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Bioengineering

एक उच्च थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके गतिशील पर्यावरणीय स्थितियों का उत्पादन

Published: April 17, 2021 doi: 10.3791/61735
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Cultivation Base for Photoelectric Technology and Functional Materials, State Key Laboratory of Photon-Technology in Western China Energy, Institute of Photonics and Photon-Technology, Northwest University
* These authors contributed equally

Summary

हम जटिल जीवन मशीनरी पर उच्च थ्रूपुट अध्ययनों के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम पेश करते हैं, जिसमें 1500 संस्कृति इकाइयां, बढ़ी हुई पेरिस्टाटिक पंपों की एक सरणी और साइट पर मिश्रण मोडुलस शामिल हैं। माइक्रोफ्लुइडिक चिप वीवो में अत्यधिक जटिल और गतिशील सूक्ष्म पर्यावरणीय स्थितियों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

Abstract

वीवो पर्यावरणीय स्थितियों में नकल करना जटिल जीवन मशीनरी पर इन विट्रो अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, लाइव कोशिकाओं और अंगों को लक्षित करने वाली वर्तमान तकनीकें या तो अत्यधिक महंगी हैं, जैसे रोबोटिक्स, या तरल हेरफेर में नैनोलिटर वॉल्यूम और मिलीसेकंड समय सटीकता की कमी है। हम यहां एक माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम का डिजाइन और निर्माण प्रस्तुत करते हैं, जिसमें 1,500 संस्कृति इकाइयां, बढ़ी हुई पेरिस्टाल्टिक पंपों की एक सरणी और साइट पर मिश्रण मोडुलस होता है। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की क्षमताओं को प्रदर्शित करने के लिए, प्रस्तावित प्रणाली में तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) क्षेत्रों को बनाए रखा जाता है। हमने देखा कि जब एनएससी क्षेत्र 1 दिन में सीएक्ससीएल और 2 दिन में ईजीएफ के संपर्क में आता है, तो गोल आकार की संरचना को अच्छी तरह से बनाए रखा जाता है । 6 दवाओं के इनपुट क्रम में भिन्नता एनएससी क्षेत्र में रूपात्मक परिवर्तन और एनएससी स्टेमनेस (यानी, हेस 5 और डीसीएक्स) के लिए अभिव्यक्ति स्तर के प्रतिनिधि मार्कर का कारण बनती है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि गतिशील और जटिल पर्यावरणीय स्थितियों का एनएससी भेदभाव और आत्म-नवीकरण पर बहुत प्रभाव पड़ता है, और प्रस्तावित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस जटिल जीवन मशीनरी पर उच्च थ्रूपुट अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मंच है।

Introduction

बायोमेडिकल और क्लीनिकल स्टडीज के लिए हाई थ्रूपुट तकनीक महत्वपूर्ण है। लाखों रासायनिक, आनुवंशिक, या लाइव सेल और ऑर्गेनॉइड परीक्षणों का समानांतर रूप से आयोजन करके, शोधकर्ता तेजी से जीन की पहचान कर सकते हैं जो जैव-आणविक मार्ग को मिलाते हैं, और अनुक्रमिक दवा इनपुट को किसी की विशिष्ट जरूरतों के लिए अनुकूलित करते हैं। एक डिवाइस नियंत्रण कार्यक्रम के साथ संयोजन में रोबोटिक्स1 और माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स जटिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को स्वचालित होने की अनुमति देते हैं, सेल/ऊतक हेरफेर, तरल हैंडलिंग, इमेजिंग, और डेटा प्रोसेसिंग/नियंत्रण2,3को कवर करते हैं । इसलिए, वांछित थ्रूपुट4, 5के अनुसार, एक ही चिप पर सैकड़ोंऔरहजारों प्रायोगिक स्थितियों को बनाए रखा जासकताहै।

इस प्रोटोकॉल में, हमने माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की डिजाइन और निर्माण प्रक्रिया का वर्णन किया, जिसमें 1500 संस्कृति इकाइयां, बढ़ी हुई पेरिस्टाटिक पंपों की एक सरणी और साइट पर मिश्रण मोडुलस शामिल हैं। 2-स्तरीय सेल कल्चर चैंबर मध्यम विनिमय के दौरान अनावश्यक कतरनी को रोकता है, जो दीर्घकालिक लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक अव्यवस्थित संस्कृति वातावरण सुनिश्चित करता है। अध्ययनों से पता चलता है कि प्रस्तावित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस जटिल जीवन मशीनरी पर उच्च थ्रूपुट अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मंच है। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक चिप की उन्नत विशेषताएं वीवो में अत्यधिक जटिल और गतिशील माइक्रोएनवायरमेंटल स्थितियों के स्वचालित पुनर्गठन की अनुमति देती हैं, जैसे एवरचेंग साइटोकिन्स और लिगांड रचनाएं6,7,जिनके पूरा होने में 96-वेल प्लेट जैसे पारंपरिक प्लेटफार्मों के लिए महीने लगते हैं।

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Protocol

1. माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स डिजाइन

  1. माइक्रोफ्लुइडिक मल्टीप्लेक्सर डिजाइन जिसमें 18 इनलेट्स होते हैं, जिनमें से प्रत्येक को एक व्यक्तिगत वाल्व और एक पेरिस्टाल्टिक पंप द्वारा नियंत्रित किया जाता है। प्रति पंपिंग चक्र द्वारा संचालित तरल मात्रा को बढ़ाने के लिए, पेरिस्टाल्टिक पंप को 3 नियंत्रण चैनलों से बना दिया गया है, जिसे जानबूझकर 200 माइक्रोन और 10 कनेक्टेड फ्लो लाइनों तक चौड़ा किया गया था।
  2. कतरनी मुक्त संस्कृति कक्ष डिजाइन। 2-स्तरीय संस्कृति इकाई की प्रतिकृति एक निचले सेल संस्कृति कक्ष (400 माइक्रोन एक्स 400 माइक्रोन एक्स 150 माइक्रोन) और एक उच्च बफर लेयर (400 माइक्रोन x 400 माइक्रोन x 75 माइक्रोन) द्वारा बनाई गई है, जो मध्यम विनिमय(चित्र 1)के दौरान कोशिकाओं पर अवांछित कतरनी तनाव को रोकती है।
  3. डिजाइन उच्च थ्रूपुट सुविधाओं। संस्कृति इकाई को 30 x 50 मैट्रिक्स लेआउट बनाने के लिए डुप्लिकेट करें, आकार में 5 सेमी तक लगभग 7 सेमी के क्षेत्र पर कब्जा करते हैं।

2. चिप निर्माण और संचालन

  1. यूवी लिथोग्राफी का उपयोग करके प्रतिकृति मोल्डिंग का निर्माण
    नोट: प्रतिकृति मोल्डिंग मानक फोटोलिथोग्राफी प्रोटोकॉल8के अनुसार सिलिकॉन वेफर पर गढ़ा गया था ।
    1. चैनल संरचनाओं का निर्माण
      1. कताई फोटोरेसिस्ट: स्पिन कोट एस-8 3025 नकारात्मक फोटोरेसिस्ट के 500 आरपीएम पर सिलिकॉन वेफर पर 10 एस के लिए और 30 एस के लिए 3000 आरपीएम।
      2. सॉफ्ट बेक: वेफर को 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर हॉटप्लेट पर रखें और फिर 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, इसे कमरे के तापमान तक ठंडा करें।
      3. संरेखण और इलाज: संरेखक के धारक पर वेफर और मास्क को ठीक करें और उजागर फोटोरेसिस्ट को ठीक करने के लिए 18 एस के लिए प्रकाश स्रोत चालू करें।
      4. पूर्व पोस्ट एक्सपोजर सेंकना: कमरे के तापमान से 110 डिग्री सेल्सियस/घंटा पर 95 डिग्री सेल्सियस तक वेफर रैंप और इसे हटाने तक कम से ४० मिनट रखने के लिए ।
      5. विकास: विकासशील समाधान (एसयू-8 डेवलपर) में वेफर को डुबोएं और अनावश्यक फोटोरेसिस्ट को धोने और 25 माइक्रोन-हाई चैनल संरचना प्राप्त करने के लिए इसे 2.5 मिनट तक उत्तेजित करें।
      6. हार्ड बेक: ग्लास पेट्री डिश के साथ वेफर को कवर करें और 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें, फिर 120 डिग्री सेल्सियस/घंटा पर 160 डिग्री सेल्सियस तक रैंप करें और इसे 3 घंटे के लिए रखें।
    2. बफर परत के साथ सेल संस्कृति कक्ष का निर्माण
      1. ऊपर वेफर पर एसयू-8 3075 नकारात्मक फोटोरेसिस्ट के 7 एमएल स्पिन कोट करने के लिए चरण 2.1.1.1.1 के मापदंडों का उपयोग करें।
      2. नरम सेंकना (चरण 2.1.1.2 में वर्णित) वेफर और वेफर पर मार्कर के साथ अच्छी तरह से संरेखित करने के लिए मुखौटा बदलें। फिर उजागर फोटोरेसिस्ट का इलाज करने के लिए 24 एस के लिए प्रकाश स्रोत चालू करें।
      3. विकासशील समाधान (एसयू-8 डेवलपर) के लिए वेफर डुबकी और यह 4 मिनट और ४० सेकंड के लिए आंदोलन के लिए बंद अनावश्यक फोटोरेसिस्ट धोने और एक ७५ μm उच्च परत संरचना है कि 25 μm उच्च चैनल संरचना के आसपास पहले गढ़े मिलता है । हार्ड बेक (चरण 2.1.1.6 में वर्णित) जटिल संरचना को मजबूत बनाने के लिए वेफर।
      4. परत संरचना पर स्टैक 75 माइक्रोन-हाई चैंबर संरचना बनाने के लिए चरण 2.1.2.1-2.1.2.3 दोहराएं।
    3. वाल्व संरचनाओं का निर्माण
      1. उपरोक्त वेफर पर AZ 50x सकारात्मक फोटोरेसिस्ट के 5 एमएल स्पिन कोट करने के लिए चरण 2.1.1.1 के पैरामीटर का उपयोग करना।
      2. नरम सेंकना (कदम 2.1.1.2 में वर्णित) वेफर और मुखौटा वेफर पर मार्कर के साथ अच्छी तरह से गठबंधन करते हैं, तो 20 एस के लिए पर प्रकाश स्रोत रखने के लिए और 30 s के लिए तुरंत बंद । उजागर फोटोरेसिस्ट को ठीक करने के लिए 5 हलकों में प्रकाश को दोहराएं।
      3. डेवलपर मिलान करने के लिए वेफर डुबकी और यह लगभग 8 मिनट के लिए आंदोलन करने के लिए बंद अनावश्यक फोटोरेसिस्ट धोने और गोल आकार वाल्व है कि नियंत्रण चैनलों के साथ ओवरलैप करने के लिए अच्छा कनेक्शन सुनिश्चित करने के लिए मिलता है । हार्ड बेक (चरण 2.1.1.6 में वर्णित) नमूनों वेफर पूरे मॉडल को मजबूत बनाने के लिए।
  2. सॉफ्ट लिथोग्राफी का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चिप उत्पादन
    1. 15 मिनट के लिए रिमेथाइलक्लोरोसिलीन के साथ पैटर्न वाले और खाली सिलिकॉन वेफर्स का इलाज करें।
    2. पीडीएमएस जेल के 3 भाग (मोनोमर/उत्प्रेरक अनुपात के 10:1) क्रमशः 50 ग्राम प्रवाह परत, 20 ग्राम नियंत्रण परत 2, और 20 ग्राम झिल्ली के अनुरूप तैयार करें।
    3. पैटर्न वाले सिलिकॉन वेफर पर पीडीएमएस जेल के 50 ग्राम कास्ट करें, और प्रवाह परत को कॉपी करने के लिए -0.85 MPa पर वैक्यूम चैंबर में 1-2 घंटे के लिए उन्हें डी-गैस करें।
    4. डेगास पीडीएमएस के 20 ग्राम के 2 भागों और एक नियंत्रण परत और झिल्ली परत तैयार करने के लिए 30 एस के लिए 2000-2800 आरपीएम पर पैटर्न वाले वेफर और एक खाली सिलिकॉन वेफर पर स्पिन।
    5. पीडीएमएस से ढके वेफर्स को इनक्यूबेशन के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए हवादार ओवन में रखें।
    6. अनुकूलित ऑप्टिकल डिवाइस (100x में ज़ूम) और प्लाज्मा नक़्क़ाशी मशीन के माध्यम से विभिन्न परतों को एक साथ संरेखित और बांड करें। इसके बाद चिप की बॉन्डिंग बढ़ाने के लिए इसे 80 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए वेंटिलेशन ओवन में रखें।
    7. चिप पर इनलेट छेद पंच, और फिर यह एक PDMS पर बांड-लेपित कवरलिप और उपयोग से पहले ८० डिग्री सेल्सियस पर कम से 12 घंटे के लिए ठीक हो ।
  3. चिप ऑपरेशन
    1. चिप की नियंत्रण परत के लिए लघु वायवीय सौनॉयड वाल्व कनेक्ट करें, और स्विच को लिंक और नियंत्रित करने के लिए अनुकूलित मैटलैब ग्राफिकल यूजर इंटरफेस8 खोलें।
    2. 25 साई के लिए पुश-अप पीडीएमएस झिल्ली वाल्व के समापन दबाव निर्धारित करें।
    3. वाल्वों के समय पर बंद करके नामित कक्षों(चित्रा 2डी)को गतिशील रूप से बदलते संयोजन/अनुक्रमिक आदानों को वितरित करें ।

3. सेलुलर माइक्रोएनवायरमेंट्स में गतिशील आदानों का उत्पादन

  1. चिप उपचार और सेल लोडिंग
    1. कम से कम 5 घंटे तक माइक्रोस्कोप पर मानक संस्कृति की स्थिति (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)बनाए रखें।
    2. चिप को कोटिंग माध्यम (यानी, नोट में उल्लिखित) के साथ भरें और इसे मानक संस्कृति स्थितियों (चरण 3.1.1 में वर्णित) पर कम से कम एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. एक स्वस्थ संस्कृति वातावरण का निर्माण करने के लिए फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) या सेल कल्चर मीडियम (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम, डीएमईएम) द्वारा चिप को फ्लश करें।
    4. 80% संकुचन पर फसल कोशिकाओं, और ~ 10 6 /एमएलके घनत्व पर संस्कृति मीडिया (DMEM) का उपयोग कर कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। फिर सेल युक्त समाधान पर दबाव बनाकर चिप में सेल लोड करें।
      नोट: चिप पर विभिन्न सेल लाइनों को बनाने के लिए सेल संस्कृति कक्ष के इलाज के लिए इसी कोटिंग माध्यम की आवश्यकता होती है। आमतौर पर, 3T3 फाइब्रोब्लास्ट और मुर्गी की अनुयायी संस्कृति पर प्रयोगों के लिए संस्कृति कक्षों को नियंत्रित करने वाले सभी वाल्व खुले हैं, कोशिकाएं एक ही कॉलम के भीतर सभी संस्कृति कक्षों में प्रवाहित होती हैं।
  2. हाई थ्रूपुट लाइव-सेल इमेजिंग के लिए सेटअप
    नोट: छवि अधिग्रहण के लिए, एक स्वचालित ट्रांसलेशनल स्टेज और एक डिजिटल पूरक धातु-ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (सीएमओएस) कैमरे के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था। मंच और छवि अधिग्रहण अनुकूलित सॉफ्टवेयर के माध्यम से नियंत्रित किया गया।
    1. 50 कक्ष मैट्रिक्स द्वारा 30 के प्रत्येक कक्ष के स्थान निर्देशांक को पुष्ट करने और परिभाषित करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र में 10x उद्देश्य लेंस का उपयोग करके संस्कृति कक्षों के मैट्रिक्स की कल्पना करें।
    2. उद्देश्य लेंस को 20x या 40x में बदल दें, फिर वांछित कक्ष के स्थान निर्देशांक का चयन करें और पुष्टि के बाद सौंपे गए स्थिति में ट्रांसलेशनल चरण चलता है। एक इष्टतम छवि प्राप्त करने के लिए एक्स, वाई, जेड फोकल प्लेन को ठीक ट्यून करें।
    3. इष्टतम प्रकाश तीव्रता, बेनकाब समय, और अन्य चित्रित मापदंडों प्रत्येक चैनल के लिए व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया गया (यानी, उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरेसेंस इमेजिंग)।
    4. इंटरवल और इमेजिंग चक्र की अवधि निर्धारित करें, रास्ता बचाएं और फिर इमेजिंग शुरू करें।

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Representative Results

पारंपरिक ऑन-चिप पेरिस्टाल्टिक पंप को सबसे पहले 2000 में स्टीफन क्वेक द्वारा वर्णित किया गया था, जिसका उपयोग करते हुए पेरिस्टलसिस पैटर्न 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10द्वारा अधिनियमित किया गया था। संख्या 0 और 1 3 क्षैतिज नियंत्रण लाइनों के "खुले" और "बंद" का संकेत देता है। 3 से अधिक वाल्व (जैसे, पांच) का उपयोग कर अध्ययन भी11की सूचना दी गई है । हालांकि 3 नियंत्रण लाइनों और 3 प्रवाह लाइनों द्वारा रचित पेरिस्टाल्टिक पंप नैनोलिटर सटीकता प्रदान करता है, परिवहन दर 1,500 संस्कृति कक्षों को खिलाने के लिए बहुत धीमी है। समस्या को हल करने के लिए, हम प्रति पंपिंग चक्र (यानी, 101, 100, 110, 010, 011, 001) द्वारा संचालित तरल मात्रा को बढ़ाने के लिए अधिक प्रवाह लाइनें (यानी, 10 जुड़े चैनल) शामिल हैं। इस प्रकार, पोषक तत्वों और दवाओं को प्रभावी ढंग से नामित कक्षों में वितरित किया जा सकता है। पेरिस्टाल्टिक पंप ले जाया तरल मात्रा पंपिंग चक्र प्रति ~ 50 नैनोलीटर के लिए 16x से बढ़ सकते हैं। चूंकि पेरिस्टाल्टिक पंपों की सरणी को 3 कनेक्टेड कंट्रोल चैनलों(चित्रा 1b)द्वारा नियंत्रित किया जाता है, प्रत्येक इनलेट से समाधान चिप में एक साथ वितरित किए जाते हैं और तुरंत मिश्रण की अनुमति देते हैं। इसलिए, विभिन्न समाधानों से जुड़े इनलेट्स के समय पर ऑन-ऑफ द्वारा संयोजन और अनुक्रमिक आदानों को उत्पन्न किया जा सकता है। एक ही पद्धति का उपयोग करके, गतिशील अलग-अलग साइटोकिन और लिगांड सांद्रता भी उत्पन्न की जा सकती है। उदाहरण के लिए, 0.0005 से 0.01 ग्राम/एल तक के चरण आकारों के साथ एकाग्रता में 1, 0.9, 0.2, 0.05, 0.01 ग्राम/एल और 4 ब्लैंक कल्चर मीडिया के चयनित संयोजन एकाग्रता में एक ज्या तरंग उतार-चढ़ाव (0 से 0.5 ग्राम/एल के बीच) उत्पन्न कर सकते हैं।

प्राथमिक कोशिकाओं की संस्कृति के लिए, एक स्थिर माइक्रोएनवायरमेंट बनाए रखना महत्वपूर्ण है। मध्यम विनिमय के दौरान तनाव और वातानुकूलित माध्यम की थकावट सेलुलर व्यवहार और सेल भाग्य को प्रभावित करेगी12. इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हम मध्यम विनिमय(चित्रा 1c)के दौरान कोशिकाओं पर अवांछित कतरनी तनाव को रोकने के लिए एक बफर परत डिजाइन करते हैं। पारंपरिक संस्कृति इकाइयों के विपरीत, डिवाइस के मुख्य फायदे (यानी, वाल्व-नियंत्रित) स्वतंत्र परिस्थितियों के ऑन-साइट मिश्रण, वितरण और रखरखाव की उनकी क्षमताएं हैं। चित्रा 2डीमें, हमने प्रदर्शन किया कि एक जटिल चीनी शब्द चिप पर तरल पदार्थों की सटीक डिलीवरी के माध्यम से नामित पदों और व्यक्तिगत संस्कृति कक्षों में एक अप्रभावित स्थिति के रखरखाव के माध्यम से बनाया जा सकता है । ऑन-साइट मिश्रण में सक्रिय तरल उपकरण की क्षमताओं को एक वीडियो क्लिप के साथ चित्रित किया जाता है, जो संस्कृति कक्ष(चित्रा 3c और वीडियो 7:47-7:50) में गतिशील रूप से बदलते फिटसी सांद्रता दिखाता है, जो 2 इनलेट्स12से जुड़े 2 स्वतंत्र पेरिस्टाल्टिक पंपों की पंपिंग दर को नियंत्रित करके पूरा किया जाता है। संख्यात्मक सिमुलेशन से पता चलता है कि जब माध्यम संस्कृति कक्षों के माध्यम से ऊपर नीचे निर्देशित है, कतरनी प्रवाह जल्दी से संस्कृति के नीचे अच्छी तरह से पहुंचता है (वीडियो 4:07-4:25) । जब समाधान को बाएं से दाएं निर्देशित किया जाता है तो कतरनी बलों को प्रभावी ढंग से रोका जा सकता है। यहां तक कि 10 मिमी/एस की इनपुट प्रवाह दर पर, सेल या माइक्रोमीटर आकार के ऊतक संस्कृति इकाई के तल पर अशान्त रहता है ।

जैसा कि चित्रा 3b(1) में दिखाया गया है, प्रत्येक इनलेट निचले पेरिस्टाल्टिक पंप के अलावा एक वाल्व द्वारा नियंत्रित होता है। जब एक दवा को नामित कक्षों में वितरित करने के लिए चुना जाता है, तो दवा से जुड़ा प्रवेश खुला होता है और पेरिस्टाल्टिक पंप की सरणी का संचालन केवल इस दवा को परिवहन करता है। 2 या कई दवाओं के लिए, हम समान मात्रा में दवाओं का मिश्रण उत्पन्न करने के लिए कनेक्टेड इनलेट्स खोलते हैं। हम सरणी(चित्रा 2 जी)से स्वतंत्र एक स्वतंत्र पेरिस्टाटिक पंप को भी एकीकृत करते हैं, जो सरणी से एक अलग पंपिंग दर पर काम कर सकता है और इसलिए विभिन्न कमजोर पड़ने उत्पन्न करता है। वीवो एनएससी गतिशील पर्यावरणीय स्थितियों में नकल करने के लिए, 6 लिगांड (यानी, दांतेदार, डीएलएल, ईजीएफ, पीएपीएपी, सीएससीएल, पीडीजीएफ)की अनुक्रमिक और संयोजन स्थिति, जिसमें 720 और 56 विभिन्न स्थितियां होती हैं, पेरिस्टाटिक पंपों की सरणी का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे और नामित कक्षों को वितरित किया गया था। विस्तार से, अनुक्रमिक स्थितियों को एसआईजे के रूप में दर्शाया जा सकता है = {लिगांड मुझे दिन मेंजोड़ा जाता है } और सीआई के रूप में एक संयोजन की स्थिति = {लिगांड मैं वर्तमान में है}, जहां लिगांड मैं = दांतेदार, डीएलएल, ईजीएफ, पाकैप, सीएक्ससीएल, पीडीजीएफ और जे= 1,2,3,4,5,6। एनएससी कोशिकाओं और क्षेत्रों की प्रतिक्रियाएं संस्कृति और उत्तेजना के दौरान हर 2 घंटे में दर्ज की गईं ।

एनएससी क्षेत्रों को 400 माइक्रोन सेल कल्चर चैंबर(चित्रा 2e और चित्रा 4)द्वारा 400 माइक्रोन में बनाए रखा जाता है। स्टेम सेल के विभेदन और स्टेमनेस (यानी, आत्म-नवीकरण) क्रमशः डीसीएक्स और हेस 5 के अभिव्यक्ति स्तर द्वारा दर्शाए जाते हैं। हमने देखा कि जब एनएससी क्षेत्र 1 दिन में सीएक्ससीएल और 2 दिन में ईजीएफ के संपर्क में आता है, तो गोल आकार की संरचना को अच्छी तरह से बनाए रखा जाता है और क्षेत्र के आकार में स्पष्ट वृद्धि होती है । उच्चडीसीएक्स अभिव्यक्ति स्तर वाले एनएससी 3 दिन मर जाते हैं जबईजीएफ को PACAP द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, जो विभेदित कोशिकाओं13,14, 15,16पर प्रभाव का सुझावदेताहै। कोशिकाएं 4 दिन डीएलएल द्वारा उत्तेजना पर अनुपचारित पीडीएमएस सतह को संलग्न करना शुरू करतीहैं, और 5वें दिन पीडीजीएफ के अलावा व्यक्तिगत कोशिकाओं में अलग-अलग होती हैं और 6 वें दिन दांतेदार होतीहैं। इन 6 लिगामेंट्स के इनपुट ऑर्डर में बदलाव विशिष्ट एनएससी स्टेटस(चित्रा 5)लाते हैं । उदाहरण के लिए, एनएसएक्स का विकास नाटकीय रूप से बदलता है जब सीएक्ससीएल अनुक्रम(चित्र 5 ए और 5b)के साथ पीडीजीएफ के साथ स्थिति को स्विच करता है। इन परिणामों से पता चलता है कि गतिशील अलग-अलग पर्यावरणीय स्थितियों का एनएससी भेदभाव और आत्म-नवीकरण पर बहुत प्रभाव पड़ता है, जो जैव चिकित्सा अध्ययनों के साथ-साथ नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए मस्तिष्क-ऑन-चिप प्लेटफार्मों के विकास का मार्ग प्रशस्त करता है।

Figure 1
चित्रा 1:उच्च थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक चिप का डिजाइन। बढ़ी हुई पेरिस्टाल्टिक पंप में कई प्रवाह चैनल और चौड़ा नियंत्रण चैनल होते हैं, जिससे प्रति पंपिंग चक्र स्थानांतरित तरल मात्रा में वृद्धि होती है। ख. पेरिस्टाल्टिक पंपों की सरणी 3 कनेक्टेड कंट्रोल लाइनों द्वारा नियंत्रित की जाती है। इसलिए, प्रोग्राम किए गए समय बिंदुओं पर विभिन्न इनलेट्स को शामिल करने से संयोजन, अनुक्रमिक और गतिशील अलग-अलग इनपुट सिग्नल उत्पन्न हो सकते हैं। ग. अवांछित कतरनी प्रवाह को रोकने के लिए, हमने 2-स्तरीय संस्कृति इकाई तैयार की। कोशिकाओं को निचले स्तर के नीचे बनाए रखा जाता है, जो गहराई में 150 माइक्रोन है। घ. प्रत्येक संस्कृति कक्ष 4 चैनलों से जुड़ा हुआ है, जिससे समाधान को ऊपर-नीचे और बाएं-दाएं दिशाओं के माध्यम से निर्देशित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:उच्च थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक चिप का निर्माण। नियंत्रण और प्रवाह परतों के माइक्रोस्ट्रक्चर सबसे पहले सिलिकॉन वेफर पर पैटर्न किए गए थे, जिस पर पीडीएमएस प्रतिकृति के लिए डाली जाती है। ख. प्लाज्मा नक़्क़ाशी और थर्मल बॉन्डिंग का उपयोग करके नियंत्रण, झिल्ली और प्रवाह परतों को एक साथ गठबंधन और बंधुआ किया जाता है। सी-एफ। चिप की उन्नत विशेषताओं को हरे, नीले और पीले रंग के खाद्य रंगों का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है। हम बताते हैं कि वाल्व के समय पर बंद करके, नैनोलिटर सटीकता के समाधान नामित कक्षों को वितरित किया जा सकता है। g.पेरिस्टाल्टिक पंपों की सरणी 3 कनेक्टेड कंट्रोल लाइनों (यानी, कंट्रोल-1) द्वारा नियंत्रित होती है, और अन्य 3 नियंत्रण लाइनों (यानी, नियंत्रण-2) द्वारा नियंत्रित एक स्वतंत्र पेरिस्टाल्टिक पंप द्वारा नियंत्रित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:सक्रिय तरल उपकरण दिखा एक योजनाबद्ध। एक योजनाबद्ध दिखा रहा है कि(क)कोशिकाएं बाईपास चैनल के माध्यम से बहती हैं; (ख)वाल्व इनलेट और पेरिस्टाल्टिक पंप को नियंत्रित करते हैं; और(ग)कोशिकाएं संस्कृति कक्षों में प्रवाहित होती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:एनएससी क्षेत्र के प्रतिनिधि चित्र जब अनुक्रमिक दवा इनपुट द्वारा उत्तेजित किया जा रहा है । उज्ज्वल क्षेत्र (शीर्ष पंक्ति), Hes5-GFP (दूसरी पंक्ति), Dcx-Desred(तीसरी पंक्ति) छवियों से पता चलता है कि अनुक्रमिक उत्तेजना पर, पर्याप्त सेल मौत दोनों DCx-उच्चऔर Hes5-उच्च कोशिकाओं के बीच होता है । अंधेरे क्षेत्र के उद्भव स्टेम सेल, जो ज्यादातर कोर क्षेत्र में स्थानीयकरण की मौत का पता चलता है । स्केल बार: 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5:विभिन्न अनुक्रमिक आदानों द्वारा उत्तेजित होने पर एनएससी क्षेत्र संरचना, डीसीएक्स और हेस5 अभिव्यक्ति स्तर में भिन्नता। यह दर्शाया जाता है कि 6 दवाओं के इनपुट क्रम में भिन्नता ऊतक, रूपात्मक और संकेत अणुओं के अभिव्यक्ति स्तर में परिवर्तन का कारण बनती है, जो एनएससी क्षेत्र की गतिशील पर्यावरणीय स्थितियों की संवेदनशीलता को दर्शाती है। इनपुट सीक्वेंस: (DLL>GT> GXCL>> GT>> GT>& GT>> GTCL>>GT; GT>> GT>GT>GT; GTCL>GT; GT> GT& GT; GT; GT& GT; GT>GT>GT; GT> GT>& GT>GT& GT>GT; GTgt इस दौरान पीडीजीसीएल ने कहा किइस तरह की घटनाओं को ख़रीदना चाहिए। स्केल बार: 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मल्टीप्लेक्स और जटिल प्रयोगों को करने के लिए विभिन्न माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण विकसित किए गएहैं. उदाहरण के लिए, टोपोलॉजिकल अवकाशों की एक सरणी से बने माइक्रोवेल बाहरी बल के उपयोग के बिना व्यक्तिगत कोशिकाओं को फंसा सकते हैं, जिसमें छोटे नमूना आकार, समानांतरीकरण, कम सामग्री लागत, तेज प्रतिक्रिया, उच्च संवेदनशीलता21, 22,23,24सहित लाभप्रद पात्रों को दिखायाजासकताहै। बूंद और सतह तनाव सीमित बूंद एक माइक्रोपंप जैसे सहायक हार्डवेयर की आवश्यकता को खत्म कर देती है, जिससे बूंदों का परिवहन अधिक कम लागत वाला और पर्यावरण-मित्र25, 26होजाताहै। तरल पदार्थों की बूंदों को माइक्रोपिपेट या स्प्रेयर नोजल द्वारा सतह पर आसानी से जमा किया जा सकता है, और प्रयोगों के बाद, सिस्टम को facilely ताजा और पुन: प्रयोज्य27, 28हो सकता है। स्लिपचिप तकनीक एकीकृत पंपों या वाल्व की भागीदारी के बिना मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाओं की अनुमति देती है, और इसलिए उपयोगकर्ता और निर्माता के अनुकूल29,30। हालांकि, इन प्रणालियों को कई तकनीकी बाधाओं का सामना करना पड़ता है, जैसे सूक्ष्म कुओं में नैनोलिटर समाधानों का भंडारण, आर्द्रता को नियंत्रित करना, और समानांतर कम मात्रा तरल वितरण प्रौद्योगिकियों की सीमाएं ।

इस पेपर में, हमने लाइव सेल इमेजिंग सिस्टम और एक अनुकूलित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके उच्च थ्रूपुट बायोमेडिकल प्रयोगों के लिए एक प्रोटोकॉल वर्णित किया है। यूवी और सॉफ्ट लिथोग्राफी सहित चिप निर्माण की प्रक्रियाओं और स्वचालित फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए सेटअप पैरामीटर विस्तार से प्रदर्शित किए जाते हैं। परिणाम बताते हैं कि प्रस्तावित माइक्रोफ्लुइडिक चिप की उन्नत कार्यात्मक विशेषताएं (यानी, 2-स्तरीय संस्कृति कक्ष और उन्नत पेरिस्टाल्टिक पंप) पहले रिपोर्ट किए गए उपकरणों को मात देती हैं और हजारों समानांतर प्रयोगों का संचालन करने की आवश्यकताओं को पूरा करती हैं। हमने महत्वपूर्ण मापदंडों (उदाहरण के लिए, वातानुकूलित माध्यम का रखरखाव) भी वर्णित किया है कि प्राथमिक और स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति के लिए स्वस्थ वातावरण को बनाए रखने के लिए किसी को सावधानीपूर्वक नियंत्रण करना चाहिए।

सेल-आधारित जैव चिकित्सा प्रयोग, जिनमें जटिल प्रोटोकॉल और रसायनों के प्रोग्राम किए गए अतिरिक्त शामिल हैं, को अक्सर समय लेने वाली और श्रमसाध्य माना जाता है। उदाहरण के लिए, सेल हेरफेर प्रक्रियाओं के अलावा, प्रति घंटा रिफिलिंग के साथ 6 दवाओं के संयोजन इनपुट के लिए प्रति घंटे कम से कम 250 पाइपिंग चरणों की आवश्यकता होती है, और प्रयोग के अंत तक पुनरावृत्ति होती है। इसके अलावा, वीवो में गतिशील पर्यावरणीय स्थितियों को मॉडलिंग के लिए सेकंड की सटीकता पर एक या कई साइटोकिन्स, लिगांड और दवाओं को समय पर इसके अलावा करने की आवश्यकता होती है, जो मैनुअल संचालन के लिए असंभव है। हम इसके साथ प्रदर्शित करते हैं कि चिप के इनलेट्स को कई दवाओं से जोड़कर, या एकल दवा की विभिन्न सांद्रता, संयोजन, अनुक्रमिक और गतिशील रूप से अलग-अलग इनपुट संकेतों को कतरनी मुक्त सेलुलर वातावरण में उत्पन्न और बनाए रखा जा सकता है। कोशिकाओं और ऊतकों की रूपात्मक और रासायनिक प्रतिक्रियाएं, जो समानांतर रूप से चल रही संस्कृति कक्षों में बनाए रखी जाती हैं, तब वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है।

बायोइमेजिंग के दौरान माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों और स्वचालित डेटा संग्रह के बढ़ते थ्रूपुट के साथ, लाइव सेल इमेजिंग सिस्टम हर घंटे हजारों छवियां उत्पन्न कर सकता है। उदाहरण के लिए, एक सप्ताह के लिए 1500-यूनिट चिप के निरंतर चलने से 252,000 छवियां उत्पन्न होती हैं। एकल कोशिका स्तर पर ऊतकों और कोशिका आबादी (उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंटली टैग किए गए बायोमॉलिक्यूल्स का अभिव्यक्ति स्तर) के विकास को मैन्युअल रूप से ट्रैक करने में महीनों लग सकते हैं। एक अनुकूलित MATLAB कार्यक्रम का उपयोग करना, बड़े पैमाने पर डेटा स्वचालित रूप से हल किया जा सकता है, स्वरूपित और विश्लेषण । गतिशीलता, रूपात्मक सुविधाओं, और संकेत अणुओं के अभिव्यक्ति स्तर को दिखाने वाले निशान (वीडियो में दिखाए गए) को वापस लाया जा सकता है, जो मानवीय त्रुटि से बचाता है और काफी समय बचाता है।

इसलिए, हम यहां जो कार्यप्रणाली प्रदर्शित करते हैं, वह स्वचालित सेल और ऊतक हेरफेर, फ्लोरोसेंट इमेजिंग और डेटा विश्लेषण के साथ उच्च थ्रूपुट बायोमेडिकल प्रयोगों को करने के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल दिखाती है। झिल्ली वाल्व के ऑन-ऑफ स्विचिंग एक अंग-ऑन-चिप की तरह इन विट्रो के लिए कभी बदलती और जटिल पर्यावरणीय स्थितियों के पुनर्निर्माण के लिए इष्टतम तरल मात्रा, समय और स्थानिक संकल्प प्रदान करता है। हालांकि प्रोटोकॉल संक्रमणकालीन जैव चिकित्सा दृष्टिकोण (उदाहरण के लिए, 96-अच्छी प्लेटों का उपयोग करके मैनुअल प्रक्रियाओं) की तुलना में काफी अधिक जटिल है, फिर भी प्रस्तुत प्रोटोकॉल और मंच कोशिका और ऊतक कार्यों पर अध्ययन तक ही सीमित नहीं हैं। संयोजन और अनुक्रमिक दवा इनपुट की स्क्रीनिंग हमें नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए चिकित्सा विकसित करने के लिए अनुमति दे सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक चांसन इंस्ट्रूमेंट (चाइना) लिमिटेड के झिफेंग चेंग से तकनीकी सहायता को स्वीकार करते हैं । इस काम को ग्रांट (नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना,51927804) ने सपोर्ट किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2713 Loker Avenue West Torrey pines scientific
AZ-50X AZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL Sigma
CO2 Incubator HP151 Heal Force
Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) Invitrogen
Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBS Sigma
Fibronection 0.25 mg/mL Millipore, Austria
Glutamax 100x Gibco
Heating Incubator BGG-9240A Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-E Nikon
Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin Invitrogen
Plasma cleaner PDC-002 Harrick Plasma
polydimethylsiloxane(PDMS) Momentive
polylysine 0.01% Sigma
Spin coater ARE-310 Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WS Cence
Spin coater WH-SC-01 Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025 MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075 MicroChem, Westborough, MA, USA

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References

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एक उच्च थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके गतिशील पर्यावरणीय स्थितियों का उत्पादन
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Che, B., Zhu, J., Sun, D., Feng, X., Zhang, C. Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (170), e61735, doi:10.3791/61735 (2021).

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