Summary
1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプの配列、オンサイトミキシングモジュラスから構成される複雑な寿命機械の高スループット研究のためのマイクロ流体システムを発表します。マイクロ流体チップは、生体内の非常に複雑で動的な微小環境条件の解析を可能にします。
Abstract
生体内の環境条件を模倣することは、複雑な生命機械に関するインビトロ研究にとって極めて重要である。しかし、生きた細胞や臓器を標的とする現在の技術は、ロボット工学のような非常に高価であるか、液体操作においてナノリットル体積とミリ秒の時間精度を欠いている。ここでは、1,500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプの配列、およびオンサイト混合弾性率から構成されるマイクロ流体システムの設計と製造を提示する。マイクロ流体デバイスの容量を実証するために、神経幹細胞(NSC)球体は提案されたシステムで維持される。我々は、NSC球体が1日目にCXCLに曝露され、2日目にEGFにさらされると、丸型の立体構造が良好に維持されることを観察した。6つの薬剤の入力順序の変動は、NSC球体およびNSCステムの発現レベル代表マーカー(すなわち、Hes5およびDcx)に形態学的変化を引き起こす。これらの結果は、動的で複雑な環境条件がNSC分化および自己再生に大きな影響を及ぼすことを示しており、提案されたマイクロ流体デバイスは、複雑な生命機械のハイスループット研究に適したプラットフォームである。
Introduction
高スループット技術は、生物医学および臨床研究にとって極めて重要です。何百万もの化学的、遺伝的、または生細胞およびオルガノイドの検査を並行して行うことで、研究者は生体分子経路を調節する遺伝子を迅速に同定し、特定のニーズに合わせて連続的な薬物入力をカスタマイズすることができます。ロボット1とマイクロ流体チップをデバイス制御プログラムと組み合わせて、細胞/組織操作、液体処理、イメージング、およびデータ処理/制御2,3をカバーする複雑な実験手順を自動化することができます。したがって、所望のスループット4,5に従って、1つのチップ上で数百、数千の実験条件を維持することができる。
このプロトコルでは、1500の培養ユニット、強化された蠕動ポンプおよびオンサイト混合弾性率から構成されるマイクロ流体装置の設計および製造手順について説明した。2レベルの細胞培養チャンバーは、培地交換時に不要なせん断を防ぎ、長期の生細胞イメージングのための乱れない培養環境を保証します。この研究は、提案されたマイクロ流体装置が複雑な生命機械のハイスループット研究に適したプラットフォームであることを示している。さらに、マイクロ流体チップの高度な機能により、常に変化するサイトカインおよびリガンド組成物6、7のような非常に複雑で動的な微小環境条件の自動再構成が可能となり、96ウェルプレートのような従来のプラットフォームでは数ヶ月かかる。
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Protocol
1. マイクロ流体チップ設計
- 18個の入口からなるマイクロ流体マルチプレクサを設計し、各々は個々のバルブと蠕動ポンプによって制御されます。ポンプサイクルごとに駆動される液体体積を増加させるために、蠕動ポンプを3つの制御チャネルで構成し、意図的に200μmに拡大し、10本の接続流線を有する。
- せん断のない文化室を設計します。2レベル培養ユニットの複製は、低い細胞培養チャンバー(400 μm x 400 μm x 150 μm)とより高いバッファ層(400 μm x 400 μm x 75 μm)によって構成され、培地交換時の細胞に対する不要なせん断応力を防ぎます(図1)。
- ハイスループット機能を設計します。培養単位を複製して30 x 50の行列レイアウトを形成し、約7cm×5cmの面積を占める。
2. チップの製造と操作
- UVリソグラフィによるレプリカ成形の製作
注:レプリカ成形は、標準的なフォトリソグラフィプロトコル8に従ってシリコンウエハで製造されました。- チャネル構造の製造
- 回転フォトレジスト:SU-8 3025のマイナスフォトレジストのスピンコート5mLをシリコンウエハー上で500rpmで10s、3000rpmで30s。
- ソフトベーク:ウエハーを65°Cのホットプレートに2分間置き、95°Cで10分間置き、室温まで冷やします。
- アライメントと硬化:アライザのホルダーにウエハーとマスクを固定し、18 sの光源をオンにして、露出したフォトレジストを硬化します。
- プレポスト露光ベーク:室温から110°C/hで95°Cにウエハーをランプアップし、取り外すまで少なくとも40分を保ちます。
- 開発:ウエハーを開発ソリューション(SU-8開発者)に浸し、2.5分間攪拌して冗長フォトレジストを洗い流し、高さ25μmのチャネル構造を得ます。
- ハードベーク:ウエハースをガラスペトリ皿で覆い、65°Cで2分間焼き、120°C/hで160°Cまでランプアップし、3時間保ちます。
- バッファー層を用いて細胞培養チャンバーを製造する
- ステップ2.1.1.1のパラメータを使用して、上記のウエハー上のSU-8 3075陰性フォトレジストの7mLをスピンコートします。
- 柔らかいベーク(ステップ2.1.1.2で説明)ウエハと、ウエハ上のマーカーとよく合うようにマスクを変更します。その後、24 sの光源をオンにして、露出したフォトレジストを硬化します。
- ウエハーを開発ソリューション(SU-8開発者)に浸し、4分40秒間攪拌して冗長フォトレジストを洗い流し、以前に作り上げた高さ25μmの高い層構造を75μmの高層構造にします。ハードベーク(ステップ2.1.1.6で説明)は、複雑な構造を強くするためにウエハを焼く。
- ステップ 2.1.2.1-2.1.2.3 を繰り返して、層構造に積み重ねる高さ75 μm のチャンバー構造を作製します。
- バルブ構造の作製
- ステップ2.1.1.1のパラメータを用いて、上記ウエハ上のAZ50x陽性フォトレジストの5mLをスピンコートした。
- 柔らかいベイク(ステップ2.1.1.2で説明)ウエハを、マスクをウエハのマーカーとうまく整列させ、それから20 sのために、そして30 sのためにすぐに消灯する。5つの円でライトオン/オフ手順を繰り返して、露出したフォトレジストを治します。
- ウエハーを一致させた開発者に浸し、約8分間攪拌して冗長なフォトレジストを洗い流し、制御チャネルと重なる丸い形のバルブを取得して良好な接続を確保します。ハードベーク(ステップ2.1.1.6で説明)全体のモデルを強くするためにパターン化されたウエハー。
- チャネル構造の製造
- ソフトリソグラフィによるマイクロ流体チップ製造
- パターン化されたブランクシリコンウエハースをリメチルクロロシランで15分間処理します。
- 50gの流れ層、20gの制御層2、および20gの膜に対応するPDMSゲル(10:1のモノマー/触媒比)の3部をそれぞれ調製する。
- パターン化されたシリコンウエハに50gのPDMSゲルをキャストし、真空チャンバーで-0.85 MPaで1〜2時間脱ガスしてフロー層をコピーします。
- PDMSの20gの2部を脱気し、2000-2800rpmでパターン化されたウエハとブランクシリコンウエハ上で30sで回転させ、制御層および膜層を作製する。
- PDMSで覆われたウエハースを80°Cで60分間換気オーブンに入れてインキュベーションします。
- カスタマイズされた光学デバイス(100xズーム)とプラズマエッチング機を介して、異なる層を一緒に整列させ、接着します。その後、80°Cで2時間換気オーブンに保管し、チップの接着を強化します。
- チップに入口穴を開け、PDMSコーティングされたカバースリップに接着し、使用前に80°Cで少なくとも12時間硬化します。
- チップ操作
- 小型空気圧ソレノイドバルブをチップの制御層に接続し、カスタマイズされたMATLABグラフィカルユーザインターフェース8 を開いてスイッチをリンクおよび制御します。
- プッシュアップPDMS膜バルブの閉圧を25 psiに設定します。
- 動的に変化するコンビナトリアル/シーケンシャル入力を、バルブのタイムリーなオンオフによって、指定されたチャンバー(図2d)に提供します。
3. 細胞マイクロ環境における動的入力の生成
- チップ処理と細胞ローディング
- 顕微鏡の標準的な培養条件(37°C、5%CO2)を5時間以上維持してください。
- チップにコーティング媒体(すなわち、NOTEに記載されている)を充填し、標準培養条件(ステップ3.1.1に記載)で少なくとも1時間インキュベートする。
- チップをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または細胞培養培地(Dulbeccoの修飾イーグル培地DMEM)で洗い流し、健康的な培養環境を構築します。
- 80%合流で細胞を収穫し、培養培地(DMEM)を用いて細胞を~106/mLの密度で再懸濁した。次に、細胞含有溶液を加圧して細胞をチップにロードする。
注:チップ上の異なる細胞株を培養するには、細胞培養チャンバーを処理するために対応するコーティング媒体が必要です。典型的には、培養チャンバを制御する全ての弁を開いた3T3線維芽細胞およびヘンの付着培養物の実験のために、細胞は同じカラム内のすべての培養チャンバーに流入する。
- 高スループットライブセルイメージングのセットアップ
注:画像取得には、自動翻訳ステージとデジタル相補金属酸化物半導体(CMOS)カメラを備えた反転顕微鏡を使用しました。ステージと画像の取得は、カスタマイズされたソフトウェアを介して制御されました。- 明視野の10x対物レンズを使用して培養チャンバーのマトリックスを可視化し、30 x 50室マトリックスの各チャンバの位置座標を肯定し、定義します。
- 対物レンズを20xまたは40倍に変換し、希望するチャンバの位置座標を選択し、確認後に翻訳段階が割り当てられた位置に移動します。最適なイメージを得るために、x、y、z の焦点面を微調整します。
- 最適な光強度、露光時間、および他の画像化されたパラメータは、各チャネル(すなわち、明視野および蛍光イメージング)ごとに個別に決定された。
- イメージングサイクルの間隔と持続時間を設定し、パスを保存してからイメージングを開始します。
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Representative Results
従来のオンチップペリスタチックポンプは、2000年にスティーブン・クエイクによって最初に記述され、そのパターン101、100、100、110、010、011、001、0018、10によって蠕動を作動させた。 0 と 1 の数値は、3 本の水平制御線の「開く」と「閉じる」を示します。3つ以上のバルブ(例えば、5つ)を用いた研究も11.3つの制御ラインと3つの流れラインによって構成される蠕動性ポンプはナノリットルの正確さを提供するが、輸送速度は1,500の培養室を供給するには遅すぎる。この問題を解決するために、ポンプサイクルごとに駆動される液体体積を増加させるフローライン(すなわち、10個の接続チャネル)を含む(すなわち、101、100、110、010、011、001)。したがって、栄養素および薬物は、指定されたチャンバーに効果的に送達することができる。蠕動ポンプ輸送液量は、ポンプサイクルあたり16倍〜50ナノリットル増加することができる。蠕動ポンプの配列は3つの接続された制御チャネルによって制御される(図1b)、各入口からの解決はチップに同時に渡され、瞬時に混合を可能にする。したがって、組み合わせ入力とシーケンシャル入力は、異なるソリューションに接続された入口のタイムリーなオンオフによって生成することができます。同じ方法論を用いて、動的変動サイトカインおよびリガンド濃度も生成することができる。たとえば、1、0.9、0.2、0.05、0.01 g/L、および4個のブランク培養培地の組み合わせにより、0.0005から0.01 g/Lの範囲のステップサイズを有する濃度の正波変動(0~0.5 g/L)を生成できます。
初等細胞の培養では、安定した微小環境を維持することが重要です。中程度の交換時に調整された培地のせん断応力と疲労は、細胞行動および細胞運命に影響を及ぼす。これらの問題を克服するために、中規模交換時の細胞上の望ましくないせん断応力を防ぐバッファ層を設計する(図1c)。従来の培養ユニットとは異なり、装置の主な利点(すなわち、弁制御)は、独立した条件のオンサイト混合、配達および維持の能力である。 図2dでは、個々の培養室で指定された位置への液体の正確な送達と影響を受けない状態の維持を介して、チップ上に複雑な中国語の単語を作成できることを実証しました。オンサイト混合における活性流体装置の能力は、ビデオクリップと共に図示され、培養チャンバー内での動的に変化するFITC濃度(図3c および ビデオ 7:47-7:50)を示し、2つのインレット12に接続された2個の独立した蠕動ポンプのポンプ速度を制御することによって達成される。数値シミュレーションは、培地が培養チャンバーを通して上に向けられると、せん断流が培養井戸の底部に素早く到達することを示唆している(ビデオ4:07-4:25)。溶液が左から右に向けられると、せん断力を効果的に防ぐことができます。10 mm/sの入力流量でも、細胞またはマイクロメートルサイズの組織は培養ユニットの底部に邪魔されないままです。
図3b(1)に示すように、各入口は、下側蠕動ポンプ以外のバルブによって制御される。1つの薬剤が指定されたチャンバーに送達されるように選択されると、薬物に接続された入口は開いていて、蠕動ポンプの配列の操作はこの薬物だけを運ぶ。2つまたは複数の薬物の場合、我々は単に同じ体積で薬物の混合物を生成するために接続された入口を開く。また、アレイから独立した1つの独立したペリスタティックポンプ(図2g)を統合し、アレイとは異なるポンプ速度で動作し、異なる希釈を生成することができます。インビボNSC動的環境条件を模倣するために、6リガンド(すなわち、ジャギード、DLL、EGF、PACAP、CXCL、PDGF)の順次および組み合わせ条件は、720および56の異なる条件で構成され、蠕動ポンプの配列を使用して生成され、指定されたチャンバーに送達された。 詳細には、シーケンシャル条件は、Sij={リガンドiが日j}に加え、Ci={リガンドiが存在する組み合わせ条件}として表され、リガンドi=ジャグ、DLL、EGF、PACAP、CXCL、PDGFおよびj=1、2、3、4、5、6。培養および刺激中に2時間ごとにNSC細胞および球体の応答を記録した。
NSC球は400 μm 400 μmの細胞培養チャンバに維持される(図2eおよび図4)。幹細胞の分化および幹細胞(すなわち自己再生)は、それぞれDcxおよびHes5の発現レベルによって表される。我々は、NSC球体が1日目にCXCLに曝露し、2日目にEGFにさらされると、丸型の立体構造が良好に維持され、球体サイズが明らかに増加することを観察した。高DCX発現レベルのNSCは、EGFがPACAPに置き換えられる3日目に死に、分化細胞13、14、15、16に対する効果を示唆する。4日目にDLLによる刺激で細胞が未処理のPDMS表面に付着し始め、5日目にPDGFを添加し、6日目にギザギザで個々の細胞に解体する。これらの6リガンドの入力順序の変化は、特徴的なNSCステータスをもたらす(図5)。たとえば、CXCLがシーケンスに沿ってPDGFと位置を切り替えるとき、NSCの進化は劇的に変化します(図5aおよび5b)。これらの結果は、動的な変化する環境条件がNSCの差別化と自己再生に大きな影響を及ぼし、生物医学研究や臨床応用のための脳オンチッププラットフォームの開発に道を開くことを示している。
図1: ハイスループットマイクロ流体チップの設計 強化された蠕動ポンプは、複数の流れチャネルと広がった制御チャネルで構成され、ポンプサイクルごとに転送される液体体積の増加につながります。 b. 蠕動ポンプの配列は3つの接続された制御ラインによって制御される。したがって、プログラムされた時点で異なる入口を含めることで、組み合わせ、順次および動的な可変入力信号を生成できます。 c. 不要なせん断の流れを防ぐために、我々は2レベルの培養ユニットを設計した。細胞は、深さ150μmの下のレベルで維持されます。 d. 各培養チャンバーは4チャンネルに接続されており、上下方向と左方向を通してソリューションを向けられるようにします。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ハイスループットマイクロ流体チップの製造 制御層と流れ層の微細構造を、まずシリコンウエハ上でパターン化し、その上にPDMSを複製するためにキャストした。 b. 制御、膜および流れ層は、プラズマエッチングと熱結合を使用して一緒に整列および結合される。 c-f. チップの高度な機能は、緑、青、黄色の食品染料を使用して実証されています。我々は、弁のタイムリーなオンオフによって、ナノリットル精度の溶液が指定されたチャンバーに届けられることを示す。 蠕動ポンプの配列は、3つの接続された制御ライン(すなわち、Control-1)によって制御され、他の3つの制御ラインによって制御される1つの独立した蠕動ポンプ(すなわち、Control-2)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アクティブな流体デバイスを示す模式図。 (a) セルがバイパス チャネルを流れるという図表。(b)バルブは、入口と蠕動ポンプを制御します。そして(c)細胞は培養チャンバーに流れ込む。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: 順次薬物入力によって刺激された場合のNSC球の代表的な画像明るいフィールド(上の行)、Hes5-GFP(2列目)、Dcx-Desred(3列目)画像は、順次刺激時に、Dcx-high細胞とHes5-high細胞の両方の間で実質的な細胞死が起こることを示しています。 暗い領域の出現は、主にコア領域で局所化する幹細胞の死を示唆している。スケールバー:100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:異なるシーケンシャル入力によって刺激される場合のNSC球の立体構造 、Dcx およびHes5発現レベルの変化。 6剤の入力順序の変動が、組織、形態、およびシグナル伝達分子の発現レベルの変化を引き起こし、動的環境条件に対するNSC球の感受性を示すことを実証した。入力シーケンス: (a) DLL>> PACAP>> EGF>> CXCL>> PDGF>> ジャグド, (b) DLL>> PACAP >> EGF > PDGF >> PDGF >> CXCL >> ジャグド, (c) DLL >> PACAP >> PDGF >> CXCL >> EGF >> ギザギッド, (d) PDGF >> CXCL > CXCL >スケールバー:100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
多重化および複雑な実験17、18、19、20を実行するために様々なマイクロ流体装置が開発されている。例えば、トポロジカルな凹部の配列からなるマイクロウェルは、外力を使用せずに個々の細胞をトラップすることができ、小さなサンプルサイズ、並列化、低材料コスト、より速い応答、高感度21、22、23、24を含む有利な文字を示す。液滴と表面張力を閉じ込められた液滴は、マイクロポンプなどの補助ハードウェアの必要性を排除し、液滴の輸送をより低コストで、環境に配慮した25、26にする。液体の滴は、マイクロピペットまたは噴霧器ノズルによって表面に容易に堆積することができ、そして実験後、システムは容易にリフレッシュされ、再利用可能な27、28である。スリップチップ技術は統合されたポンプまたは弁の関与なしで多重化された反応を可能にし、したがって、ユーザーおよび生産者に優しい29、30。しかし、これらのシステムは、ナノリットル溶液をマイクロウェルに保管すること、湿度を制御すること、および並列少量液体分配技術の限界など、多くの技術的なハードルに直面しています。
本論文では、生細胞イメージングシステムとカスタマイズされたマイクロ流体デバイスを用いた高スループット生物医学実験のプロトコルについて述べた。UVおよびソフトリソグラフィを含むチップ製造の手順、および自動蛍光イメージングの設定パラメータを詳細に示します。この結果は、提案されたマイクロ流体チップの高度な機能特徴(すなわち、2レベル培養チャンバーおよび強化された蠕動ポンプ)が、以前に報告された装置を上回り、数千の並列実験を行う必要性を満たすことを示している。また、原発および幹細胞の培養のための健康な環境を維持するために慎重に制御すべき重要なパラメータ(例えば、条件付き培地の維持)についても述べた。
複雑なプロトコルや化学物質のプログラムによる添加を含む細胞ベースの生物医学実験は、多くの場合、時間がかかり、面倒であると考えられています。例えば、細胞操作手順に加えて、毎時補充する6つの薬物の組み合わせ入力は、1時間あたり少なくとも250のピペッティングステップと実験の終わりまで繰り返しを必要とする。さらに、生体内の動的環境条件をモデル化するには、秒の精度で1つ以上のサイトカイン、リガンド、薬物をタイムリーに添加する必要があり、手動操作では不可能です。我々は、チップの入口を複数の薬物に接続することによって、または単一薬物の異なる濃度を接続することによって、結合、逐次および動的に変化する入力信号がせん断のない細胞環境で生成され、維持できることを実証する。並行して動く培養チャンバーで維持される細胞および組織の形態学的および化学的応答は、商業顕微鏡ソフトウェアを使用してリアルタイムで監視することができる。
バイオイメージング中のマイクロ流体デバイスのスループットと自動データ収集により、ライブセルイメージングシステムは1時間に数千個の画像を生成できます。たとえば、1500 ユニットチップを 1 週間連続で実行すると、252,000 枚の画像が生成されます。組織や細胞集団の進化(例えば、蛍光タグ付き生体分子の発現量)を単一細胞レベルで手動で追跡するには、数ヶ月かかる場合があります。カスタマイズされたMATLABプログラムを使用して、大量のデータを自動的にソート、フォーマット、および分析することができます。移動性、形態学的特徴、およびシグナル伝達分子の発現レベルを示す痕跡を取り出すことができる(ビデオに示す)、人為的ミスを避け、かなりの時間を節約する。
そこで、ここで実証する方法論は、細胞および組織の自動操作、蛍光イメージング、データ解析を用いて、高スループットの生物医学実験を行うための適切なプロトコルを示しています。膜弁のオンオフスイッチングは、オルガンオンチップのように、変化し続ける複雑な環境条件を再構築するために最適な液体量、時間、空間分解能を提供します。プロトコルは、移行的な生物医学的アプローチ(例えば、96ウェルプレートを使用した手動手順)に比べてかなり複雑であるにもかかわらず、提示されたプロトコルおよびプラットフォームは、細胞および組織機能に関する研究に限定されない。組み合わせおよび逐次的な薬物入力のスクリーニングは、臨床応用のための治療法を開発することを可能にするかもしれない。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者は、チャンセン楽器(中国)株式会社の志豊成からの技術サポートを認める。この研究は助成金(中国国立自然科学財団,51927804)によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
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