Summary
1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için mikroakışkan bir sistem sunuyoruz. Mikroakışkan çip, vivodaki son derece karmaşık ve dinamik mikro çevresel koşulların analizini sağlar.
Abstract
In vivo çevresel koşulları taklit etmek, karmaşık yaşam makineleri üzerindeki in vitro çalışmalar için çok önemlidir. Bununla birlikte, canlı hücreleri ve organları hedefleyen mevcut teknikler, robotik gibi oldukça pahalıdır veya sıvı manipülasyonunda nanolitre hacminden ve milisaniyelik zaman doğruluğuna sahip değildir. Burada, 1.500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan bir mikroakışkan sistemin tasarımını ve imalatını sunuyoruz. Mikroakışkan cihazın kapasitelerini göstermek için, önerilen sistemde nöral kök hücre (NSC) küreleri korunur. NSC küresi 1. günde CXCL'ye, 2. günde egf'ye maruz kaldığında yuvarlak şekilli uygunluğun iyi korunduğunu gözlemledik. 6 ilacın giriş sırasındaki değişim, NSC küresinde morfolojik değişikliklere ve NSC saplığı (örneğin, Hes5 ve Dcx) için ifade düzeyi temsili işaretleyicisine neden olur. Bu sonuçlar, dinamik ve karmaşık çevresel koşulların NSC farklılaşması ve kendini yenileme üzerinde büyük etkileri olduğunu ve önerilen mikroakışkan cihazın karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için uygun bir platform olduğunu göstermektedir.
Introduction
Biyomedikal ve klinik çalışmalar için yüksek verim teknikleri çok önemlidir. Araştırmacılar, milyonlarca kimyasal, genetik veya canlı hücre ve organoid testini paralel olarak gerçekleştirerek, biyo-moleküler bir yolu modüle eden genleri hızla tanımlayabilir ve sıralı ilaç girişini kişinin özel ihtiyaçlarına göre özelleştirebilir. Robotik1 ve mikroakışkan çipler bir cihaz kontrol programı ile birlikte hücre / doku manipülasyonu, sıvı işleme, görüntüleme ve veri işleme / kontrol2, 3kapsayan karmaşık deneysel prosedürlerin otomatikleştirilmesine izin verir. Bu nedenle, istenen aktarım hızına göre tek bir çip üzerinde yüzlerce ve binlerce deneysel koşul korunabilir4,5.
Bu protokolde, 1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan bir mikroakışkan cihazın tasarım ve imalat prosedürünü tanımladık. 2 seviyeli hücre kültürü odası, orta değişim sırasında gereksiz kesmeyi önler ve bu da uzun süreli canlı hücre görüntüleme için bozulmamış bir kültür ortamı sağlar. Çalışmalar, önerilen mikroakışkan cihazın karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için uygun bir platform olduğunu göstermektedir. Ayrıca, mikroakışkan çipin gelişmiş özellikleri, sürekli değişen sitokinler ve ligand kompozisyonları 6 ,7gibi son derece karmaşık vedinamik mikroçevrimsel koşulların otomatik olarak yeniden keşfedilmesine izin verir, tamamlanması 96 kuyu plakası gibi geleneksel platformlar için aylar sürer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikroakışkan çip tasarımı
- Her biri ayrı bir vana ve peristaltik pompa ile kontrol edilen 18 giriştan oluşan mikroakışkan çoklayıcıyı tasarlayın. Pompalama döngüsü başına tahrik edilen sıvı hacmini artırmak için, peristaltik pompanın bilerek 200 μm'ye genişletilen 3 kontrol kanalından ve 10 bağlı akış hattından oluşmasını sağlar.
- Makassız kültür odasını tasarlayın. 2 seviyeli kültür ünitesinin replikasyonu, orta değişim sırasında hücreler üzerinde istenmeyen kesme stresini önleyen bir alt hücre kültür odası (400 μm x 400 μm x 150 μm) ve daha yüksek bir tampon tabakası (400 μm x 400 μm x 75 μm) tarafından oluşturulur (Şekil 1).
- Yüksek verimli özellikler tasarlayin. Kültür birimini, yaklaşık 7 cm x 5 cm büyüklüğünde bir alanı kaplayan 30 x 50 matris düzeni oluşturmak için çoğaltın.
2. Çip imalatı ve çalışması
- UV litografisi kullanılarak replika kalıplama imalatı
NOT: Replika kalıplama, standart fotolithografi protokolü8'egöre silikon gofret üzerine imal edildi.- Kanal yapılarının imalatı
- Dönen fotoresist: 10 s için 500 rpm ve 30 s için 3000 rpm'de bir silikon gofret üzerinde SU-8 3025 negatif fotoresistin 5 mL'sini döndürün.
- Yumuşak fırın: Gofredi 2 dakika boyunca 65 °C'de bir ocak üzerine koyun ve ardından 10 dakika boyunca 95 °C, Oda sıcaklığına kadar soğutun.
- Hizalama ve kürleme: Gofreti ve maskeyi hizalayıcının tutucusuna sabitlayın ve açıkta kalan fotoresisti iyileştirmek için ışık kaynağını 18 s açın.
- Ön pozlama pişirme: Gofredi oda sıcaklığından 110°C/s'de 95°C'ye çıkarın ve çıkarılana kadar en az 40 dakika tutun.
- Geliştirin: Gofreti gelişmekte olan çözeltiye (SU-8 geliştiricisi) batırın ve gereksiz fotoresisti yıkamak ve 25 μm yüksekliğinde kanal yapısını elde etmek için 2,5 dakika ajite edin.
- Sert pişirme: Gofretleri cam Petri kabı ile örtün ve 2 dakika boyunca 65 °C'de pişirin, ardından 120 °C/ s'de 160 ° C'ye kadar rampalayın ve 3 saat saklayın.
- Hücre kültürü odasının tampon tabaka ile imalatı
- Yukarıdaki gofret üzerinde SU-8 3075 negatif fotoresistin 7 mL katını döndürmek için 2.1.1.1 adım parametrelerini kullanın.
- Gofreti yumuşak pişirin (adım 2.1.1.2'de açıklanmıştır) ve maskeyi gofret üzerindeki işaretleyicilerle iyi hizalamak için değiştirin. Sonra açıkta kalan fotoresisti iyileştirmek için 24 s için ışık kaynağını açın.
- Gofreti gelişmekte olan çözeltiye (SU-8 geliştiricisi) batırın ve gereksiz fotoresisti yıkamak ve daha önce üretilen 25 μm yüksekliğindeki kanal yapısının etrafında 75 μm yüksekliğinde bir katman yapısı elde etmek için 4 dakika 40 saniye boyunca çalkalayın. Karmaşık yapıyı daha güçlü hale getirmek için gofreti sert pişirin (adım 2.1.1.6'da açıklanmıştır).
- Katman yapısına yığılan 75 μm yüksekliğinde bir oda yapısı oluşturmak için 2.1.2.1-2.1.2.3 adımlarını yineleyin.
- Vana yapılarının imalatı
- Yukarıdaki gofret üzerinde AZ 50x pozitif fotoresistin 5 mL katını döndürmek için 2.1.1.1 adım parametresini kullanarak.
- Yumuşak pişirin (adım 2.1.1.2'de açıklanmıştır) gofreti pişirin ve maskeyi gofret üzerindeki işaretleyicilerle iyi hizalayın, ardından ışık kaynağını 20 s boyunca açık tutun ve 30 s için hemen kapatın. Açıkta kalan fotoresisti iyileştirmek için ışık yakma / kapatma prosedürünü 5 daire halinde tekrarlayın.
- Gofreti eşleşen geliştiriciye batırın ve gereksiz fotoresisti yıkamak ve iyi bağlantı sağlamak için kontrol kanallarıyla örtüşen yuvarlak şekilli vanaları almak için yaklaşık 8 dakika çalkalanın. Sert fırın (adım 2.1.1.6'da açıklanmıştır) tüm modeli daha güçlü hale getirmek için desenli gofret.
- Kanal yapılarının imalatı
- Yumuşak litografi kullanılarak mikroakışkan çip üretimi
- Desenli ve boş silikon gofretleri rimetilchlorosilane ile 15 dakika boyunca tedavi edin.
- Sırasıyla 50 g akış katmanına karşılık gelen 3 porsiyon PDMS jeli (10:1 monomer/katalizör oranı), 20 g kontrol katmanı 2 ve 20 g membran hazırlayın.
- Desenli silikon gofretin üzerine 50 g PDMS jeli dökun ve akış tabakasını kopyalamak için -0,85 MPa'daki vakum odasında 1-2 saat boyunca gazdan arındırın.
- 20 g PDMS'nin 2 kısmını degaslayın ve bir kontrol katmanı ve membran tabakası hazırlamak için 30 s için 2000-2800 rpm'de desenli gofret ve boş bir silikon gofret üzerinde döndürün.
- PDMS kaplı gofretleri inkübasyon için 80 °C'de 60 dakika havalandırma fırınına koyun.
- Özelleştirilmiş optik cihaz (100x yakınlaştırma) ve plazma gravür makinesi aracılığıyla farklı katmanları hizalayın ve birbirine bağlayın. Daha sonra talaşın bağlanmasını artırmak için 80 ° C'de 2 saat havalandırma fırınında saklayın.
- Çip üzerindeki giriş deliklerini delin ve ardından PDMS kaplı bir kapakçığa yapıştırın ve kullanmadan önce 80 °C'de en az 12 saat kürleyin.
- Talaş işlemi
- Minyatür pnömatik solenoid vanaları çipin kontrol katmanına bağlayın ve anahtarı bağlamak ve kontrol etmek için özelleştirilmiş MATLAB grafik kullanıcı arayüzü8'i açın.
- Şınav PDMS membran vanalarının kapatma basınçlarını 25 psi olarak ayarlayın.
- Vanaları zamanında açarak, dinamik olarak değişen kombinatoryal/sıralı girişleri belirlenen bölmelere(Şekil 2d)sunun.
3. Hücresel mikroçevricilerde dinamik girişlerin üretilmesi
- Talaş tedavisi ve hücre yüklemesi
- Mikroskopta standart kültür koşullarını (%37 °C,%5 CO 2)en az 5 saat koruyun.
- Çipi kaplama ortamıyla doldurun (örneğin, NOT'ta belirtilen) ve standart kültür koşullarında (adım 3.1.1'de açıklanan) en az bir saat kuluçkaya yatırın.
- Sağlıklı bir kültür ortamı oluşturmak için çipi fosfat tamponlu salin (PBS) veya hücre kültürü ortamı (Dulbecco's Modified Eagle's medium, DMEM) ile yıkayın.
- Hücreleri %80 izdiahta toplar ve ~ 106/mL yoğunlukta kültür ortamı (DMEM) kullanarak hücreleri yeniden biriktirin. Daha sonra hücre içeren çözeltiye baskı yaparak hücreleri çipe yükleyin.
NOT: Talaş üzerinde farklı hücre hatlarının kült örültürlüğü, hücre kültürü odasını tedavi etmek için ilgili kaplama ortamını gerektirir. Tipik olarak, 3T3 fibroblast ve bağlı hen kültürü üzerine yapılan deneyler için kültür odalarını kontrol eden tüm vanalar açıktır, hücreler aynı sütundaki tüm kültür odalarına akar.
- Yüksek verimli canlı hücre görüntüleme kurulumu
NOT: Görüntü alımı için, otomatik çeviri aşamasına sahip ters bir mikroskop ve dijital tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) kamera kullanılmıştır. Sahne ve görüntü alımı özelleştirilmiş yazılım aracılığıyla kontrol edildi.- 30'a 50 oda matrisinin her odasının konum koordinatlarını onaylamak ve tanımlamak için parlak alanda 10x objektif lens kullanarak kültür odalarının matrisini görselleştirin.
- Objektif lensi 20x veya 40x'e dönüştürün, ardından istediğiniz odanın konum koordinatlarını seçin ve çeviri aşaması onaydan sonra atanan konuma taşınır. En iyi görüntüyü elde etmek için x, y, z odak düzlemine ince ayar yapın.
- Her kanal için en uygun ışık yoğunluğu, maruziyet süresi ve diğer görüntülenmiş parametreler ayrı ayrı belirlendi (örneğin, parlak alan ve floresan görüntüleme).
- Görüntüleme döngüsünün aralığını ve süresini ayarlayın, yolu kaydedin ve görüntülemeye başlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geleneksel çipli peristaltik pompa ilk olarak Stephen Quake tarafından 2000 yılında tanımlanmıştır, peristalsis 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10deseni ile çalıştırıldı. 0 ve 1 sayısı, 3 yatay kontrol hattının "açık" ve "kapanış" olduğunu gösterir. 3'ten fazla vana (örneğin, beş) kullanılarak yapılan çalışmalar dabildirilmiştir 11. 3 kontrol hattı ve 3 akış hattından oluşan peristaltik pompa nanoliter doğruluğu sağlasa da, taşıma oranı 1.500 kültür odasını beslemek için çok yavaştır. Sorunu çözmek için, pompalama döngüsü başına tahrik edilen sıvı hacmini artırmak için daha fazla akış hattı (yani 10 bağlı kanal) (örneğin, 101, 100, 110, 010, 011, 001) dahil ediyoruz. Böylece, besinler ve ilaçlar belirlenen odalara etkili bir şekilde teslim edilebilir. Peristaltik pompa taşınan sıvı hacmi, pompalama döngüsü başına 16x ila ~ 50 nanolitre artabilir. Peristaltik pompalar dizisi 3 bağlı kontrol kanalı (Şekil 1b)ile kontrol edildiği için, her girişten gelen çözeltiler çipe aynı anda teslim edilir ve anında karıştırmaya izin verir. Kombinatoryal ve sıralı girişler, bu nedenle, farklı çözümlere bağlı girişlerin zamanında açık-kapalı olmasıyla oluşturulabilir. Aynı metodoloji kullanılarak, dinamik değişen sitokin ve ligand konsantrasyonları da üretilebilir. Örneğin, seçilen 1, 0,9, 0,2, 0,05, 0,01 g/L ve 4 boş kültür ortamı bir sinüs dalgası dalgalanması (0 ile 0,5 g/L arasında) oluşturabilir ve adım boyutları 0,0005 ile 0,01 g/L arasında olabilir.
Birincil hücrelerin kültürü için, istikrarlı bir mikroçevrim sağlamak çok önemlidir. Kesme stresi ve orta değişim sırasında koşullandırılmış ortamın tükenmesi hücresel davranışı ve hücre kaderini etkileyecektir12. Bu sorunların üstesinden gelmek için, orta değişim sırasında hücreler üzerinde istenmeyen kesme stresini önlemek için bir tampon katmanı tasarlıyoruz (Şekil 1c). Geleneksel kültür birimlerinin aksine, cihazın ana avantajları (yani valf kontrollü) bağımsız koşulların yerinde karıştırılması, teslimi ve bakımı yetenekleridir. Şekil 2d'de, sıvıların belirlenen pozisyonlara hassas bir şekilde teslim edilmesi ve bireysel kültür odalarında etkilenmemiş bir durumun sürdürülmesi yoluyla çip üzerinde karmaşık bir Çince kelime oluşturulabileceğini gösterdik. Aktif akışkan cihazın yerinde karıştırmadaki yetenekleri, bir kültür odasında dinamik olarak değişen FITC konsantrasyonlarını gösteren bir video kliple gösterilmiştir(Şekil 3c ve Video 7:47-7:50), 2 girişe bağlı 2 bağımsız peristaltik pompanın pompalama oranı kontrol ederekgerçekleştirilir 12. Sayısal simülasyon, ortam kültür odalarından yukarı-aşağı yönlendirildiğinde, kesme akışının hızla kültürün dibine ulaştığını göstermektedir (Video 4:07-4:25). Çözelti soldan sağa yönlendirildiğinde kesme kuvvetleri etkili bir şekilde önlenebilir. 10 mm/s giriş debisinde bile, hücre veya mikrometre büyüklüğündeki doku kültür ünitesinin alt kısmında bozulmadan kalır.
Şekil 3b'de(1) gösterildiği gibi, her giriş alt peristaltik pompa dışındaki bir valf tarafından kontrol edilir. Belirlenen odalara teslim edilecek bir ilaç seçildiğinde, ilaca bağlı giriş açıktır ve peristaltik pompa dizisinin çalışması sadece bu ilacı taşır. 2 veya birden fazla ilaç için, eşit hacimde bir ilaç karışımı oluşturmak için bağlı girişleri açıyoruz. Ayrıca diziden bağımsız bağımsız bir peristatik pompa entegre ediyoruz (Şekil 2g), diziden farklı bir pompalama hızında çalışabilir ve bu nedenle farklı seyreltmeler üretebilir. In vivo NSC dinamik çevre koşullarını taklit etmek için, 720 ve 56 farklı koşuldan oluşan 6 ligandın (örneğin, Pürüzlü, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF)sıralı ve kombinatoryal durumu peristaltik pompalar dizisi kullanılarak üretilerek belirlenen odalara teslim edilmiştir. Ayrıntılı olarak, sıralı koşullar Sij = {ligand i j} gününe eklenir veC i = {ligand i mevcut} olarak bir kombinatoryal koşul olarak gösterilebilir, burada ligand i = Pürüzlü, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF ve j=1,2,3,4,5,6. NSC hücrelerinin ve kürelerinin yanıtları kültür ve stimülasyon sırasında her 2 saatte bir kaydedildi.
NSC küreleri 400 μm hücre kültür odası(Şekil 2e ve Şekil4) ile 400 μm'de tutulur. Kök hücrelerin farklılaşması ve saplanması (yani kendini yenilemesi) sırasıyla Dcx ve Hes5 ekspresyon düzeyi ile temsil edilir. NSC küresinin 1. günde CXCL'ye, 2. günde ise EGF'ye maruz kaldığında yuvarlak şekilli uygunluğun iyi korunduğunu ve küre boyutunda belirgin bir artış olduğunu gözlemledik. YüksekDcx ekspresyon seviyesine sahip NSC'ler, EGF'nin PACAP ile değiştirildiği 3rd günde ölür, bu da farklılaştırılmış hücreler13 , 14,15,16üzerinde etkiler olduğunu düşündürür. Hücreler, 4. günde DLL tarafından uyarılma üzerine işlenmemiş PDMS yüzeyine bağlanmaya başlar ve5. günde PDGF ve 6. gündePürüzlü eklenmesiyle tek tek hücrelere ayrılır. Bu 6 ligandın giriş sırasındaki değişiklikler ayırt edici NSC durumu getirir (Şekil 5). Örneğin, CXCL sıra boyunca PDGF ile pozisyon değiştirdiğinde NSC'lerin evrimi önemli ölçüde değişir (Şekil 5a ve 5b). Bu sonuçlar, dinamik değişen çevresel koşulların NSC farklılaşması ve kendini yenileme üzerinde büyük etkileri olduğunu göstermektedir, bu da biyomedikal çalışmaların yanı sıra klinik uygulamalar için çip üzerinde beyin platformları geliştirmenin yolunu açmaktadır.
Şekil 1: Yüksek verimli mikroakışkan çipin tasarımı. Geliştirilmiş peristaltik pompa, birden fazla akış kanalından ve genişlemiş kontrol kanallarından oluşur ve bu da pompalama döngüsü başına aktarılan sıvı hacminde artışa yol açar. b. Peristaltik pompalar dizisi 3 bağlı kontrol hattı ile kontrol edilir. Bu nedenle, programlanmış zaman noktalarına farklı girişlerin dahil edilmesi kombinatoryal, sıralı ve dinamik değişen giriş sinyalleri oluşturabilir. c. İstenmeyen kesme akışını önlemek için 2 seviyeli bir kültür ünitesi tasarladık. Hücreler, 150 μm derinliğinde olan alt seviyenin dibinde tutulur. d. Her kültür odası 4 kanala bağlanarak çözümün yukarıdan aşağıya ve sol-sağ yönlere yönlendirilmesini sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yüksek verimli mikroakışkan çipin imalatı. Kontrol ve akış katmanlarının mikroyapıları öncelikle PDMS'nin çoğaltma için atıldığı silikon gofret üzerine desenlenmiştir. b. Kontrol, membran ve akış katmanları plazma gravür ve termal yapıştırma kullanılarak hizalanır ve birbirine bağlanır. c-f. Çipin gelişmiş özellikleri yeşil, mavi ve sarı gıda boyaları kullanılarak gösterilmiştir. Vanaların zamanında devre dışı bırakılarak nanoliter doğruluk çözümlerinin belirlenen odalara teslim edilebileceğini gösteriyoruz. g. Peristaltik pompalar dizisi 3 bağlı kontrol hattı (örneğin, Kontrol-1) ve diğer 3 kontrol hattı (kontrol-2) tarafından kontrol edilen bağımsız bir peristaltik pompa ile kontrol edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Aktif akışkan cihazı gösteren bir şema. ( a ) hücrelerinin atlama kanalından aktığını gösterenbirşema; (b) vanalar girişi ve peristaltik pompayı kontrol eder; ve (c) hücreler kültür odalarına akar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ardışık ilaç girişi ile uyarılırken NSC küresinin temsili görüntüleri. Parlak alan (üst sıra), Hes5-GFP (ikinci sıra), Dcx-Desred (üçüncü sıra) görüntüleri, sıralı uyarılma üzerine, hem Dcx-yüksek hem de Hes5-yüksek hücreler arasında önemli hücre ölümünün meydana geldiğini göstermektedir. Karanlık bölgenin ortaya çıkması, çoğunlukla çekirdek bölgede lokalize olan kök hücrelerin ölümünü göstermektedir. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Farklı sıralı girişler tarafından uyarılırken NSC küre konformasyonu, Dcx ve Hes5 ekspresyon seviyesindeki varyasyonlar. 6 ilacın giriş sırasındaki varyasyonun, sinyal moleküllerinin doku, morfolojik ve ekspresyon seviyesinde değişikliklere neden olduğu ve NSC küresinin dinamik çevresel koşullara hassasiyetlerini gösterdiği gösterilmiştir. Giriş sıraları: (a) DLL>> PACAP>> EGF>> CXCL>> PDGF>> Pürüzlü, (b) DLL>> PACAP >> EGF >> PDGF >> CXCL >> Pürüzlü, (c) DLL >> PACAP >> PDGF >> CXCL >> EGF >> Pürüzlü, (d) PDGF >> CXCL >> PACAP >> EGF >> DLL >> Pürüzlü. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çoklayıcı ve karmaşık deneyler yapmak için çeşitli mikroakışkan cihazlar geliştirilmiştir17,18,19,20. Örneğin, bir dizi topolojik girintiden yapılmış mikrowelller, küçük örnek boyutu, paralelleştirme, daha düşük malzeme maliyeti, daha hızlı yanıt, yüksek hassasiyet 21 , 22,23,24dahil olmak üzere avantajlı karakterler göstererek dış güç kullanmadan tek tek hücreleri hapsedebilir. Damlacık ve yüzey gerilimi sınırlı damlacık, mikropump gibi yardımcı donanım ihtiyacını ortadan kaldırarak damlacıkların nakliyesini daha düşük maliyetli ve çevre dostu hale getirir25,26. Sıvı damlaları mikropipettes veya püskürtücü nozülleri ile yüzeye kolayca biriktirilebilir ve deneylerden sonra sistemler facilely yenilenebilir ve yeniden kullanılabilir27,28. Slipchip tekniği, entegre pompaların veya vanaların katılımı olmadan çok katlı reaksiyonlara izin verir ve bu nedenle kullanıcı ve üretici dostu29,30. Bununla birlikte, bu sistemler nanoliter çözümlerini mikro kuyularda depolamak, nemi kontrol etmek ve paralel düşük hacimli sıvı dağıtım teknolojilerinin sınırlamaları gibi bir dizi teknik engelle karşı karşıyadır.
Bu yazıda, canlı hücre görüntüleme sistemi ve özelleştirilmiş bir mikroakışkan cihaz kullanarak yüksek verimli biyomedikal deneyler için bir protokol tanımladık. UV ve yumuşak litografi dahil olmak üzere talaş imalatı prosedürleri ve otomatik floresan görüntüleme için kurulum parametreleri ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Sonuçlar, önerilen mikroakışkan çipin gelişmiş fonksiyonel özelliklerinin (yani 2 seviyeli kültür odası ve gelişmiş peristaltik pompanın) daha önce bildirilen cihazları geride bıraktığından ve binlerce paralel deney yapma ihtiyacını karşıladığını göstermektedir. Ayrıca, birincil ve kök hücre kültürü için sağlıklı ortamları korumak için dikkatlice kontrol edilmesi gereken önemli parametreleri (örneğin, şartlandırılmış ortamın bakımı) tanımladık.
Karmaşık protokoller ve kimyasalların programlanmış eklenmesini içeren hücre bazlı biyomedikal deneyler genellikle zaman alıcı ve zahmetli olarak kabul edilir. Örneğin, hücre manipülasyon prosedürlerinin yanı sıra, saatlik dolumlu 6 ilacın kombinatoryal girişleri saatte en az 250 pipetleme adımı ve deneyin sonuna kadar tekrar gerektirir. Ayrıca, in vivo dinamik çevresel koşulları modellemek, manuel işlemler için imkansız olan saniyeler boyunca bir veya birden fazla sitokin, ligand ve ilacın zamanında eklenmesini gerektirir. Burada, çipin girişlerini birden fazla ilaca bağlayarak veya farklı konsantrasyonlarda tek ilaç, kombinatoryal, sıralı ve dinamik olarak değişen giriş sinyallerinin kesmesiz hücresel ortamlarda üretilebileceğini ve sürdürülebileceğini gösteriyoruz. Paralel olarak çalışan kültür odalarında tutulan hücre ve dokuların morfolojik ve kimyasal tepkileri daha sonra ticari mikroskop yazılımı kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlenebilir.
Biyogörüntleme sırasında mikroakışkan cihazların verimi ve otomatik veri toplamanın artmasıyla, canlı hücre görüntüleme sistemi her saat binlerce görüntü üretebilir. Örneğin, 1500 birimlik yonganın bir hafta boyunca sürekli çalıştırarak 252.000 görüntü üretir. Dokuların ve hücre popülasyonlarının evrimini (örneğin, floresan etiketli biyomoleküllerin ekspresyon seviyesi) tek hücre düzeyinde manuel olarak izlemek aylar sürebilir. Özelleştirilmiş bir MATLAB programı kullanarak, büyük veriler otomatik olarak sıralanabilir, biçimlendirilebilir ve analiz edilebilir. Sinyal moleküllerinin hareketliliğini, morfolojik özelliklerini ve ifade düzeyini gösteren izler alınabilir (videoda gösterilir), bu da insan hatasını önler ve önemli miktarda zaman kazandırır.
Bu nedenle, burada gösterdiğimiz metodoloji, otomatik hücre ve doku manipülasyonu, floresan görüntüleme ve veri analizi ile yüksek verimli biyomedikal deneyler yapmak için uygun protokolleri göstermektedir. Membran vanaların açma-kapama, çip üzerindeki bir organ gibi in vitro için sürekli değişen ve karmaşık çevresel koşulları yeniden oluşturmak için optimum sıvı hacmi, zaman ve mekansal çözünürlük sağlar. Protokol, geçiş biyomedikal yaklaşımlarına (örneğin, 96 kuyu plakaları kullanılarak manuel prosedürler) kıyasla oldukça karmaşık olsa da, sunulan protokol ve platform hücre ve doku fonksiyonları ile ilgili çalışmalarla sınırlı değildir. Kombinatoryal ve sıralı ilaç girişinin taranmasının klinik uygulamalar için tedaviler geliştirmemize olanak sağlaması sağlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Chansn Instrument (Çin) LTD'den Zhifeng Cheng'in teknik desteğini kabul ediyor. Bu çalışma hibelerle desteklendi (Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı,51927804).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, International Society for Optics and Photonics. 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , Humana Press. Totowa, NJ. 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
