Summary
Vi presenterer et mikrofluidisk system for studier med høy gjennomstrømning på komplekse livsmaskiner, som består av 1500 kulturenheter, en rekke forbedrede peristaltiske pumper og en blandingsmodul på stedet. Den mikrofluidiske brikken gjør det mulig å analysere de svært komplekse og dynamiske mikro-miljøforholdene in vivo.
Abstract
Etterligning av miljømessige forhold i vivo er avgjørende for in vitro-studier på komplekse livsmaskiner. Imidlertid er dagens teknikker rettet mot levende celler og organer enten svært dyre, som robotikk, eller mangler nanolitervolum og millisekunders tidsnøyaktighet i væskemanipulering. Vi presenterer heri design og fabrikasjon av et mikrofluidisk system, som består av 1500 kulturenheter, en rekke forbedrede peristaltiske pumper og en blandingsmodulus på stedet. For å demonstrere kapasiteten til den mikrofluidiske enheten opprettholdes nevrale stamceller (NSC) i det foreslåtte systemet. Vi observerte at når NSC-sfæren er utsatt for CXCL i dag 1 og EGF i dag 2, opprettholdes den rundformede konformasjonen godt. Variasjon i inngangsrekkefølgen til 6 legemidler forårsaker morfologiske endringer i NSC-sfæren og uttrykksnivårepresentantmarkøren for NSC-stemness (dvs. Hes5 og Dcx). Disse resultatene indikerer at dynamiske og komplekse miljøforhold har store effekter på NSC-differensiering og selvfornyelse, og den foreslåtte mikrofluidiske enheten er en egnet plattform for studier med høy gjennomstrømning på det komplekse livsmaskineriet.
Introduction
Høy gjennomstrømningsteknikker er avgjørende for biomedisinske og kliniske studier. Ved å parallelt gjennomføre millioner av kjemiske, genetiske eller levende celle- og organoidtester, kan forskere raskt identifisere gener som modulerer en biomolekylær vei, og tilpasse sekvensielle legemiddelinnganger til ens spesifikke behov. Robotikk1 og mikrofluidiske sjetonger i kombinasjon med et enhetskontrollprogram gjør det mulig å automatisere komplekse eksperimentelle prosedyrer som dekker celle/vev-manipulering, væskehåndtering, avbildning og databehandling/kontroll2,3. Derfor kan hundrevis og tusenvis av eksperimentelle forhold opprettholdes på en enkelt brikke, i henhold til ønsket gjennomstrømning4,5.
I denne protokollen beskrev vi design- og fabrikasjonsprosedyren til en mikrofluidisk enhet, som består av 1500 kulturenheter, en rekke forbedrede peristaltiske pumper og blandingsmodulus på stedet. Cellekulturkammeret på to nivåer forhindrer unødvendig skjær under mellombytte, noe som sikrer et uforstyrret kulturmiljø for langsiktig levende celleavbildning. Studiene viser at den foreslåtte mikrofluidiske enheten er en egnet plattform for studier med høy gjennomstrømning på det komplekse livsmaskineriet. Videre tillater de avanserte egenskapene til den mikrofluidiske brikken automatisert rekonstituering av svært komplekse og dynamiske mikromiljøforhold i vivo, som de stadig skiftende cytokiner og ligander komposisjoner6,7, hvis ferdigstillelse tar måneder for konvensjonelle plattformer som 96-brønns plate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikrofluidisk chips design
- Design den mikrofluidiske multiplekseren som består av 18 innløp, som hver styres av en individuell ventil og en peristaltisk pumpe. For å øke væskevolumet drevet av per pumpesyklus, be den peristaltiske pumpen bestå av 3 kontrollkanaler, som med vilje ble utvidet til 200 μm og 10 tilkoblede strømningslinjer.
- Design det skjærfrie kulturkammeret. Replikering av 2-nivå kulturenhet består av et lavere cellekulturkammer (400 μm x 400 μm x 150 μm) og et høyere bufferlag (400 μm x 400 μm x 75 μm), som forhindrer uønsket skjærspenning på celler under middels utveksling (Figur 1).
- Design funksjoner for høy gjennomstrømning. Dupliser kulturenheten for å danne et 30 x 50 matriseoppsett, som opptar et område på ca. 7 cm x 5 cm i størrelse.
2. Chip fabrikasjon og drift
- Fabrikasjon av replikastøping ved hjelp av UV-litografi
MERK: Replikastøpingen ble fremstilt på silisiumskive i henhold til standard fotolitografiprotokoll8.- Fabrikasjon av kanalstrukturene
- Spinnende fotoresist: Spin coat 5 ml su-8 3025 negativ fotoresist på en silisiumskive ved 500 rpm for 10 s og 3000 rpm i 30 s.
- Myk bake: Sett skiven på en kokeplate ved 65 °C i 2 minutter og deretter 95 °C i 10 minutter, Avkjøl den ned til romtemperatur.
- Justering og herding: Fest skiven og masken på holderen på justeringsenheten og slå på lyskilden i 18 s for å kurere den eksponerte fotoresisten.
- Pre post eksponering bake: Ramp opp skiven til 95°C ved 110°C/t fra romtemperatur og hold den minst 40 min til du tar den ut.
- Utvikle: Dypp skiven i utviklingsløsningen (SU-8-utvikler) og rør den i 2,5 min for å vaske av overflødig fotoresist og få den 25 μm høye kanalstrukturen.
- Hard bake: Dekk skiven med glass Petri tallerken og bake ved 65 °C i 2 min, og ramp deretter opp til 160 °C ved 120 °C/t og oppbevar den i 3 timer.
- Fabrikasjon av cellekulturkammeret med bufferlaget
- Bruk parametrene for trinn 2.1.1.1 til å spinne frakk 7 ml av SU-8 3075 negativ fotoresist på ovennevnte wafer.
- Myk bake (beskrevet i trinn 2.1.1.2) skiven og bytt masken slik at den stemmer godt overens med markørene på skiven. Slå deretter på lyskilden i 24 s for å kurere den eksponerte fotoresisten.
- Dypp skiven til utviklingsløsningen (SU-8-utvikler) og rør den i 4 minutter og 40 sekunder for å vaske av overflødig fotoresist og få en 75 μm høy lagstruktur som rundt den 25 μm høye kanalstrukturen som er fremstilt før. Hard bake (beskrevet i trinn 2.1.1.6) skiven for å gjøre den komplekse strukturen sterkere.
- Gjenta trinn 2.1.2.1-2.1.2.3 for å fremstille en 75 μm høy kammerstruktur som stabler på lagstrukturen.
- Fabrikasjon av ventilkonstruksjonene
- Bruke parameteren for trinn 2.1.1.1 til å spinne frakk 5 ml av AZ 50x positiv fotoresist på ovennevnte wafer.
- Myk bake (beskrevet i trinn 2.1.1.2) skiven og gjør masken godt justert med markører på skiven, og hold deretter lyskilden på i 20 s og av umiddelbart i 30 s. Gjenta lys på/ av-prosedyren i 5 sirkler for å kurere den eksponerte fotoresisten.
- Dypp skiven for å matche utvikleren og rør den i ca. 8 minutter for å vaske av overflødig fotoresist og få de rundformede ventilene som overlapper med kontrollkanalene for å sikre god tilkobling. Hard bake (beskrevet i trinn 2.1.1.6) den mønstrede skiven for å gjøre hele modellen sterkere.
- Fabrikasjon av kanalstrukturene
- Mikrofluidisk chipproduksjon ved hjelp av myk litografi
- Behandle de mønstrede og blanke silisiumskivene med rimethylchlorosilane i 15 min.
- Forbered 3 porsjoner PDMS gel (10: 1 av monomer / katalysatorforhold) tilsvarende 50 g strømningslag, henholdsvis 20 g kontrolllag 2 og 20 g membran.
- Kast 50 g PDMS gel på den mønstrede silisiumskiven, og gass dem i 1-2 timer i vakuumkammeret ved -0,85 MPa for å kopiere strømningslaget.
- Degas de 2 delene av 20 g PDMS og spinn den på den mønstrede skiven og en blank silisiumskive ved 2000-2800 rpm i 30 s for å forberede et kontrolllag og membranlag.
- Sett de PDMS-tildekkede skivene i ventilerende ovn i 60 min ved 80 °C for inkubasjon.
- Juster og bind de forskjellige lagene sammen gjennom tilpasset optisk enhet (zoom inn 100x) og plasma etsemaskin. Oppbevar den deretter i en ventilasjonsovn i 2 timer ved 80 °C for å forbedre bindingen av brikken.
- Stans innløpshullene på brikken, og lim den deretter på en PDMS-belagt deksleslip og herdet i minst 12 timer ved 80 °C før bruk.
- Spondrift
- Koble miniatyr pneumatiske magnetventiler til kontrolllaget på brikken, og åpne det tilpassede grafiske MATLAB-brukergrensesnittet8 for å koble til og kontrollere bryteren.
- Sett lukketrykket på push-up PDMS membranventiler til 25 psi.
- Lever dynamisk skiftende kombinatoriske/sekvensielle innganger til utpekte kamre (figur 2d) etter rettidig av-på-av-ventiler.
3. Generering av dynamiske innganger i cellulære mikromiljø
- Sponbehandling og cellelasting
- Opprettholde standard kulturforhold (37 °C, 5 % CO2) på mikroskopet i minst 5 timer.
- Fyll brikken med beleggmedium (dvs. nevnt i NOTE) og inkuber den under standard kulturforhold (beskrevet i trinn 3.1.1) i minst en time.
- Skyll brikken med fosfatbufret saltvann (PBS) eller cellekulturmedium (Dulbeccos Modified Eagles medium, DMEM) for å bygge et sunt kulturmiljø.
- Høst celler ved 80% samløp, og resuspend cellene ved hjelp av kulturmedier (DMEM) med en tetthet på ~ 106/ ml. Last deretter celler inn i brikken ved å trykke på den celleholdige løsningen.
MERK: Culturing forskjellige cellelinjer på chip krever tilsvarende belegg medium for å behandle cellekulturkammeret. Vanligvis, for eksperimenter på 3T3 fibroblast og tilhengerkultur av høne, er alle ventiler som kontrollerer kulturkamrene åpne, celler strømmer inn i alle kulturkamre innenfor samme kolonne.
- Oppsett for levende cellebilder med høy gjennomstrømning
MERK: For bildeanskaffelse ble det brukt et invertert mikroskop med et automatisert translasjonsstadium og et digitalt CMOS-kamera (Complementary Metal-Oxide Semiconductor). Scenen og bildeanskaffelsen ble kontrollert via den tilpassede programvaren.- Visualiser matrisen av kulturkamre ved hjelp av 10x objektiv linse i lyst felt for å bekrefte og definere stedskoordinatene til hvert kammer i 30 x 50 kammermatrisen.
- Transformer objektivet til 20x eller 40x, velg deretter posisjonskoordinatene til ønsket kammer, og oversettelsesstadiet flyttes til den tilordnede posisjonen etter bekreftelse. Finjuster x-, y-z-brennplanet for å få et optimalt bilde.
- Optimal lysintensitet, eksponeringstid og andre bildeparametere ble bestemt individuelt for hver kanal (dvs. lysfelt og fluorescensavbildning).
- Angi intervallet og varigheten for bildesyklusen, lagre banen og start deretter avbildningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den konvensjonelle peristaltiske pumpen på spon ble først beskrevet av Stephen Quake i 2000, hvorav peristaltikken ble aktivert av mønsteret 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. Tallet 0 og 1 angir "åpen" og "lukk" av de tre vannrette kontrolllinjene. Studier med mer enn 3 ventiler (f.eks. fem) er også rapportert11. Selv om den peristaltiske pumpen som består av 3 kontrolllinjer og 3 strømningslinjer gir nanoliternøyaktighet, er transporthastigheten for langsom til å mate 1500 kulturkamre. For å løse problemet inkluderer vi flere strømningslinjer (dvs. de 10 tilkoblede kanalene) for å øke væskevolumet drevet av per pumpesyklus (dvs. 101, 100, 110, 010, 011, 001). Dermed kan næringsstoffene og stoffene effektivt leveres til utpekte kamre. Den peristaltiske pumpen som transporteres flytende volum kan øke med 16x til ~ 50 nanoliters per pumpesyklus. Ettersom utvalget av peristaltiske pumper styres av 3 tilkoblede kontrollkanaler (figur 1b), leveres løsningene fra hvert innløp samtidig til brikken og tillater øyeblikkelig blanding. Kombinatoriske og sekvensielle innganger kan derfor genereres ved rettidig av-på-av-innløp koblet til forskjellige løsninger. Ved hjelp av samme metodikk kan dynamiske varierende cytokin- og ligandkonsentrasjoner også genereres. Utvalgte kombinasjoner av 1, 0,9, 0,2, 0,05, 0,01 g/l og 4 tomme kulturmedier kan for eksempel generere en sinusbølgesvingning (mellom 0 og 0,5 g/l) i konsentrasjon med trinnstørrelser fra 0,0005 til 0,01 g/l.
For primærcellens kultur er det avgjørende å opprettholde et stabilt mikromiljø. Skjærspenning og utmattelse av kondisjonert medium under middels utveksling vil påvirke cellulær oppførsel og celle skjebne12. For å løse disse problemene utformer vi et bufferlag for å forhindre uønsket skjærspenning på celler under middels utveksling (Figur 1c). I motsetning til de konvensjonelle kulturenhetene er de viktigste fordelene ved enheten (dvs. ventilkontrollert) deres evner til blanding, levering og vedlikehold av uavhengige forhold på stedet. I figur 2ddemonstrerte vi at et komplekst kinesisk ord kan opprettes på chip via presis levering av væsker til utpekte stillinger og vedlikehold av en upåvirket tilstand i individuelle kulturkamre. Egenskapene til den aktive fluidiske enheten i blanding på stedet er illustrert med et videoklipp som viser de dynamisk skiftende FITC-konsentrasjonene i et kulturkammer (Figur 3c og Video 7:47-7:50), som oppnås ved å kontrollere pumpehastigheten til 2 uavhengige peristaltiske pumper koblet til 2 innløp12. Numerisk simulering antyder at når mediet er rettet ovenfra og ned gjennom kulturkamrene, når skjærstrømmen raskt bunnen av kulturbrønnen (Video 4:07-4:25). Skjærkreftene kan effektivt forebygges når løsningen rettes fra venstre mot høyre. Selv med en inngangsstrømningshastighet på 10 mm/s forblir celle- eller mikrometervevet uforstyrret på bunnen av kulturenheten.
Som vist i figur 3b(1), er hvert innløp kontroll av en annen ventil enn den nedre peristaltiske pumpen. Når ett stoff er valgt for å bli levert i utpekte kamre, er innløpet knyttet til stoffet åpent og driften av matrisen av den peristaltiske pumpen transporterer bare dette stoffet. For 2 eller flere stoffer åpner vi bare de tilkoblede innløpene for å generere en blanding av legemidler med samme volum. Vi integrerer også en uavhengig peristatisk pumpe uavhengig av matrisen (Figur 2g), som kan operere med en annen pumpehastighet fra matrisen og derfor generere forskjellige fortynninger. For å etterligne in vivo NSC dynamiske miljøforhold, sekvensiell og kombinatorisk tilstand av 6 ligander (dvs. Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF), som består av 720 og 56 forskjellige forhold, ble generert ved hjelp av matrisen av peristaltiske pumper og levert til de utpekte kamrene. I detalj kan sekvensielle betingelser representeres som Sij = {ligand i legges til på dag j} og en kombinatorisk betingelse som Ci = {ligand i is present}, der ligand i = Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF og j=1,2,3,4,5,6. Svarene fra NSC-cellene og sfærene ble registrert annenhver time under kultur og stimulering.
NSC-sfærene opprettholdes i cellekulturkammeret på 400 μm med 400 μm (Figur 2e og figur 4). Differensiering og stemness (dvs. selvfornyelse) av stamcellene er representert av uttrykksnivået til henholdsvis Dcx og Hes5. Vi observerte at når NSC-sfæren er utsatt for CXCL i dag 1 og EGF i dag 2, er den rundformede konformasjonen godt vedlikeholdt og det er åpenbar økning i sfærestørrelsen. NSC-er med høytDcx-uttrykksnivå dør på3-rd-dagen når EGF erstattes av PACAP, noe som tyder på effekter på de differensierte cellene13,14,15,16. Celler begynner å feste seg til ubehandlet PDMS overflate ved stimulering av DLL på den fjerdedagen, og dissosieres i individuelle celler med tillegg av PDGF på den femtedagen og Jagged på densjette dagen. Endringer i inngangsrekkefølgen for disse 6 ligandene gir særpreget NSC-status (Figur 5). For eksempel varierer utvikleren av NSC-er dramatisk når CXCL bytter posisjon med PDGF langs sekvensen (Figur 5a og 5b). Disse resultatene viser at de dynamiske varierende miljøforholdene har store effekter på NSC-differensiering og selvfornyelse, noe som baner vei for å utvikle hjerne-på-chip-plattformer for biomedisinske studier så vel som kliniske applikasjoner.
Figur 1: Design av mikrofluidisk brikke med høy gjennomstrømning a. Den forbedrede peristaltiske pumpen består av flere strømningskanaler og utvidede kontrollkanaler, noe som fører til økning i det overførte væskevolumet per pumpesyklus. b. Utvalget av peristaltiske pumper styres av 3 tilkoblede kontrolllinjer. Derfor kan inkludering av forskjellige innløp på programmerte tidspunkter generere kombinatoriske, sekvensielle og dynamiske varierende inngangssignaler. c. For å forhindre uønsket skjærflyt designet vi en kulturenhet på to nivåer. Celler opprettholdes på bunnen av det nedre nivået, som er 150 μm i dybden. d. Hvert kulturkammer er koblet til 4 kanaler, slik at løsningen kan rettes gjennom ovenfra og ned og venstre-høyre retninger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fabrikasjon av mikrofluidisk brikke med høy gjennomstrømning a. Mikrostrukturer av kontroll- og strømningslag ble først mønstret på silisiumskive, hvor PDMS er støpt for replikering. b. Kontroll-, membran- og strømningslagene er justert og limt sammen ved hjelp av plasmaetsing og termisk binding. c-f. De avanserte egenskapene til brikken er demonstrert ved hjelp av grønne, blå og gule matfargestoffer. Vi viser at ved rettidig avslag på ventilene kan løsninger med nanoliternøyaktighet leveres til de utpekte kamrene. g. Matrisen av peristaltiske pumper styres av 3 tilkoblede kontrollinjeer (dvs. kontroll-1) og en uavhengig peristaltisk pumpe som styres av andre 3 kontrollinjeer (dvs. kontroll-2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Et skjema som viser den aktive fluidenheten. Et skjema som viser at cellene (a) flyter gjennom omgåelseskanalen. (b) ventiler styrer innløpet og den peristaltiske pumpen; og (c) celler strømmer inn i kulturkamrene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative bilder av NSC-sfæren når de stimuleres av sekvensielle legemiddelinnspill. Lyse felt (øverste rad), Hes5-GFP (andre rad), Dcx-Desred (tredje rad) bilder viser at ved sekvensiell stimulering forekommer betydelig celledød blant både Dcx-høyeog Hes5-høye celler. Fremveksten av det mørke området antyder død av stamceller, som lokaliserer for det meste i kjerneområdet. Skalalinje: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Variasjoner i NSC-sfærekonformasjon, Dcx- og Hes5-uttrykksnivå, når de stimuleres av forskjellige sekvensielle inndata. Det er demonstrert at variasjon i inngangsrekkefølgen til 6 legemidler forårsaker endringer i vev, morfologisk og uttrykksnivå av signalmolekyler, noe som indikerer følsomheten til NSC-sfæren til de dynamiske miljøforholdene. Inndatasekvensene: (a) DLL>> PACAP>> EGF>> CXCL>> PDGF>> Ujevn, (b) DLL>> PACAP >> EGF >> PDGF >> CXCL >> Ujevn, (c) DLL >> PACAP >> PDGF >> CXCL >> EGF >> Ujevn, (d) PDGF >> CXCL >> PACAP >> EGF >> DLL >> Jagged. Skalalinje: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ulike mikrofluidiske enheter er utviklet for å utføre multipleksede og komplekse eksperimenter17,18,19,20. Mikrowells laget av en rekke topologiske fordypninger kan for eksempel fange individuelle celler uten bruk av ekstern kraft, som viser fordelaktige tegn, inkludert liten prøvestørrelse, parallellisering, lavere materialkostnad, raskere respons, høy følsomhet21,22,23,24. Dråpe- og overflatespenning begrenset dråpe eliminerer behovet for hjelpemaskinvare som en mikropumpe, noe som gjør transport av dråper mer billig ogmiljøvennlig 25,26. Dråper væsker kan lett deponeres på overflaten av mikropipetter eller sprøytedyser, og etter forsøkene kan systemene oppdateres og gjenbrukes27,28. Slipchip-teknikken tillater multipleksede reaksjoner uten involvering av integrerte pumper eller ventiler, og derfor bruker- og produsentvennlig29,30. Imidlertid står disse systemene overfor en rekke tekniske hindringer, for eksempel lagring av nanoliterløsninger i mikrobrønner, kontrollere fuktighet og begrensninger i parallelle lavvolum væskeutleveringsteknologier.
I dette dokumentet beskrev vi en protokoll for biomedisinske eksperimenter med høy gjennomstrømning ved hjelp av levende celleavbildningssystem og en tilpasset mikrofluidisk enhet. Prosedyrene for chipfabrikasjon inkludert UV og myk litografi, og oppsettparametere for automatisk fluorescerende avbildning er demonstrert i detalj. Resultatene viser at de avanserte funksjonelle funksjonene (dvs. 2-nivå kulturkammer og forbedret peristaltisk pumpe) av den foreslåtte mikrofluidiske brikken overgår tidligere rapporterte enheter og oppfyller behovene for å gjennomføre tusenvis av parallelle eksperimenter. Vi beskrev også de avgjørende parametrene (f.eks. vedlikehold av kondisjonert medium) som man nøye bør kontrollere for å opprettholde sunne miljøer for kulturen i primær- og stamceller.
Cellebaserte biomedisinske eksperimenter, som inkluderer komplekse protokoller og programmert tilsetning av kjemikalier, anses ofte som tidkrevende og arbeidskrevende. For eksempel, i tillegg til cellemanipulasjonsprosedyrene, krever kombinatoriske innganger av 6 stoffer med timepåfylling minst 250 pipetteringstrinn per time, og repetisjon til slutten av eksperimentet. Videre krever modellering av dynamiske miljøforhold in vivo rettidig tilsetning av en eller flere cytokiner, ligander og legemidler med nøyaktigheten av sekunder, noe som er umulig for manuell drift. Vi viser heri at ved å koble brikkens innløp til flere stoffer, eller forskjellige konsentrasjoner av enkeltmedisin, kombinatoriske, sekvensielle og dynamisk varierende inngangssignaler, kan genereres og vedlikeholdes i de skjærfrie cellulære miljøene. De morfologiske og kjemiske responsene til celler og vev, som opprettholdes i de parallelt løpende kulturkamrene, kan deretter overvåkes i sanntid ved hjelp av den kommersielle mikroskopprogramvaren.
Med økende gjennomstrømning av mikrofluidiske enheter og automatisert datainnsamling under bioimaging, kan live celleavbildningssystemet generere tusenvis av bilder hver time. Kontinuerlig kjøring av brikken med 1500 enheter i én uke genererer for eksempel 252 000 bilder. Det kan ta måneder å spore utviklingen av vev og cellepopulasjoner manuelt (f.eks. uttrykksnivået til de fluorescerende merkede biomolekylene) på enkeltcellenivå. Ved hjelp av et tilpasset MATLAB-program kan de massive dataene automatisk sorteres, formateres og analyseres. Spor som viser mobilitet, morfologiske egenskaper og uttrykksnivå for signalmolekyler kan hentes (vist i videoen), som unngår menneskelig feil og sparer betydelig tid.
Derfor viser metodikken vi demonstrerer her egnede protokoller for å utføre biomedisinske eksperimenter med høy gjennomstrømning med automatisert celle- og vevsmanipulering, fluorescerende avbildning og dataanalyse. På-av-veksling av membranventiler gir optimal væskevolum, tid og romlig oppløsning for å rekonstruere de stadig skiftende og komplekse miljøforholdene for in vitro som en organ-on-chip. Selv om protokollen er betydelig mer kompleks sammenlignet med overgangsbiomedisinske tilnærminger (f.eks. manuelle prosedyrer ved hjelp av 96-brønnsplater), er den presenterte protokollen og plattformen ikke begrenset til studier på celle- og vevsfunksjoner. Screening av kombinatoriske og sekvensielle legemiddelinnspill kan tillate oss å utvikle terapier for kliniske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfattere anerkjenner teknisk støtte fra Zhifeng Cheng fra Chansn Instrument (China) LTD. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd (National Natural Science Foundation of China,51927804).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, International Society for Optics and Photonics. 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R.
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , Humana Press. Totowa, NJ. 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
