Summary
Presentiamo un sistema microfluidico per studi ad alta produttività su macchinari di vita complessi, composto da 1500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche potenziate e un modulo di miscelazione in loco. Il chip microfluidico consente l'analisi delle condizioni micro-ambientali altamente complesse e dinamiche in vivo.
Abstract
Imitare le condizioni ambientali in vivo è fondamentale per gli studi in vitro su macchinari per la vita complessi. Tuttavia, le tecniche attuali che prendono di mira cellule e organi vivi sono molto costose, come la robotica, o mancano di volume nanolitro e precisione del tempo millisecondo nella manipolazione dei liquidi. Nel presente documento presentiamo la progettazione e la fabbricazione di un sistema microfluidico, composto da 1.500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche potenziate e un modulo di miscelazione in loco. Per dimostrare le capacità del dispositivo microfluidico, le sfere di cellule staminali neurali (NSC) vengono mantenute nel sistema proposto. Abbiamo osservato che quando la sfera NSC è esposta al CXCL nel primo giorno e all'EGF nel secondo giorno, la conformazione a forma rotonda è ben mantenuta. La variazione nell'ordine di input di 6 farmaci causa cambiamenti morfologici alla sfera NSC e al marcatore rappresentativo del livello di espressione per la stelo NSC (cioè Hes5 e Dcx). Questi risultati indicano che le condizioni ambientali dinamiche e complesse hanno grandi effetti sulla differenziazione e sull'autorinove NSC, e il dispositivo microfluidico proposto è una piattaforma adatta per studi ad alta produttività sui macchinari di vita complessi.
Introduction
Le tecniche ad alta produttività sono fondamentali per gli studi biomedici e clinici. Conducendo parallelamente milioni di test chimici, genetici o a cellule vive e organoidi, i ricercatori possono identificare rapidamente i geni che modulano una via bio-molecolare e personalizzare l'input sequenziale del farmaco in base alle proprio esigenze specifiche. I chiprobotici 1 e microfluidici in combinazione con un programma di controllo del dispositivo consentono di automatizzate procedure sperimentali complesse, che coprono la manipolazione di cellule / tessuti, la manipolazione di liquidi, l'imaging e l'elaborazione / controllodei dati 2,3. Pertanto, centinaia e migliaia di condizioni sperimentali possono essere mantenute su un singolo chip, in base alla velocità effettivadesiderata 4,5.
In questo protocollo, abbiamo descritto la procedura di progettazione e fabbricazione di un dispositivo microfluidico, che consiste di 1500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche migliorate e modulo di miscelazione in loco. La camera di coltura cellulare a 2 livelli previene il taglio non necessario durante lo scambio medio, il che garantisce un ambiente di coltura indisturbato per l'imaging di cellule vive a lungo termine. Gli studi dimostrano che il dispositivo microfluidico proposto è una piattaforma adatta per studi ad alta produttività sui macchinari di vita complessi. Inoltre, le caratteristiche avanzate del chip microfluidico consentono la ricostituzione automatizzata di condizioni microambientali altamente complesse e dinamiche in vivo, come le composizioni di citochine e ligandi in costanteevoluzione 6,7, il cui completamento richiede mesi per piattaforme convenzionali come la piastra a 96 pozzetti.
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Protocol
1. Design dei chip microfluidici
- Progettare il multiplexer microfluidico composto da 18 insenature, ognuna delle quali è controllata da una singola valvola e da una pompa peristaltica. Per aumentare il volume del liquido guidato dal ciclo di pompaggio, far in modo che la pompa peristaltica sia composta da 3 canali di controllo, che sono stati appositamente allargati a 200 μm, e 10 linee di flusso collegate.
- Progettare la camera di coltura senza taglio. La replicazione dell'unità di coltura a 2 livelli è composta da una camera di coltura cellulare inferiore (400 μm x 400 μm x 150 μm) e da uno strato tampone più elevato (400 μm x 400 μm x 75 μm), che impedisce stress da taglio indesiderato sulle cellule durante loscambio medio (figura 1).
- Progetta funzionalità ad alta produttività. Duplicare l'unità di coltura per formare un layout a matrice 30 x 50, occupando un'area di circa 7 cm per 5 cm di dimensioni.
2. Fabbricazione e funzionamento dei truciolo
- Fabbricazione dello stampaggio della replica utilizzando la litografia UV
NOTA: Lo stampaggio della replica è stato fabbricato su wafer di silicio secondo il protocollo di fotolitografia standard8.- Fabbricazione delle strutture del canale
- Fotoresist rotante: Spin coat 5 mL del fotoresist negativo SU-8 3025 su un wafer di silicio a 500 giri/min per 10 s e 3000 giri/min per 30 s.
- Cuocere morbido: Mettere il wafer su una piastra calda a 65 °C per 2 minuti e poi 95 °C per 10 minuti, raffreddarlo a temperatura ambiente.
- Allineamento e polimerizzazione: fissare il wafer e la maschera sul supporto dell'allineatore e accendere la sorgente luminosa per 18 s per curare il fotoresist esposto.
- Cuocere pre-esposizione: Aumentare il wafer a 95°C a 110°C/h dalla temperatura ambiente e mantenerlo almeno 40 min fino alla rimozione.
- Sviluppare: immergere il wafer nella soluzione in via di sviluppo (sviluppatore SU-8) e agitarlo per 2,5 minuti per lavare via il fotoresist ridondante e ottenere la struttura del canale alta 25 μm.
- Cottura dura: Coprire il wafer con una piastra di Petri in vetro e cuocere a 65 °C per 2 minuti, quindi aumentare fino a 160 °C a 120 °C /h e conservarlo per 3 ore.
- Fabbricazione della camera di coltura cellulare con lo strato tampone
- Utilizzare i parametri del passaggio 2.1.1.1 per ruotare il cappotto 7 mL del fotoresist negativo SU-8 3075 sul wafer di cui sopra.
- Cuocere in modo morbido (descritto al passaggio 2.1.1.2) il wafer e cambiare la maschera per allinearsi bene con i marcatori sul wafer. Quindi accendere la sorgente luminosa per 24 s per curare il fotoresist esposto.
- Immergere il wafer nella soluzione in via di sviluppo (sviluppatore SU-8) e agitarlo per 4 minuti e 40 secondi per lavare via il fotoresist ridondante e ottenere una struttura a strato alta 75 μm che intorno alla struttura del canale alta 25 μm si è fabbricata prima. Cuocere duramente (descritto nel passaggio 2.1.1.6) il wafer per rendere la struttura complessa più forte.
- Ripetere i passaggi 2.1.2.1-2.1.2.3 per fabbricare una struttura a camera alta 75 μm che si impila sulla struttura dello strato.
- Fabbricazione delle strutture delle valvole
- Utilizzando il parametro del passo 2.1.1.1 per girare cappotto 5 mL del fotoresist positivo AZ 50x sul wafer di cui sopra.
- Cuocere in modo morbido (descritto al passaggio 2.1.1.2) il wafer e rendere la maschera allineata bene con marcatori sul wafer, quindi mantenere la sorgente luminosa su 20 s e spenta immediatamente per 30 s. Ripetere la procedura di spegnimento/ spegnimento della luce in 5 cerchi per curare il fotoresist esposto.
- Immergere il wafer allo sviluppatore abbinato e agitarlo per circa 8 minuti per lavare via il fotoresist ridondante e ottenere le valvole a forma rotonda che si sovrappongono ai canali di controllo per garantire una buona connessione. Cuocere duramente (descritto nel passaggio 2.1.1.6) il wafer modellato per rendere l'intero modello più forte.
- Fabbricazione delle strutture del canale
- Produzione di chip microfluidici con litografia morbida
- Trattare i wafer di silicio fantasia e vuoto con rimetilclorosilano per 15 minuti.
- Preparare 3 porzioni di gel PDMS (10:1 del rapporto monomero/catalizzatore) corrispondenti rispettivamente a 50 g di strato di flusso, 20 g di strato di controllo 2 e 20 g di membrana.
- Gettare 50 g di gel PDMS sul wafer di silicio modellato e de-gasarli per 1-2 ore nella camera a vuoto a -0,85 MPa per copiare lo strato di flusso.
- Degasare le 2 porzioni di 20 g di PDMS e girarlo sul wafer a motivi geometrici e un wafer di silicio vuoto a 2000-2800 giri/min per 30 s in modo da preparare uno strato di controllo e uno strato di membrana.
- Mettere i wafer coperti da PDMS in forno di ventilazione per 60 min a 80 °C per l'incubazione.
- Allineare e legare i diversi livelli attraverso un dispositivo ottico personalizzato (zoom in 100x) e una macchina per l'incisione al plasma. Quindi tenerlo in forno ventilato per 2 ore a 80 °C per migliorare l'incollaggio del truciolo.
- Punzonare i fori di ingresso sul truciolo, quindi incollarlo su un coverslip rivestito di PDMS e polimerizzi per almeno 12 ore a 80 °C prima dell'uso.
- Operazione chip
- Collegare le valvole solenoidi pneumatiche in miniatura allo strato di controllo del chip e aprire l'interfaccia utente grafica8 MATLAB personalizzata per collegare e controllare l'interruttore.
- Impostare le pressioni di chiusura delle valvole a membrana PDMS push-up su 25 psi.
- Fornire input combinatoriali/sequenziali che cambiano dinamicamente alle camere designate (Figura 2d) mediante l'on-off tempestivo delle valvole.
3. Generazione di input dinamici nei microambientati cellulari
- Trattamento truciolo e carico cellulare
- Mantenere le condizioni di coltura standard (37 °C, 5% CO2) al microscopio per almeno 5 ore.
- Riempire il truciolo con il mezzo di rivestimento (cioè menzionato nella NOTA) e incubarlo alle condizioni di coltura standard (descritte al passaggio 3.1.1) per almeno un'ora.
- Sciacquare il chip con saline tamponate da fosfati (PBS) o mezzo di coltura cellulare (il mezzo dell'aquila modificata di Dulbecco, DMEM) per costruire un ambiente di coltura sano.
- Raccogliere le cellule all'80% di confluenza e rimorsi le cellule usando mezzi di coltura (DMEM) ad una densità di ~ 106/mL. Quindi caricare le celle nel chip pressurizzando la soluzione contenente celle.
NOTA: La coltivazione di diverse linee cellulari sul chip richiede un mezzo di rivestimento corrispondente per trattare la camera di coltura cellulare. Tipicamente, per esperimenti su fibroblasti 3T3 e coltura aderente di lamenti tutte le valvole che controllano le camere di coltura sono aperte, le cellule fluiscono in tutte le camere di coltura all'interno della stessa colonna.
- Installazione per l'imaging a celle vive ad alta produttività
NOTA: Per l'acquisizione di immagini, è stato utilizzato un microscopio invertito con uno stadio trasdizionale automatizzato e una fotocamera digitale complementare a semiconduttore di ossido di metallo (CMOS). La fase e l'acquisizione delle immagini sono state controllate tramite il software personalizzato.- Visualizza la matrice delle camere di coltura usando una lente obiettivo 10x in campo luminoso per affermare e definire le coordinate di posizione di ogni camera della matrice della camera 30 per 50.
- Trasforma l'obiettivo in 20x o 40x, quindi seleziona le coordinate di posizione della camera desiderata e lo stadio tras trasmizionale si sposta nella posizione assegnata dopo la conferma. Mettere a punto il piano focale x, y, z per ottenere un'immagine ottimale.
- Ottimale l'intensità della luce, il tempo di esposizione e altri parametri immagine sono stati determinati individualmente per ogni canale (ad esempio, imaging a campo luminoso e fluorescenza).
- Impostare l'intervallo e la durata del ciclo di imaging, salvare il percorso e quindi avviare l'imaging.
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Representative Results
La pompa peristaltica convenzionale on-chip è stata descritta per la prima volta da Stephen Quake nel 2000, usando la quale la peristalisi è stata azionata dal modello 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. I numeri 0 e 1 indicano "aperto" e "chiuso" delle 3 linee di controllo orizzontali. Sono stati inoltre riportati studi che utilizzano più di 3 valvole (ad esempio cinque)11. Anche se la pompa peristaltica composta da 3 linee di controllo e 3 linee di flusso fornisce una precisione del nanolitro, la velocità di trasporto è troppo lenta per alimentare 1.500 camere di coltura. Per risolvere il problema, includiamo più linee di flusso (cioè i 10 canali collegati) per aumentare il volume di liquido guidato da per ciclo di pompaggio (cioè 101, 100, 110, 010, 011, 001, 001). Pertanto, i nutrienti e i farmaci possono essere effettivamente consegnati alle camere designate. Il volume del liquido trasportato dalla pompa peristaltica può aumentare da 16x a ~ 50 nanolitri per ciclo di pompaggio. Poiché la gamma di pompe peristaltiche è controllata da 3 canali di controllo collegati (Figura 1b), le soluzioni di ogni ingresso vengono consegnate simultaneamente al chip e consentono la miscelazione istantanea. Gli input combinatori e sequenziali possono quindi essere generati da un tempestivo on-off delle insenature collegate a diverse soluzioni. Utilizzando la stessa metodologia, possono anche essere generate concentrazioni dinamiche variabili di citochina e ligando. Ad esempio, combinazioni selezionate di 1, 0,9, 0,2, 0,05, 0,01 g/L e 4 supporti di coltura vuoti possono generare una fluttuazione dell'onda sine (compresa tra 0 e 0,5 g/L) in concentrazione con dimensioni dei gradini che vanno da 0,0005 a 0,01 g/L.
Per la coltura delle cellule primarie, è fondamentale mantenere un microambiente stabile. Lo stress da taglio e l'esaurimento del mezzo condizionato durante lo scambio medio influenzeranno il comportamento cellulare e il destinocellulare 12. Per superare questi problemi, progettiamo uno strato tampone per evitare stress da taglio indesiderato sulle cellule durante lo scambio medio (Figura 1c). A differenza delle unità di coltura convenzionali, i principali vantaggi del dispositivo (cioè controllato dalla valvola) sono le loro capacità di miscelazione, consegna e mantenimento in loco di condizioni indipendenti. Nella figura 2d, abbiamo dimostrato che una parola cinese complessa può essere creata su chip attraverso la consegna precisa di liquidi in posizioni designate e il mantenimento di una condizione non influenzata nelle singole camere di coltura. Le capacità del dispositivo fluido attivo nella miscelazione in loco sono illustrate con un videoclip, che mostra le concentrazioni FITC che cambiano dinamicamente in una cameradi coltura (Figura 3c e Video 7:47-7:50), che viene eseguita controllando la velocità di pompaggio di 2 pompe peristaltiche indipendenti collegate a 2 insenature12. La simulazione numerica suggerisce che quando il mezzo viene diretto dall'alto verso il basso attraverso le camere di coltura, il flusso di taglio raggiunge rapidamente il fondo del pozzo della coltura (Video 4:07-4:25). Le forze di taglio possono essere efficacemente prevenute quando la soluzione è diretta da sinistra a destra. Anche ad una portata di ingresso di 10 mm/s, il tessuto cellulare o micrometrico rimane indisturbato nella parte inferiore dell'unità di coltura.
Come mostrato nella figura 3b(1), ogni ingresso è controllo da una valvola diversa dalla pompa peristaltica inferiore. Quando un farmaco viene selezionato per essere consegnato in camere designate, l'ingresso collegato al farmaco è aperto e il funzionamento della matrice della pompa peristaltica trasporta solo questo farmaco. Per 2 o più farmaci, apriamo semplicemente le insenature collegate per generare una miscela di farmaci a lo stesso volume. Integriamo anche una pompa peristatica indipendente dall'array (Figura 2g), che potrebbe funzionare a una velocità di pompaggio diversa dall'array e quindi generare diluizioni diverse. Per imitare le condizioni ambientali dinamiche NSC in vivo, le condizioni sequenziali e combinatorie di 6 ligandi (ad esempio, Frastagliato, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF), che consiste in 720 e 56 condizioni diverse, sono state generate utilizzando la gamma di pompe peristaltiche e consegnate alle camere designate. In dettaglio, le condizioni sequenziali possono essere rappresentate come Sij = {ligand i viene aggiunto il giorno j} e una condizione combinatoria come Ci = {ligand i è presente}, dove ligando i = Frastagliato, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF e j=1,2,3,4,5,6. Le risposte delle cellule e delle sfere NSC sono state registrate ogni 2 ore durante la coltura e la stimolazione.
Le sfere NSC sono mantenute nella camera di coltura cellulare di 400 μm per 400 μm (Figura 2e e Figura 4). La differenziazione e la staminalità (cioè l'autorinove) delle cellule staminali sono rappresentate rispettivamente dal livello di espressione di Dcx ed Hes5. Abbiamo osservato che quando la sfera NSC è esposta al CXCL nel giorno 1 e all'EGF nel giorno 2, la conformazione a forma rotonda è ben mantenuta e c'è un evidente aumento delle dimensioni della sfera. Gli NSC con livello di espressionedcx elevato muoiono il 3° giorno quando EGF viene sostituito da PACAP, suggerendo effetti sulle celle differenziate13,14,15,16. Le cellule iniziano ad attaccarsi alla superficie PDMS non trattata dopo la stimolazione tramite DLL il4 ° giorno e si dissociano in singole cellule con l'aggiunta di PDGF il5 ° giorno e Frastagliato il 6° giorno. Le variazioni nell'ordine di input di questi 6 ligandi portano uno stato NSC distintivo (Figura 5). Ad esempio, l'evoluzione degli NSC varia notevolmente quando CXCL cambia posizione con PDGF lungo la sequenza (Figura 5a e 5b). Questi risultati dimostrano che le diverse condizioni ambientali dinamiche hanno grandi effetti sulla differenziazione e sull'autorinoto degli NSC, il che apre la strada allo sviluppo di piattaforme cervello su chip per studi biomedici e applicazioni cliniche.
Figura 1: Progettazione del chip microfluidico ad alta produttività. La pompa peristaltica migliorata è costituita da più canali di flusso e canali di controllo allargati, il che porta ad aumentare il volume di liquido trasferito per ciclo di pompaggio. b. La gamma di pompe peristaltiche è controllata da 3 linee di controllo collegate. Pertanto, l'inclusione di diverse insenature in punti di tempo programmati può generare segnali di ingresso variabili combinatori, sequenziali e dinamici. e. Per evitare flussi di taglio indesiderati, abbiamo progettato un'unità di coltura a 2 livelli. Le cellule vengono mantenute nella parte inferiore del livello inferiore, che è di 150 μm di profondità. d. La commissione per l' Ogni camera di coltura è collegata a 4 canali, consentendo di dire la soluzione attraverso le direzioni dall'alto verso il basso e da sinistra a destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fabbricazione del chip microfluidico ad alta produttività. Le microstrutture degli strati di controllo e flusso sono state in primo luogo modellate su wafer di silicio, su cui viene lanciato IL PDMS per la replicazione. b. Gli strati di controllo, membrana e flusso sono allineati e incollati insieme utilizzando l'incisione al plasma e il legame termico. c-f. Le caratteristiche avanzate del chip sono dimostrate utilizzando coloranti alimentari verdi, blu e gialli. Mostriamo che con l'on-off tempestivo delle valvole, le soluzioni di precisione del nanolitro possono essere consegnate alle camere designate. g. La gamma di pompe peristaltiche è controllata da 3 linee di controllo collegate (cioè Control-1) e da una pompa peristaltica indipendente controllata da altre 3 linee di controllo (cioè Control-2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Schema che mostra il dispositivo fluido attivo. Schema che mostra che le celle (a) scorrono attraverso il canale di bypass; b valvolecontrollano l'ingresso e la pompa peristaltica; e (c) le cellule fluiscono nelle camere di coltura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini rappresentative della sfera NSC quando vengono stimolate dall'apporto sequenziale di farmaci. Campo luminoso (riga superiore), Hes5-GFP (seconda fila), immagini Dcx-Desred (terza fila) mostrano che dopo la stimolazione sequenziale, si verifica una sostanziale morte cellulare tra le cellule alte ealte hes5. L'emergere dell'area oscura suggerisce la morte delle cellule staminali, che si localizzano principalmente nella regione centrale. Barra di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Variazioni nella conformazione della sfera NSC, livello di espressione Dcx ed Hes5, quando vengono stimolate da diversi input sequenziali. È dimostrato che la variazione nell'ordine di input di 6 farmaci causa cambiamenti nel livello di tessuto, morfologico ed espressione delle molecole di segnalazione, indicando la sensibilità della sfera NSC alle condizioni ambientali dinamiche. Sequenze di input: (a) DLL>> PACAP>> EGF>> CXCL>> PDGF>> Frastagliato, (b) DLL>> PACAP >> EGF >> PDGF >> CXCL >> FRAstagliato, (c) DLL >> PACAP >> PDGF >> CXCL >> EGF >> Frastagliato, (d) PDGF >> CXCL >> PACAP >> EGF >> DLL >> Frastagliato. Barra di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Vari dispositivi microfluidici sono stati sviluppati per eseguire esperimenti multiplexati e complessi17,18,19,20. Ad esempio, i microwell fatti di una serie di recessi topologici possono intrappolare singole cellule senza l'uso di forza esterna, mostrando caratteri vantaggiosi tra cui piccole dimensioni del campione, parallelizzazione, minor costo del materiale, risposta piùrapida, alta sensibilità 21,22,23,24. Goccioline e goccioline confinate a tensione superficiale eliminano la necessità di hardware ausiliario come una micropompa, rendendo il trasporto di goccioline più a basso costo ed eco-più amichevole25,26. Gocce di liquidi possono essere facilmente depositate sulla superficie da micropipette o ugelli spruzzatori e, dopo gli esperimenti, i sistemi possono essere facilmente rinfrescati e riutilizzabili27,28. La tecnica slipchip consente reazioni multiplexate senza il coinvolgimento di pompe o valvole integrate, e quindi user- e producer-friendly29,30. Tuttavia, questi sistemi devono affrontare una serie di ostacoli tecnici, come la conservazione di soluzioni nanoliter in micro pozzi, il controllo dell'umidità e le limitazioni delle tecnologie parallele di erogazione di liquidi a basso volume.
In questo articolo, abbiamo descritto un protocollo per esperimenti biomedici ad alta produttività utilizzando un sistema di imaging a cellule vive e un dispositivo microfluidico personalizzato. Le procedure di fabbricazione dei truciolo, tra cui litografia UV e morbida, e i parametri di configurazione per l'imaging fluorescente automatico sono dimostrati in dettaglio. I risultati mostrano che le caratteristiche funzionali avanzate (cioè la camera di coltura a 2 livelli e la pompa peristaltica potenziata) del chip microfluidico proposto sovraperforma i dispositivi precedentemente segnalati e soddisfano le esigenze di condurre migliaia di esperimenti paralleli. Abbiamo anche descritto i parametri cruciali (ad esempio, il mantenimento del mezzo condizionato) che si dovrebbero controllare attentamente per mantenere ambienti sani per la coltura delle cellule primarie e staminali.
Gli esperimenti biomedici basati su cellule, che includono protocolli complessi e l'aggiunta programmata di sostanze chimiche, sono spesso considerati dispendiosi in termini di tempo e laboriosi. Ad esempio, oltre alle procedure di manipolazione cellulare, gli input combinatori di 6 farmaci con riempimento orario richiedono almeno 250 passaggi di pipettaggio all'ora e ripetizione fino alla fine dell'esperimento. Inoltre, la modellazione dinamica delle condizioni ambientali in vivo richiede l'aggiunta tempestiva di una o più citochine, ligandi e farmaci con l'accuratezza dei secondi, il che è impossibile per le operazioni manuali. Qui dimostriamo che collegando le insenature del chip a più farmaci, o diverse concentrazioni di singoli segnali di ingresso, combinatorio, sequenziale e dinamicamente variabili possono essere generati e mantenuti negli ambienti cellulari senza taglio. Le risposte morfologiche e chimiche di cellule e tessuti, che vengono mantenute nelle camere di coltura parallele, possono quindi essere monitorate in tempo reale utilizzando il software di microscopio commerciale.
Con l'aumento della produttività dei dispositivi microfluidici e la raccolta automatizzata dei dati durante la bioimaging, il sistema di imaging delle cellule vive può generare migliaia di immagini ogni ora. Ad esempio, l'esecuzione continua del chip da 1500 unità per una settimana genera 252.000 immagini. Potrebbero essere necessario mesi per monitorare manualmente l'evoluzione dei tessuti e delle popolazioni cellulari (ad esempio, il livello di espressione delle biomolecole contrassegnate fluorescentmente) a livello di singola cellula. Utilizzando un programma MATLAB personalizzato, i dati massicci possono essere ordinati, formattati e analizzati automaticamente. Tracce che mostrano la mobilità, le caratteristiche morfologiche e il livello di espressione delle molecole di segnalazione possono essere recuperate (mostrate nel video), il che evita errori umani e consente di risparmiare una notevole quantità di tempo.
Pertanto, la metodologia che dimostriamo qui mostra protocolli adatti per eseguire esperimenti biomedici ad alta produttività con manipolazione automatizzata di cellule e tessuti, imaging fluorescente e analisi dei dati. La commutazione on-off delle valvole a membrana fornisce volume, tempo e risoluzione spaziale ottimali per ricostruire le condizioni ambientali in continua evoluzione e complesse per l'in vitro come un organ-on-chip. Anche se il protocollo è considerevolmente più complesso rispetto agli approcci biomedici transitori (ad esempio, procedure manuali che utilizzano piastre a 96 pozzo), il protocollo e la piattaforma presentati non si limitano agli studi sulle funzioni cellulari e tissutali. Lo screening dell'input combinatorio e sequenziale del farmaco può permetterci di sviluppare terapie per applicazioni cliniche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il supporto tecnico di Zhifeng Cheng di Chansn Instrument (China) LTD. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni (National Natural Science Foundation of China,51927804).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
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