykliske voltammogram er næsten identiske. Disse undersøgelser kan således være begrænset til at vurdere områder med høj DA, såsom nogle dele af den mediale præfrontale cortex, NAc, striatum og den olfaktoriske tuberkel32. Fremtidige undersøgelser kan være i stand til at anvende nogle af de fremskridt FSCV tilgange, der giver mulighed for bedre forskelsbehandling mellem DA og NE, samt andre elektroaktive neurotransmittere såsom adenosin33 og serotonin12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af Elizabethtown College (R.J.W, M.L., og L.M.), af en NSF Graduate Fellowship (RJW) og af Yale School of Medicine (NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
- Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
- Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
- Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
- Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
- Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
- Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
- Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
- John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
- Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
- Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
- Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
- Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14 (2002).
- Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
- Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
- Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine. Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
- Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
- Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
- Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
- Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).
