Summary
Vi præsenterer et mikrofluidisk system til undersøgelser af komplekse livsmaskiner, som består af 1500 kulturenheder, en række forbedrede peristaltiske pumper og en blandingsmodulus på stedet. Den mikrofluidiske chip giver mulighed for analyse af de meget komplekse og dynamiske mikromiljøforhold in vivo.
Abstract
Efterligning in vivo miljøforhold er afgørende for in vitro undersøgelser af komplekse liv maskiner. Men de nuværende teknikker rettet mod levende celler og organer er enten meget dyre, som robotteknologi, eller mangler nanoliter volumen og millisekund tid nøjagtighed i flydende manipulation. Vi præsenterer herved design og fremstilling af et mikrofluidisk system, der består af 1.500 kulturenheder, en række forbedrede peristaltiske pumper og en blandingsmodulus på stedet. For at demonstrere kapaciteten af den mikrofluidiske enhed opretholdes neurale stamcellesfærer (NSC) i det foreslåede system. Vi bemærkede, at når NSC-kuglen udsættes for CXCL i dag 1 og EGF i dag 2, er den runde kropsbygning godt vedligeholdt. Variation i inputrækkefølgen af 6 lægemidler forårsager morfologiske ændringer i NSC-sfæren og udtryksniveauets repræsentative markør for NSC-stængel (dvs. Hes5 og Dcx). Disse resultater tyder på, at dynamiske og komplekse miljøforhold har stor indvirkning på NSC differentiering og selvfornyelse, og den foreslåede mikrofluidiske enhed er en passende platform for høj gennemstrømning undersøgelser af den komplekse levetid maskiner.
Introduction
Høj gennemløbsteknikker er afgørende for biomedicinske og kliniske undersøgelser. Ved parallelt at gennemføre millioner af kemiske, genetiske eller levende celle- og organoidtests kan forskere hurtigt identificere gener, der modulerer en biomolekylær vej, og tilpasse sekventiel lægemiddelinput til ens specifikke behov. Robotteknologi1 og mikrofluidiske chips i kombination med et enhedskontrolprogram gør det muligt at automatisere komplekse eksperimentelle procedurer, der dækker celle-/vævsmanipulation, væskehåndtering, billeddannelse og databehandling/kontrol2,3. Derfor kan hundreder og tusinder af eksperimentelle forhold opretholdes på en enkelt chip i henhold til den ønskedeoverførselshastighed 4,5.
I denne protokol beskrev vi design- og fabrikationsproceduren for en mikrofluidisk enhed, der består af 1500 kulturenheder, en række forbedrede peristaltiske pumper og blandingsmodulus på stedet. 2-niveaus cellekulturkammeret forhindrer unødvendig forskydning under medium udveksling, hvilket sikrer et uforstyrret kulturmiljø til langsigtet levende cellebilleddannelse. Undersøgelserne viser, at den foreslåede mikrofluidiske enhed er en egnet platform til undersøgelser af høj gennemstrømning af de komplekse livsmaskiner. Desuden giver de avancerede træk ved den mikrofluidiske chip mulighed for automatiseret rekonstituering af meget komplekse og dynamiske mikromiljøforhold in vivo, som de stadigt skiftende cytokiner og ligands sammensætninger6,7, hvis færdiggørelse tager måneder for konventionelle platforme som 96-brønds plade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design af mikrofluidiske chips
- Design den mikrofluidiske multiplexer bestående af 18 indløb, som hver især styres af en individuel ventil og en peristaltisk pumpe. For at øge væskevolumen drevet af per pumpecyklus, har peristaltic pumpen bestå af 3 kontrolkanaler, som med vilje blev udvidet til 200 μm, og 10 tilsluttede flow linjer.
- Design det forskydningsfri kulturkammer. Replikationen af 2-niveaus kulturenheden består af et lavere cellekulturkammer (400 μm x 400 μm x 150 μm) og et højere bufferlag (400 μm x 400 μm x 75 μm), som forhindrer uønsket forskydningsstress på celler under medium udveksling (figur 1).
- Design funktioner med høj overførselshastighed. Dupliker kulturenheden for at danne et 30 x 50 matrixlayout, der optager et areal på ca. 7 cm x 5 cm i størrelse.
2. Chip fabrikation og drift
- Fremstilling af replika støbning ved hjælp af UV litografi
BEMÆRK: Replika støbning blev fremstillet på silicium wafer i henhold til standard fotolitografi protokol8.- Fremstilling af kanalstrukturerne
- Spinning fotoresist: Spin coat 5 mL af SU-8 3025 negative fotoresist på en silicium wafer ved 500 omdrejninger i minuttet for 10 s og 3000 rpm for 30 s.
- Blød bage: Sæt wafer på en kogeplade ved 65 °C i 2 min og derefter 95 °C i 10 min, Afkøles det ned til stuetemperatur.
- Justering og hærdning: Fastgør waferen og masken på holderen af aligneren, og tænd lyskilden i 18 s for at helbrede den eksponerede fotoresist.
- Før eksponering bages: Rampe op wafer til 95 ° C ved 110 ° C / t fra stuetemperatur og holde det mindst 40 min indtil fjernelse.
- Udvikl: Dyp waferen i udviklingsløsningen (SU-8 udvikler) og omrør den i 2,5 minutter for at vaske overflødig fotoresist af og få den 25 μm høje kanalstruktur.
- Hård bage: Dæk vaflen med glas petriskål og bages ved 65 °C i 2 min, rampe op til 160 ° C ved 120 ° C / t og holde det i 3 timer.
- Fremstilling af cellekulturkammeret med bufferlaget
- Brug parametrene i trin 2.1.1.1 til at dreje pels 7 mL af SU-8 3075 negative fotoresist på ovenstående wafer.
- Blød bage (beskrevet i trin 2.1.1.2) wafer og ændre masken til at tilpasse godt med markører på wafer. Tænd derefter lyskilden i 24 s for at helbrede den eksponerede fotoresist.
- Dyp waferen til udviklingsopløsningen (SU-8 udvikler) og omrør den i 4 minutter og 40 sekunder for at vaske overflødig fotoresist af og få en 75 μm høj lagstruktur, der omkring den 25 μm høje kanalstruktur, der er fremstillet før. Hård bage (beskrevet i trin 2.1.1.6) wafer at gøre den komplekse struktur stærkere.
- Gentag trin 2.1.2.1-2.1.2.3 for at fremstille en 75 μm høj kammerstruktur, der stables på lagstrukturen.
- Fremstilling af ventilstrukturerne
- Brug parameteren for trin 2.1.1.1 til at spinde pels 5 mL af AZ 50x positiv fotoresist på ovenstående wafer.
- Blød bage (beskrevet i trin 2.1.1.2) wafer og gøre masken justeret godt med markører på wafer, derefter holde lyskilden på i 20 s og slukkes straks i 30 s. Gentag lys on / off procedure i 5 cirkler for at helbrede den eksponerede fotoresist.
- Dyp wafer til matchede udvikler og omrøre det i ca 8 min til at vaske overflødige fotoresist og få den runde formede ventiler, der overlapper med kontrol kanaler for at sikre god forbindelse. Hård bage (beskrevet i trin 2.1.1.6) den mønstrede wafer at gøre hele modellen stærkere.
- Fremstilling af kanalstrukturerne
- Mikrofluidisk chipproduktion ved hjælp af blød litografi
- Behandl de mønstrede og blanke siliciumskiver med rimethylchlorosilane i 15 minutter.
- Der fremstilles 3 portioner PDMS-gel (10:1 monomer/katalysatorforhold), svarende til henholdsvis 50 g flowlag, 20 g kontrollag 2 og 20 g membran.
- Støbt 50 g PDMS gel på den mønstrede silicium wafer, og de-gas dem i 1-2 timer i vakuumkammeret på -0,85 MPa at kopiere flow lag.
- Afgas de 2 portioner af 20 g PDMS og spin det på mønstret wafer og en blank silicium wafer på 2000-2800 omdrejninger i minuttet for 30 s som at forberede en kontrol lag og membran lag.
- De PDMS-dækkede vafler hældes i ventilationsovnen i 60 minutter ved 80 °C til inkubation.
- Juster og binde de forskellige lag sammen gennem tilpassede optiske enhed (zoom i 100x) og plasma ætsning maskine. Derefter opbevares den i en ventilationsovn i 2 timer ved 80 °C for at øge limningen af chippen.
- Punch indløbshullerne på chippen, og lim den derefter på en PDMS-belagt coverlip og hærdet i mindst 12 timer ved 80 °C før brug.
- Chip-handling
- Tilslut miniature pneumatiske magnetventiler til chippens styrelag, og åbn den tilpassede MATLAB grafiske brugergrænseflade8 for at forbinde og styre kontakten.
- Sæt lukketrykket af push-up PDMS-membranventiler til 25 psi.
- Levere dynamisk skiftende kombinatoriske/sekventielle indgange til udpegede kamre (Figur 2d) ved rettidig on-off af ventilerne.
3. Generering af dynamiske input i cellulære mikromiljøer
- Chip behandling og celle lastning
- Standardkulturbetingelserne (37 °C, 5% CO2) på mikroskopet i mindst 5 timer.
- Fyld chippen med belægningsmedium (dvs. nævnt i NOTE) og inkuber den under standardkulturbetingelserne (beskrevet i trin 3.1.1) i mindst en time.
- Skyl chippen med fosfat-buffered saltvand (PBS) eller cellekultur medium (Dulbecco's Modified Eagle's medium, DMEM) for at opbygge et sundt kulturmiljø.
- Høst celler ved 80% sammenløb, og genbruge cellerne ved hjælp af kultur medier (DMEM) ved en tæthed på ~ 106/ mL. Læg derefter cellerne i chippen ved at trykke på den celleholdige opløsning.
BEMÆRK: Dyrkning af forskellige cellelinjer på spån kræver tilsvarende belægningsmedium til behandling af cellekulturkammeret. Typisk, for eksperimenter på 3T3 fibroblast og vedhængende kultur høne alle ventiler kontrollerende kulturkamre er åbne, celler flow i alle kulturkamre inden for samme kolonne.
- Installation til livecellebilledbehandling med høj overførselshastighed
BEMÆRK: Til billederhvervelse blev der anvendt et omvendt mikroskop med et automatiseret translationelt stadium og et digitalt komplementært CMOS-kamera (Complementary Metal-Oxide Semiconductor). Scenen og billederhvervelse blev kontrolleret via den tilpassede software.- Visualiser matrixen af kulturkamre ved hjælp af 10x objektiv linse i lyst felt for at bekræfte og definere placeringskoordinaterne for hvert kammer i 30 x 50 kammermatrixen.
- Transformer den objektive linse til 20x eller 40x, vælg derefter placeringskoordinaterne for det ønskede kammer, og oversættelsesfasen flyttes til den tildelte position efter bekræftelse. Finjuster x, y, z brændplanet for at få et optimalt billede.
- Optimal lysintensitet, eksponere tid, og andre afbildede parametre blev bestemt individuelt for hver kanal (dvs. lysfelt og fluorescens imaging).
- Angiv intervallet og varigheden af billedcyklussen, gem stien, og start derefter afbildningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den konventionelle on-chip peristaltic pumpe blev først beskrevet af Stephen Quake i 2000, hvorved peristalsis blev aktiveret af mønsteret 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. Tallet 0 og 1 angiver "åben" og "tæt" på de 3 vandrette styrelinjer. Undersøgelser med mere end 3 ventiler (f.eks. fem) er også blevet rapporteret11. Selvom den peristaltiske pumpe, der består af 3 kontrollinjer og 3 flowlinjer, giver nanoliternøjagtighed, er transporthastigheden for langsom til at fodre 1.500 kulturkamre. For at løse problemet inkluderer vi flere flowlinjer (dvs. de 10 tilsluttede kanaler) for at øge væskevolumen drevet af pr. pumpecyklus (dvs. 101, 100, 110, 010, 011, 001). Således kan næringsstoffer og stoffer effektivt leveres til udpegede kamre. Den peristaltiske pumpe transporteres flydende volumen kan stige med 16x til ~ 50 nanoliters per pumpecyklus. Da udvalget af peristaltiske pumper styres af 3 tilsluttede styrekanaler (Figur 1b), leveres opløsningerne fra hvert indløb samtidigt til chippen og tillader øjeblikkelig blanding. Kombinatoriske og sekventielle input kan derfor genereres ved rettidig start af de indløb, der er forbundet med forskellige løsninger. Ved hjælp af den samme metode kan der også genereres dynamiske varierende cytokin- og ligandkoncentrationer. Udvalgte kombinationer af 1, 0,9, 0,2, 0,05, 0,01 g/L og 4 blanke kulturmedier kan f.eks.
For primærcellernes kultur er det afgørende at opretholde et stabilt mikromiljø. Shear stress og udmattelse af konditioneret medium under medium udveksling vil påvirke cellulær adfærd og celle skæbne12. For at løse disse problemer designer vi et bufferlag for at forhindre uønsket forskydningsbelastning på celler under medium udveksling (Figur 1c). I modsætning til de konventionelle kulturenheder er de vigtigste fordele ved enheden (dvs. ventilstyret) deres muligheder for at blande, levere og vedligeholde uafhængige forhold på stedet. I figur 2d demonstreredevi, at der kan oprettes et komplekst kinesisk ord på chippen via præcis levering af væsker til udpegede positioner og vedligeholdelse af en upåvirket tilstand i individuelle kulturkamre. Den aktive fluidiske enheds egenskaber i blanding på stedet illustreres med et videoklip, der viser de dynamisk skiftende FITC-koncentrationer i et kulturkammer(Figur 3c og Video 7:47-7:50), som opnås ved at kontrollere pumpehastigheden på 2 uafhængige peristaltiske pumper, der er forbundet til 2 indløb12. Numerisk simulering tyder på, at når mediet ledes top-down gennem kulturkamrene, når forskydningsstrømmen hurtigt bunden af kulturbrønden (Video 4:07-4:25). Forskydningskræfterne kan effektivt forhindres, når opløsningen ledes fra venstre mod højre. Selv ved en inputstrømshastighed på 10 mm/s forbliver celle- eller mikrometerstørrelse væv uforstyrret i bunden af dyrkningsenheden.
Som det fremgår af figur 3b(1), styres hvert indløb af en anden ventil end den nedre peristaltiske pumpe. Når et lægemiddel er udvalgt til at blive leveret i udpegede kamre, indløbet er forbundet med stoffet er åben, og driften af den vifte af den peristaltiske pumpe transporterer kun dette stof. For 2 eller flere lægemidler åbner vi simpelthen de tilsluttede indløb for at generere en blanding af stoffer i samme volumen. Vi integrerer også en uafhængig peristatisk pumpe uafhængigt af array (Figur 2g), som kunne fungere med en anden pumpehastighed fra arrayet og derfor generere forskellige fortyndinger. At efterligne in vivo NSC dynamiske miljøforhold, sekventiel og kombinatorisk tilstand af 6 ligands (dvs. Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF), som består af 720 og 56 forskellige betingelser, blev genereret ved hjælp af den vifte af peristaltiske pumper og leveret til de udpegede kamre. I detaljer kan sekventielle betingelser repræsenteres som Sij = {ligand i tilføjes på dag j} og en kombinatorisk betingelse som Ci = {ligand i is present}, hvor ligand i = Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF og j=1,2,3,4,5,6. NSC-cellernes og -sfærernes reaktioner blev registreret hver anden time under kultur og stimulering.
NSC-kuglerne holdes i cellekulturkammeret på 400 μm med 400 μm (figur 2e og figur 4). Stamcellernes differentiering og stædstyrke (dvs. selvfornyelse) repræsenteres af udtrykket dcx og hes5. Vi bemærkede, at når NSC-kuglen udsættes for CXCL i dag 1 og EGF i dag 2, er den runde formede kropsbygning godt vedligeholdt, og der er en åbenlys stigning i kuglestørrelsen. NSC'er med højtDcx-udtryksniveau dør på den3.-dag, hvor EGF erstattes af PACAP , hvilket tyder på effekter på de differentierede celler13,14,15,16. Celler begynder at knytte til ubehandlet PDMS overflade ved stimulation af DLL på den4. dag og dissociere i individuelle celler med tilføjelsen af PDGF på den5. dag og Jagged den6. dag. Ændringer i inputrækkefølgen for disse 6 ligands giver en karakteristisk NSC-status (Figur 5). F.eks. varierer udviklingen af NSC'er dramatisk, når CXCL skifter position med PDGF langs sekvensen (Figur 5a og 5b). Disse resultater viser, at de dynamiske forskellige miljøforhold har stor effekt på NSC'ers differentiering og selvfornyelse, hvilket baner vejen for udvikling af hjerne-på-chip-platforme til biomedicinske undersøgelser såvel som kliniske anvendelser.
Figur 1: Design af mikrofluidic chip med høj gennemløb a. Den forbedrede peristaltiske pumpe består af flere flowkanaler og udvidede kontrolkanaler, hvilket fører til stigning i det overførte væskevolumen pr. pumpecyklus. b. Arrayet af peristaltiske pumper styres af 3 forbundne styrelinjer. Derfor kan inddragelsen af forskellige indløb på programmerede tidspunkter generere kombinatoriske, sekventielle og dynamiske varierende inputsignaler. c. For at forhindre uønsket forskydningsflow designede vi en 2-niveaus kulturenhed. Cellerne holdes i bunden af det nederste niveau, hvilket er 150 μm i dybden. d. Hvert kulturkammer er forbundet med 4 kanaler, så løsningen kan dirigeres gennem top-down og venstre-højre retninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:Fremstilling af mikrofluidic chip med høj gennemløb a. Mikrostrukturer af kontrol og flow lag blev først mønstret på silicium wafer, hvor PDMS er støbt til replikation. b. Kontrol-, membran- og flowlagene er justeret og bundet sammen ved hjælp af plasma ætsning og termisk binding. c-f. De avancerede træk ved chippen demonstreres ved hjælp af grønne, blå og gule madfarvestoffer. Vi viser, at ved rettidig on-off af ventilerne, løsninger af nanoliter nøjagtighed kan leveres til de udpegede kamre. g.Viften af peristaltiske pumper styres af 3 forbundne styrelinjer (dvs. kontrol-1) og en uafhængig peristaltisk pumpe, der styres af andre 3 styrelinjer (dvs. kontrol-2). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: En skematisk, der viser den aktive flydende enhed. En skematisk, der viser, at (a) celler flyder gennem bypasskanalen. b) ventilerne styrer indløbet og peristaltisk pump og (c) celler strømmer ind i kulturkamrene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:Repræsentative billeder af NSC-sfæren, når de stimuleres af sekventiel narkotikainput. Bright field (øverste række), Hes5-GFP (anden række), Dcx-Desred (tredje række) billeder viser, at ved sekventiel stimulation, betydelig celledød forekommer blandt både Dcx-højog Hes5-høje celler. Fremkomsten af det mørke område tyder på død stamceller, som lokaliserer det meste i kerneregionen. Skalalinje: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Variationer i NSC-kugleformation, Dcx- og Hes5-udtryksniveau, når de stimuleres af forskellige sekventielle input. Det påvises, at variation i inputrækkefølgen af 6 lægemidler forårsager ændringer i væv, morfologiske og udtryksniveau for signalmolekyler, hvilket indikerer NSC-sfærens følsomhed over for de dynamiske miljøforhold. Inputsekvenserne: (a) DLL>> PACAP>> EGF>> CXCL>> PDGF>> Takkede, (b) DLL>> PACAP >> EGF >> PDGF >> CXCL >> Takkede, (c) DLL -fil >> PACAP >> PDGF >> CXCL >> EGF >> Takkede,d) PDGF >> CXCL >> PACAP >> EGF >> DLL >> Jagged. Skalalinje: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskellige mikrofluidiske enheder er udviklet til at udføre multiplekserede og komplekse eksperimenter17,18,19,20. For eksempel kan mikrowells lavet af en række topologiske fordybninger fange individuelle celler uden brug af ekstern kraft, der viser fordelagtige tegn, herunder lille prøvestørrelse, parallelisering, lavere materialeomkostninger, hurtigere respons, høj følsomhed21,22,23,24. Dråbe og overfladespænding begrænset dråbe fjerne behovet for ekstra hardware såsom en micropump, hvilket gør transport af dråber mere billige og øko-venligere25,26. Dråber af væsker kan let deponeres på overfladen af mikropipetter eller sprøjtedyser, og efter forsøgene kan systemerne let opdateres og genbruges27,28. Slipchip-teknikken tillader multiplekserede reaktioner uden inddragelse af integrerede pumper eller ventiler og derfor brugervenlig29,30. Disse systemer står imidlertid over for en række tekniske forhindringer, såsom opbevaring af nanoliterløsninger i mikrobrønde, styring af fugtighed og begrænsninger af parallelle væskedispenseringsteknologier med lavt volumen.
I dette papir beskrev vi en protokol for biomedicinske eksperimenter med høj overførselshastighed ved hjælp af levende cellebilleddannelsessystem og en tilpasset mikrofluidisk enhed. Procedurerne for chip fabrikation, herunder UV og blød litografi, og setup parametre for automatisk fluorescerende billeddannelse er påvist i detaljer. Resultaterne viser, at de avancerede funktionelle funktioner (dvs. 2-niveau kulturkammer og forbedret peristaltisk pumpe) af den foreslåede mikrofluidic chip overgår tidligere rapporterede enheder og opfylder behovet for at gennemføre tusindvis af parallelle eksperimenter. Vi beskrev også de afgørende parametre (f.eks. vedligeholdelse af konditioneret medium), som man omhyggeligt bør kontrollere for at opretholde sunde miljøer for primær- og stamcellekulturen.
Cellebaserede biomedicinske eksperimenter, som omfatter komplekse protokoller og programmeret tilsætning af kemikalier, anses ofte for tidskrævende og besværlige. Ud over cellemanipulationsprocedurerne kræver kombinatoriske input af 6 lægemidler med timepåfyldning mindst 250 pipetteringstrin i timen og gentagelse indtil slutningen af eksperimentet. Desuden kræver modellering af dynamiske miljøforhold in vivo rettidig tilsætning af en eller flere cytokiner, ligands og lægemidler med nøjagtigheden af sekunder, hvilket er umuligt for manuelle operationer. Vi heri viser, at ved at forbinde indløb af chippen til flere lægemidler, eller forskellige koncentrationer af enkelt stof, kombinatorisk, sekventiel og dynamisk varierende input signaler kan genereres og vedligeholdes i shear-fri cellulære miljøer. De morfologiske og kemiske reaktioner af celler og væv, som opretholdes i de parallelt kørende kulturkamre, kan derefter overvåges i realtid ved hjælp af den kommercielle mikroskopsoftware.
Med stigende gennemløb af mikrofluidiske enheder og automatiseret dataindsamling under bioimaging kan live cellebilledsystemet generere tusindvis af billeder hver time. For eksempel genererer kontinuerlig kørsel af 1500-enhed chippen i en uge 252.000 billeder. Det kan tage måneder manuelt at spore udviklingen af væv og cellepopulationer (f.eks. ekspressionsniveauet for de fluorescerende mærkede biomolekyler) på enkeltcelleniveau. Ved hjælp af et tilpasset MATLAB-program kan de massive data automatisk sorteres, formateres og analyseres. Spor, der viser mobilitet, morfologiske træk og udtryksniveau for signalmolekyler, kan hentes (vist i videoen), som undgår menneskelige fejl og sparer betydelig tid.
Derfor viser den metode, vi demonstrerer her, passende protokoller for udførelse af biomedicinske eksperimenter med høj gennemløb med automatiseret celle- og vævsmanipulation, fluorescerende billeddannelse og dataanalyse. Tænd/sluk-koblingen af membranventiler giver optimal væskevolumen, tid og rumlig opløsning til at rekonstruere de stadigt skiftende og komplekse miljøforhold for in vitro som et organ-on-chip. Selv om protokollen er betydeligt mere kompleks i forhold til de midlertidige biomedicinske tilgange (f.eks. manuelle procedurer, der anvender 96-brøndsplader), er den præsenterede protokol og platform ikke begrænset til undersøgelser af celle- og vævsfunktioner. Screeningen af kombinatorisk og sekventiel lægemiddelinput kan give os mulighed for at udvikle terapier til kliniske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfattere anerkender den tekniske støtte fra Zhifeng Cheng af Chansn Instrument (Kina) LTD. Dette arbejde blev støttet af tilskud (National Natural Science Foundation of China,51927804).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, International Society for Optics and Photonics. 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R.
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , Humana Press. Totowa, NJ. 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
