Abstract
Endotel, anjiyogenez, hemostaz, inflamasyon ve homeostaz gibi birçok fizyolojik fonksiyonda önemli rol oynayan dinamik entegre bir yapıdır. Endotel ayrıca ateroskleroz, hipertansiyon ve diyabet gibi patofizyolojilerde de önemli bir rol oynamaktadır. Endotel hücreleri kan ve lenfatik damarların iç astarını oluşturur ve yapı ve fonksiyonda heterojenlik gösterir. Çeşitli gruplar, hematopoetik kök hücrelerden veya olgun kan büyümesi endotel hücrelerinden (veya endotel kolonisi oluşturan hücrelerden) türetilen endotel progenitör hücrelerine odaklanarak insan periferik kanından türetilen endotel hücrelerinin işlevselliğini değerlendirmiştir. Bu hücreler tedavi ve hastalık modellemesi için otolog bir kaynak sağlar. Ksenojenik hücreler, benzer koşullarda yetiştirilen genetik olarak benzer hayvanların kullanılmasıyla elde edilen kullanılabilirlikleri ve homojenlikleri nedeniyle alternatif bir terapötik kaynak sağlayabilir. Bu nedenle, domuz periferik kanından yüksek proliferatif kan büyümesi endotel hücrelerinin izolasyonu ve genişlemesi için sağlam bir protokol sunulmuştur. Bu hücreler, ksenotransplantasyonda inflamatuar ve pıhtılaşma yanıtlarını araştırmak için kardiyovasküler doku mühendisliği, hücre tedavisi, hastalık modelleme, ilaç taraması, endotel hücre biyolojisinin incelenmesi ve in vitro ko-kültürler gibi sayısız uygulama için kullanılabilir.
Introduction
Endotel oldukça karmaşık, dinamik bir yapıdır ve vasküler duvarın hayati bir bileşenidir. Dolaşımdaki kan ve çevresindeki dokular arasında fiziksel bir arayüz sağlamak için kan damarlarının iç yüzeyini hizalar. Bu heterojen yapının anjiyogenez, inflamasyon, vazoregülasyon ve hemostaz gibi çeşitli işlevleri yerine getirdiği bilinmektedir 1,2,3,4. İnsan göbek damarı endotel hücreleri, endotel hücrelerinin işlevselliğini değerlendirmek için yaygın olarak çalışılan bir hücre tipidir. Bununla birlikte, hastaya özgü parti değişkenliği, tutarsız fenotip ve minimum ayrılma verimliliği, tüm bu özellikleri geliştirebilecek bir hücre kaynağının belirlenmesi ihtiyacını ortaya koymaktadır5.
Primer endotel hücrelerinin homojen bir popülasyonunu elde etmek teknik olarak zor olabilir ve primer endotel hücreleri yüksek proliferatif kapasiteye sahip değildir6. Bu nedenle, vasküler rejenerasyonu incelemek ve patofizyolojik süreçleri değerlendirmek için, çeşitli gruplar periferik kandan türetilen farklı endotel hücreleri tiplerini elde etmeye ve değerlendirmeye çalışmışlardır, örneğin endotel progenitör hücreleri (EPC'ler) veya kan büyümesi endotel hücreleri (BOEC'ler)6,7,8,9 . İğ şeklindeki erken EPC'ler hematopoetik kök hücrelerden (HSC'ler) kaynaklanır ve olgun endotel hücreleri üretmek için sınırlı büyüme potansiyeline ve sınırlı anjiyojenik yeteneğe sahiptir. Ayrıca, enflamatuar monositlere çok benzerler. Ek olarak, işlevsel, çoğalan, olgun endotel hücrelerine daha da farklılaşma kapasiteleri hala tartışmalıdır 6,7,9,10. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) sürekli kültürü, geç büyüme EPC'leri, BOEC'ler veya endotel kolonisi oluşturan hücreler (ECFC'ler) olarak bilinen ikincil bir hücre popülasyonuna yol açabilir6,7,9,10. Medina ve ark. 2018'de, EPC'lerin sınırlamalarını, isimlendirmelerinin belirsizliğini ve EPC'ler11 altında sürekli olarak gruplandırılmış birçok farklı hücre tipiyle genel bir uyum eksikliğini kabul etmiştir. Buna karşılık, BOEC'ler vasküler onarım, sağlık ve hastalık ve hücre tedavisindeki rolleri ile tanınmıştır. Bu hücrelerin daha fazla araştırılması ve terapötik kullanımı, bu hücre tiplerini dolaşımdaki progenitör hücrelerden tutarlı bir şekilde türetmek için protokollere dayanacaktır.
BOEC'ler gibi primer hücreler, yüksek proliferatif olgun endotel hücreleri elde etmek için bir vekil olarak kullanılabilir6. BOEC'ler fenotipik olarak erken EPC'lerden farklıdır ve parke taşı morfolojisi ve aderens kavşaklarının ve kaveoların ekspresyonu gibi tipik endotel özellikleri sergiler12. Hebbel ve ark.13,14,15 tarafından yapılan gen profillemesi, BOEC'lerin veya ECFC'lerin mikrovasküler ve büyük damar oluşumunu teşvik ettikleri için gerçek endotel hücreleri olduğunu bulmuştur. Bu nedenle, BOEC'ler patofizyolojik süreçleri ve genetik çeşitliliği değerlendirmek için bir araç olarak kullanılabilir16. Ayrıca vasküler rejenerasyon için hücre tedavisi için mükemmel bir hücre kaynağı olarak kabul edilirler17. Bu nedenle, bu yüksek proliferatif hücreleri tutarlı bir şekilde türetmek için standartlaştırılmış bir protokol gereklidir.
BOEC'ler insan patofizyolojik ve genetik varyasyonunu incelemek için güçlü bir araç sağlarken, daha homojen bir BOEC kaynağı daha sağlam ve güvenilir deneysel ve terapötik sonuçlar sağlayabilir. Üstün homojenlik, benzer koşullarda yetiştirilen genetik olarak benzer hayvanlardan elde edilen ksenojenik hücre kaynakları kullanılarak elde edilebilir18. Ksenojenik hücre kaynakları konakçı immün yanıtını ortaya çıkarmaya eğilimli olsa da, immünomodülasyon stratejileri, hücreler de dahil olmak üzere immünouyumlu hayvanlar ve hayvansal ürünler üretmek amacıyla geliştirilmektedir. Özellikle domuzlar, bol miktarda periferik kan kaynağıdır ve insanlarla anatomik ve fizyolojik benzerlikler nedeniyle tıbbi cihazları ve diğer terapileri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Bu nedenle, bu çalışma, domuz periferik kanından yüksek proliferatif BOEC'lerin izolasyonu ve genişlemesi için protokolü rafine etmektedir. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan protokol, nispeten küçük bir kan hacminden çok sayıda BOEC elde etmek için basit ve güvenilir bir yöntemdir. Kültürler, tek bir kan örneğinden milyonlarca hücre üretmek için birkaç pasajla genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları, Wisconsin Tıp Fakültesi ve Mayo Clinic'teki ilgili Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Bu çalışmada Yorkshire/Landrace/Duroc çapraz evcil domuzları (Sus domesticus), 40-80 kg, 3-6 aylık erkek ve dişi kullanılmıştır.
1. Domuz periferik kanının toplanması
- Malzemeleri hazırlayın.
- Heparin çözeltisini steril salin içinde 100 U/mL'ye seyreltin.
- İki adet 50 mL konik tüpün ve iki adet 60 mL şırınganın her birine 3-4 mL heparin çözeltisi ekleyin.
- Seyreltilmemiş heparin çözeltisini (1.000 U/mL) bir uzatma tüpüne çekin.
- Heparin dolgulu uzatma tüpünün bir ucuna 19 G'lık bir iğne ve diğer ucuna heparin içeren 60 mL'lik bir şırınga bağlayın.
- Bir domuzu Kurumsal politikalara göre uyuşturmak
- Anesteziyi indüklemek için IM atropin (0.05 mg / kg), tiletamin / zolazepam (2-5 mg / kg) ve ksilazin (2 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın.
NOT: Hayvan bilinçsiz olduğunda ve mandibuler kaslar sert olmadığında yeterli anestezi sağlanır. - Hayvanı sırtüstü pozisyonda koyun ve stabilite sağlamak için her iki tarafa da yuvarlanmış havlular yerleştirin.
- Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik bir merhem sürün.
- Anestezi sırasında battaniyeler, ısıtma pedleri ve / veya ısıtmalı prosedür masası dahil olmak üzere termal destek sağlayın.
- Anesteziyi indüklemek için IM atropin (0.05 mg / kg), tiletamin / zolazepam (2-5 mg / kg) ve ksilazin (2 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın.
- Femoral kasık bölgesini betadin ovma çözeltisi ile temizleyin.
- Femoral veni veya arteri 19 G iğne ile delin ve yavaşça (~ 1-2 mL / s) şırıngaya 50 mL kan çekin.
NOT: Çok hızlı çizim yapmak hücrelere zarar verebilir. - İğneyi yerinde bırakarak, hemen uzatma tüpünü bükün ve 60 mL şırınganın bağlantısını kesin
- Kanı yavaşça heparin içeren 50 mL konik bir tüpe aktarın.
- 50 mL konik tüpü sıkıca kapatın, karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin ve buzun üzerine yerleştirin.
- Kalan heparin içeren 60 mL şırıngayı uzatma tüpüne bağlayın, uzatma tüpünü açın ve yavaşça şırıngaya 50 mL daha kan çekin.
- İğneyi derhal arterden veya damardan çıkarın ve kalan kanı uzatma tüpünden yavaşça şırıngaya çekin.
- 60 mL şırıngayı uzatma tüpünden ayırın ve kanı yavaşça kalan heparin içeren 50 mL konik tüpe aktarın.
- 50 mL konik tüpü sıkıca kapatın, karıştırmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin ve buzun üzerine yerleştirin.
- Domuzun femoral kasık bölgesine basınç hemostazı uygulayın.
- Domuzu Kurumsal politikalara göre kurtarın. Sternal yatmayı sürdürmek ve düzenli konut / köpek kulübesi alanına geri dönmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı sürekli izleyin.
2. Mononükleer hücrelerin izolasyonu
- Kanı 1: 1 oranında fosfat tamponlu salin (PBS) ile dört adet 50 mL konik tüpte seyreltin.
NOT: Bu çalışmanın, hücre kültürünün kirlenmesini önlemek için aseptik bir teknik kullanılarak bir hücre kültürü başlığında yapılması gerekir. - Sekiz adet 50 mL konik tüpe 25 mL oda sıcaklığında kullanıma hazır yoğunluk gradyanı çözeltisi ekleyin.
- Çok yavaş pipet, tüpü pipet ucuna keskin bir açıyla tutarak 50 mL konik tüp içeren her yoğunluk gradyanı çözeltisinin iç kısmı boyunca 25 mL kan/salin çözeltisi haline getirin.
NOT: Kan çözeltisi, yoğunluk gradyanı çözeltisinin üzerine nazikçe katman oluşturmalı ve iyi tanımlanmış bir arayüz sağlamalıdır. - Tüpleri 560 x g ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca santrifüjleyin.
NOT: En iyi sonuçlar için, mümkünse santrifüj frenini devre dışı bırakın. - Her tüpten buffy kaplamayı (yoğunluk gradyanı çözeltisinin üstünde ve berrak plazmanın altında bulunan mononükleer hücrelerin bulutlu tabakası) dikkatlice toplamak ve iki yeni 50 mL konik tüpe eşit olarak dağıtmak için ince bir pipet kullanın. Tüpleri içeren yoğunluk gradyanı çözeltisini atın.
NOT: Yoğunluk gradyanı çözeltisinin ve plazmanın mümkün olduğunca azını toplarken buffy katın mümkün olduğunca fazlasını toplayın.
3. Hücrelerin yıkanması ve kaplanması
- 6 delikli bir plakayı fibronektin ile kaplayın.
- Steril suda 1 mg / mL'ye seyrelterek insan plazma fibronektininin stok çözeltisini yapın. Aliquotları -20 °C'de saklayın.
- 3 mL PBS'de 600 μL fibronektin stok çözeltisini seyrelterek 3.6 mL çalışan bir fibronektin çözeltisi yapın.
- 600 μL fibronektin çalışma çözeltisini 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın ve eşit şekilde kaplanana kadar hafifçe sallayın.
- Fibronektinin kuyucukları kaplaması için 30 dakika bekleyin ve çözeltiyi her bir kuyucuktan nazikçe aspire edin.
- Fibronektinin kaplanmasını beklerken, mononükleer hücreleri yıkayın
- Tüpleri 45 mL'ye kadar PBS ile doldurun
- Düşük frenle 560 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı her iki tüpten de aspire edin.
- Her hücre peletini 25 mL PBS'de yeniden askıya alın.
- İkinci kez yıkamak için tekrarlayın.
- Her hücre peletini 5 mL PBS içinde yeniden askıya alın ve her tüpe 15 mL% 0.8 amonyum klorür çözeltisi ekleyin.
NOT: Bu adım, kalan kırmızı kan hücrelerini lize etmektir. - 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
- Tüpleri PBS ile doldurarak hücreleri daha önce olduğu gibi yıkayın ve düşük frenle 560 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüj yapın. Süpernatantı her iki tüpten de aspire edin.
- Her hücre peletini 25 mL PBS'de tekrar askıya alın ve ikinci kez yıkamak için tekrarlayın.
- Her hücre peletini, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 10.000 U/mL penisilin, 10 mg/mL streptomisin ve 25 μg/mL amfoterisin içeren 1x antibiyotik/antimikotik solüsyon ile desteklenmiş 6 mL EGM-2 kültür ortamında yeniden askıya alın.
NOT: EGM-2 kültür besiyeri, 200 μL hidrokortizon, 2 mL insan fibroblast büyüme faktörü (hFGF-B), 500 μL vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), 500 μL insülin benzeri büyüme faktörünün rekombinant analoğu (R3 IGF-1), 500 μL askorbik asit, 500 μL insan epidermal büyüme faktörü (hEGF) ile desteklenmiş EBM-2 kültür ortamından oluşur, 500 mL başına 500 μL gentamisin/amfoterisin ve 500 μL heparin. - Hücre süspansiyonunun 2 mL'sini fibronektin kaplı 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna yavaşça aktarın ve eşit şekilde kaplanana kadar hafifçe sallayın.
NOT: Amaç, oluşacak endotel kolonilerinin sayısını en üst düzeye çıkarmak için mümkün olduğunca çok hücre tohumlamaktır.
4. Hücre kültürü
- Hücreleri 37 ° C,% 5 CO2 ve% 100 nemde inkübe edin.
- Ertesi gün, her bir kuyucuğa yavaşça 1 mL taze kültür ortamı ekleyin.
NOT: Fibronektin kaplamaya gevşek bir şekilde yapışan hücreleri rahatsız etmemek için nazik olmak önemlidir. - Ertesi gün, her bir kuyudan 1,5 mL kültür ortamını nazikçe aspire ederek ve 1,5 mL taze kültür ortamı ile değiştirerek yarım kültür ortamı değişikliği gerçekleştirin.
- Önümüzdeki 5 günün her birinde, her bir kuyucuk için nazikçe tam bir kültür ortamı değişikliği yapın (kuyu başına 2 mL taze kültür ortamı).
- Bundan sonra, kültür ortamını haftada üç kez yavaşça değiştirin.
- Hücre kültürlerini düşük güçlü (4x objektif) ışık mikroskobu altında düzenli olarak görselleştirin.
NOT: Yapışkan kan büyümesi endotel hücresi (BOEC) kolonileri, kaplamadan 7-10 gün sonra kuyucuklarda görünmeye başlayacaktır. Yapışkan olmayan hücre tipleri orta değişikliklerle atılacak ve diğer yapışkan hücre tipleri BOEC kolonileri büyüdükçe yavaş yavaş dağılacaktır. - BOEC'leri fibronektin kaplı bir T-75 şişesine ~% 70 -% 80 birleştiğinde geçirin ve haftada üç kez kültür ortamını değiştirmeye devam edin.
NOT: Tohumlama yoğunluğu, kolonilerin bunun yerine bir T25 şişesine geçirilmesiyle kontrol edilebilir. Sonraki pasajlar fibronektin kaplama gerektirmez ve kültür ortamı değişiklikleri haftada iki kez azaltılabilir. - 1-3 pasajlarındaki hücreler deneyler için kullanılabilir veya dondurucu bir ortama aktarılabilir ve ileride kullanılmak üzere sıvı azotta saklanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kültürlenmiş hücrelerin morfolojisi, kültürün başlangıcından BOEC kolonileri gözlenene kadar gözlendi (Şekil 1). Daha küçük bir yapışkan hücre popülasyonu kültür kaplarına yapışmaya ve büyümeye başlarken, yapışkan olmayan hücreler kültür ortamı değişiklikleriyle uzaklaştırıldı (Şekil 1B). Koloniler ilk olarak 6. günde, merkezi bir noktadan radyal olarak dışa doğru çoğalan endotel benzeri hücrelerin bir koleksiyonu olarak ortaya çıkmıştır (Şekil 1D). Kültür ilerledikçe, hücre kolonileri daha yoğun hale geldi ve olgun endotel hücrelerine benzer bir parke taşı morfolojisi sergiledi (Şekil 1F). Tipik endotelyal parke taşı morfolojisi, ışık mikroskobu kullanılarak BOEC'lerin kolay bir ön tanımlanmasını sağlar.
Endotel hücre kolonileri tipik olarak 10-14 günlük kültürde geçmeye hazırdır. Şu anda, 6 delikli plaka tipik olarak% 93 -% 98 canlılık yüzdesine sahip ~ 1 milyon hücre üretecektir. İlk geçiş sırasında, endotel hücreleri bir T75 şişesinde ~ 6-10 milyon hücre üretmek için genişleyecektir.
BOEC'lerin morfogenezini değerlendirmek için, bazal membran matrisi (örneğin, Matrigel), 10 μL / kuyuda 15 kuyucuklu anjiyogenez plakası üzerine kaplandı ve polimerizasyona izin vermek için 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edildi. Pasaj 2 hücreleri bazal membran matris kaplı plakalar üzerine ekildi ve 14 saat ve 24 saat noktalarında görüntülendi. Kuyu başına yaklaşık 3.500 hücrelik bir yoğunluk, bir ağ ve tüp benzeri yapılar oluşturabildi. Tüp oluşumu, serum serbest ortamı için 14 saat içinde (FBS hariç tamamlayıcılarla EGM-2) ve tam büyüme ortamı için 24 saat içinde (FBS içeren takviyelerle EGM-2) fark edildi. FBS'nin eklenmesi, endotel hücresine özgü büyüme faktörlerini (örneğin, VEGF) seyreltmiş ve tüp oluşum sürecinin gecikmesine neden olan diğer sinyal faktörlerini ortaya çıkarmış olabilir. Serumsuz ortamda (Şekil 2A,B) ve tam büyüme ortamında (Şekil 2C,D) tüp oluşumunu görüntülemek için 2D faz-kontrast mikroskobu kullanıldı. Her iki ortam koşullarındaki hücreler morfolojik farklılaşmaya uğradı ve hızla kılcal tüp benzeri yapıların geniş ağlarına organize oldu. Bu yapılar in vivo kılcal ağlara benzeyen organize hücresel kordonlardan oluşuyordu. Ayrıca, 20x büyütmedeki mikrograflar, endotel hücrelerinin karmaşık çok hücreli organizasyonunu ve morfolojik farklılaşmalarını ayrıntılı olarak göstermektedir. Medya koşulları arasında morfolojik farklılık gözlenmedi. Kılcal tüp benzeri yapıların geniş ağı, kültürlenmiş hücrelerin olgun ve fonksiyonel endotel hücrelerine farklılaşmasını güçlü bir şekilde göstermektedir.
BOEC'ler ayrıca olgun endotel hücre belirteci CD31 veya trombosit endotel hücre adezyon molekülü-1 (PECAM1) ekspresyonu ile karakterize edildi (Şekil 3A, B). BOEC'ler CD31'in tekdüze ekspresyonunu gösterdi. Ayrıca, akış sitometri analizi, PBMC'lerin pozitif kontrol grubuna kıyasla monosit belirteci CD14 için hücreler negatife boyandığı için EPC'lerin yokluğunu doğruladı (Şekil 3C, D).
Resim 1: Fenotip ışık mikroskobu görüntüleri. Kültürlenmiş BOEC'lerin ışık mikroskobu görüntüleri, ilk geçişten sonra (A) gün 0, (B) gün 2, (C) gün 4, (D) gün 6, (E) gün 8 ve (F) üzerinde 10x büyütmede gözlendi. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Geçiş 2 BOEC'lerinin morfolojik farklılaşması ve organizasyonu. Morfolojik farklılaşma ve pasaj 2 BOEC'lerin kılcal tüp benzeri yapılara organizasyonu, serumsuz ortam için 14 saat içinde ve tam büyüme ortamı için 24 saat içinde bazal membran matrisinde fark edildi. (A) 4x'te serumsuz ortam, (B) 20x'te serumsuz ortam, (C) 4x'te tam büyüme ortamı ve (D) 20x'te tam büyüme ortamı. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: BOEC'lerin CD31 ve CD14 ile karakterizasyonu. (A) Passage 2-3 BOEC'ler yeşil renkte görülen anti-CD31-FITC antikoru ve (B) karşılık gelen faz-kontrast mikroskopi görüntüleri kullanılarak PECAM1 için boyandı. Hücreler süspansiyonda boyandı ve süspansiyon mikroskop slaydında görüntülendi. Ölçek çubukları: 200 μm. (C) CD14-AF700 antikoru ile BOEC'lerin (D) pozitif kontrol periferik kan mononükleer hücrelerine (PBMC'ler) kıyasla akış sitometri analizi. Pozitif CD14 boyaması mavi renkte, lekesiz hücreler ise kırmızı renkte gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BOEC'ler çeşitli bilimsel ve terapötik yaklaşımlarda kullanılabilecek güçlü bir araçtır 7,8,16. BOEC'ler, vasküler hastalıkların ve kanserin gelişiminden sorumlu anahtar faktörleri aydınlatmak için EC gen ekspresyonunu analiz etmek için kullanılmıştır 5,19,20,21. BOEC'ler ayrıca vasküler rejenerasyon ve gen iletimi22,23,24 gibi terapötik uygulamalarda da kullanılmıştır. Genetiği değiştirilmiş BOEC'ler antianjiyojenik tümör tedavi yetenekleri ile bilinmektedir25,26. Ayrıca, BOEC'lerin anjiyojenik potansiyeli, onları vaskülarizasyon ve neovaskülarizasyonu amaçlayan hücresel tedaviler için mükemmel adaylar haline getirmektedir17,27. Birçok çalışma BOEC'lerin insan periferik kanından nasıl elde edileceğini açıklasa da 6,7,8,9, altta yatan patofizyolojik ve genetik varyasyon nedeniyle insan hücre kaynaklarının değişkenliği, BOEC'lerin sağlıklı ksenojenik kaynaklardan elde edilmesi için kritik bir ihtiyaç olduğunu düşündürmektedir 9,13,18.
BOEC'leri domuz periferik kan mononükleer hücrelerinden verimli bir şekilde türetmek için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Kritik adımlar arasında, kan örneklerinin mümkün olan en kısa sürede işlenmesi ve kültüre giren uygulanabilir PBMC'lerin sayısını en üst düzeye çıkarmak için yoğunluk gradyanı santrifüjlemesinden sonra kabarık kaplama katmanlarının verimli bir şekilde toplanması yer almaktadır. İlk kaplama yoğunluğu ve hücrelerin zamanında geçmesi, bu hücre tiplerinin tutarlı izolasyonunu elde etmek için önemli hususlardır. 100 mL'lik bir başlangıç kan hacmi, tek bir altı delikli plaka için uygun sayıda PBMC sağlar. Bir domuzdan güvenli bir şekilde toplanabilecek maksimum kan hacminin hayvan vücut ağırlığına göre değişeceği belirtilmelidir. Domuzlar için önerilen güvenli bir kerelik maksimum kan hacmi toplama, vücut ağırlığının kg'ı başına 8 mL'dir. Ek olarak, ilk kolonilerin 0 geçişinden 1 numaralı pasaja zamanında geçirilmesi de önemlidir. Tohumlama yoğunluğu çok düşükse veya hücreler akıcılığa ulaşırsa hücreler çoğalmayı durdurur. Hücreler birleştikçe, uzamış bir mezenkimal morfolojiye ve fenotipe dönüşmeye başlarlar. Tohumlama yoğunluğu, kolonilerin bir T75 şişesi yerine bir T25 şişesine geçirilmesiyle de kontrol edilebilir. İlk ortam değişimi sırasında yapışkan hücre tiplerini kaybetmemek için dikkatli bir şekilde düşünülmelidir, çünkü yapışkan olmayan EPC'leri atarken mümkün olduğunca çok sayıda yapışkan hücreyi yakalamak çok zorunludur. Bu protokol yaklaşık 1 hafta içinde büyüme hücresi kolonileri üretir.
Protokol son derece tekrarlanabilir ve güvenilirdir. Endotel hücre kolonilerinin genişlemesi, kültürlerin tahmini% 90-95'inde elde edilir. Başarısızlık tipik olarak endotel hücre kolonilerinin oluşmamasından kaynaklanır, yani en az bir endotel hücre kolonisi oluşursa, neredeyse her zaman kültürde genişlemeye devam edeceklerdir. Başarısızlık kaynakları arasında rastgele değişkenlik, kan toplama sırasında hücrelerin aşırı kesilmesi, kültürdeki mikropların kirlenmesi ve işleme adımları sırasında yüksek mononükleer hücre kaybı sayılabilir. Başarısız bir kültürden sonra, ikinci bir kültür tipik olarak başarılı olacaktır, bu da hayvanlar arasındaki değişkenliğin önemli bir faktör olmadığını gösterir. Protokol, ötenaziden hemen sonra kan toplarken bile başarılıdır, bu da yıkama adımlarının ötenazi ajanlarını zararsız seviyelere etkili bir şekilde azalttığını gösterir.
Dolaşımdaki kan hücresi popülasyonundaki heterojenlikten bağımsız olarak, EPC'lerden çok farklı BOEC'ler elde edildi. BOEC'ler, CD14 ifadesi olmayan yapışkan PBMC'lerin küçük bir alt kümesinden türetilir. Bu, CD14 boyamasının olmaması ile doğrulandı (Şekil 3C, D). Monositik EPC'lerin erken pasajlarda BOEC kültürlerinden temizlenmesi, hücre ölümü veya uyumsuzluk ile açıklanabilir. BOEC'lerin parke taşı morfolojisi (Şekil 1E,F) belirgin bir endotel fenotipi düşündürmektedir. Ek olarak, yüzey belirteci CD31'in tekdüze ekspresyonu (Şekil 3A), olgun endotel hücrelerinin homojen bir popülasyonunu ifade eder. Ayrıca, BOEC'lerin hem serumsuz (Şekil 2A,B) hem de tam büyüme ortamlarında (Şekil 2C,D) kılcal morfogenezleri, doğal anjiyojenik yeteneklerini göstermektedir 6,8. Bu protokol kullanılarak üretilen domuz BOEC'lerinin önceki analizi, bu hücrelerin von Willebrand faktör ekspresyonu ve lektin bağlama28 için ek olarak pozitif olduğunu göstermiştir.
BOEC'lerin ortaya çıktığı dolaşımdaki kandaki PBMC'lerin bolluğu, hayvansal kaynaklardan neredeyse sınırsız bir terapötik BOEC kaynağı elde etmek için sağlam bir yöntemin fizibilitesini desteklemektedir. Teknikte ustalaştıktan sonra, BOEC'ler vasküler onarım ve rejenerasyon, hastalık modelleme, ilaç taraması ve endotel hücre biyolojisi çalışmaları dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Domuz BOEC'lerinin homojenliğini ve insanlarda terapötik bir kaynak olarak uyumluluğunu doğrulamak için devam eden çalışmalara ihtiyaç vardır.
Bu protokolün bir sınırlaması, endotel hücre kolonilerinin genişleyememesi riskidir. Başarısızlık oranının %5-%10 olduğu tahmin edilmektedir ve bu durumlarda ikinci bir girişim gereklidir. Başarı güvencesi önemli olduğunda, iki kat daha fazla kan toplanabilir ve protokol iki bağımsız kültür elde etmek için paralel olarak takip edilebilir. Ayrıca, deneyimlerimiz sağlıklı Yorkshire / Landrace / Duroc çapraz evcil domuzları (Sus domesticus), erkek ve dişi, 40-80 kg, 3-6 aylık ile sınırlıdır. Diğer ırklar, yaşlar ve deneysel koşullarla başarı oranları bilinmemektedir.
Protokolün bir başka sınırlaması, BOEC fenotipi için kesin bir belirtecin bulunmamasıdır. Burada ve önceki çalışmalarda28, bu protokolden üretilen domuz BOEC'leri birkaç BOEC belirteci için karakterize edilmiştir, ancak BOEC fenotipinin anlaşılması gelişmeye devam etmektedir. BOEC'ler ayrıca 2-3 pasajlarında da karakterize edilir ve daha yüksek pasajlardaki fenotip bilinmemektedir. Domuz BOEC'lerinin insanlara kıyasla bir avantajı, daha sık kültürlerin üretilmesine ve tutarlı, düşük geçişli hücrelerin sağlam bir şekilde tedarik edilmesine izin veren domuz kanının hazır tedarikidir.
Terapötik yaklaşımlarda domuz hücrelerinin kullanılmasının en önemli sınırlamalarından biri konakçı immün yanıtıdır29. İnsan transplantasyonu için ksenojenik hücrelerin immünojenitesini azaltmak için anti-enflamatuar ajanlar ve CRISPR / Cas genetik manipülasyonu30,31,32 gibi çeşitli immünomodülasyon stratejileri araştırılmaktadır. Daha yeni çalışmalar, insan tamamlayıcı düzenleyici proteinlerin (hCRP'ler) 33 ekspresyonunu ve α1,3- galaktosiltransferaz silinmiş (GTKO) 32,34 domuzun kullanılmasını önermiştir. Bu gelişmeler, domuz BOEC'leri de dahil olmak üzere ksenojenik hücrelerin terapötik uygulaması için umut vaat etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar NIH / NHLBI R00 HL129068'den fon almayı kabul etmek istiyorlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
References
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
- Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
- Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
- Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
- Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
- Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
- Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
- Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
- Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
- Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
- Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
- Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
- Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
- De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
- Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
- Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
- Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
- Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
- Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
- Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
- Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
- Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R.
- Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
- Phelps, C. J., et al.
