Summary
Wir stellen ein Protokoll vor, um metabolische Aktivitäten in Zellen, die durch Aminosäuren reguliert werden, direkt sichtbar zu machen, indem wir Deuteriumoxid (schweres Wasser D2O) mit sondierter stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) verwenden, die in die Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) integriert ist.
Abstract
Essentielle aromatische Aminosäuren (AAAs) sind Bausteine für die Synthese neuer Biomassen in Zellen und die Aufrechterhaltung normaler biologischer Funktionen. Zum Beispiel ist ein reichliches Angebot an AAAs für Krebszellen wichtig, um ihr schnelles Wachstum und ihre Teilung aufrechtzuerhalten. Damit steigt die Nachfrage nach einem hochspezifischen, nicht-invasiven Bildgebungsansatz mit minimaler Probenvorbereitung, um direkt zu visualisieren, wie Zellen AAAs für ihren Stoffwechsel in situ nutzen. Hier entwickeln wir eine optische Bildgebungsplattform, die Deuteriumoxid (D2O)-Sondierung mit stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) kombiniert und DO-SRS mit Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz (2PEF) in ein einziges Mikroskop integriert, um die Stoffwechselaktivitäten von HeLa-Zellen unter AAA-Regulierung direkt sichtbar zu machen. Insgesamt bietet die DO-SRS-Plattform eine hohe räumliche Auflösung und Spezifität von neu synthetisierten Proteinen und Lipiden in einzelnen HeLa-Zelleinheiten. Darüber hinaus kann die 2PEF-Modalität Autofluoreszenzsignale von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) und Flavin markierungsfrei detektieren. Das hier beschriebene Bildgebungssystem ist sowohl mit In-vitro- als auch mit In-vivo-Modellen kompatibel, was für verschiedene Experimente flexibel ist. Der allgemeine Arbeitsablauf dieses Protokolls umfasst Zellkultur, Nährmedienvorbereitung, Zellsynchronisation, Zellfixierung und Probenbildgebung mit DO-SRS- und 2PEF-Modalitäten.
Introduction
Als essentielle aromatische Aminosäuren (AAAs) können Phenylalanin (Phe) und Tryptophan (Tryp) vom menschlichen Körper aufgenommen werden, um neue Moleküle zur Aufrechterhaltung normaler biologischer Funktionen zu synthetisieren1. Phe wird für die Synthese von Proteinen, Melanin und Tyrosin benötigt, während Tryp für die Synthese von Melatonin, Serotonin und Niacinbenötigt wird 2,3. Ein übermäßiger Konsum dieser AAAs kann jedoch das Säugetierziel des Rapamycin-Signalwegs (mTOR) hochregulieren, die AMP-aktivierte Proteinkinase hemmen und in den mitochondrialen Stoffwechsel eingreifen, wodurch die Biosynthese von Makromolekülen kollektiv verändert und zur Produktion von bösartigen Vorläufern wie reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in gesunden Zellen geführt wird 4,5,6. Die direkte Visualisierung einer veränderten Stoffwechseldynamik unter übermäßiger AAA-Regulation ist unerlässlich, um die Rolle von AAAs bei der Förderung der Krebsentstehung und des Wachstums gesunder Zellen zu verstehen 7,8,9.
Herkömmliche AAA-Studien stützen sich auf die Gaschromatographie (GC)10. Andere Methoden, wie z. B. die Magnetresonanztomographie (MRT), haben eine begrenzte räumliche Auflösung, was die Durchführung zellulärer und subzellulärer Analysen biologischer Proben erschwert11. Kürzlich wurde die matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI) entwickelt, um die Rolle von AAAs bei der Lipid- und Proteinsynthese bei der Krebsproliferation mit nicht-invasiven Biomarkernaufzuklären 12,13,14. Diese Technik leidet jedoch immer noch unter geringen Abbildungstiefen, schlechter räumlicher Auflösung und umfangreicher Probenvorbereitung. Auf zellulärer Ebene können ungiftige stabile Isotope wie Stickstoff-15 und Kohlenstoff-13 mit Multi-Isotopen-Bildgebung und nanoskaliger Sekundärionen-Massenspektrometrie aufgespürt werden, um ihren Einbau in Makromoleküle zu verstehen. Diese Methoden sind jedoch zerstörerisch für lebende biologische Proben15,16. Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist eine weitere leistungsstarke Technik, mit der die Stoffwechseldynamik sichtbar gemacht werden kann17. Die langsame Abtastrate während der AFM-Bildgebung kann hingegen zu einer Bildverzerrung des Ergebnisses durch thermische Drift führen.
Wir haben eine nicht-invasive biorthogonale Bildgebungsmodalität entwickelt, indem wir Deuteriumoxid (D2O)-Sonden-stimulierte Raman-Streumikroskopie (DO-SRS) und markierungsfreie Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) gekoppelt haben. Diese Modalität erreicht eine hohe räumliche Auflösung und chemische Spezifität bei der Abbildung biologischer Proben 18,19,20,21,22,23,24. Dieses Protokoll stellt die Anwendungen von DO-SRS und 2PEF vor, um die metabolische Dynamik von Änderungen des Lipid-, Protein- und Redoxverhältnisses während des Fortschreitens von Krebs zu untersuchen. Da es sich beiD2Oum eine stabile Isotopenform von Wasser handelt, können zelluläre Biomoleküle mit Deuterium (D) markiert werden, da es schnell mit dem gesamten Körperwasser in den Zellen kompensiert wird und Kohlenstoff-Deuterium (C-D)-Bindungen (C-D) durch enzymatischen Austausch bildet21. Die C-D-Bindungen in neu synthetisierten Makromolekülen, einschließlich Lipiden, Proteinen, DNA/RNA und Kohlenhydraten, können in der stillen zellulären Region des Raman-Spektrumsnachgewiesen werden 20,21,22,25,26,27. Mit zwei synchronisierten Laserpulsen können C-D-Bindungen von neu synthetisierten Lipiden und Proteinen mittels hyperspektraler Bildgebung (HSI) auf einzelnen Zellen dargestellt werden, ohne dass sie extrahiert oder mit zytotoxischen Wirkstoffen markiert werden müssen. Darüber hinaus ist die SRS-Mikroskopie in der Lage, dreidimensionale (3D) Modelle ausgewählter Regionen von Interesse in biologischen Proben zu erstellen, indem eine Reihe von Querschnittsbildern aufgenommen und kombiniert wird22,26. Mit hyperspektraler und volumetrischer 3D-Bildgebung kann DO-SRS räumliche Verteilungen von neu synthetisierten Makromolekülen in einzelnen Zellen erhalten, zusammen mit der Art von Organellen, die den Prozess der Förderung des Krebswachstums gemäß AAA-Regulation22 erleichtern. Darüber hinaus können wir mit 2PEF Autofluoreszenzsignale von Flavin und Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) mit hoher Auflösung, tiefer Eindringtiefe und geringer Schädigung in biologischen Proben erhalten21,23,24. Flavin- und NADH-Autofluoreszenzsignale wurden verwendet, um die Redoxhomöostase und Lipidperoxidation in Krebszellen zu charakterisieren22,26. Die Kopplung von DO-SRS und 2PEF ermöglicht somit nicht nur eine subzelluläre Analyse der AAA-regulierten Stoffwechseldynamik in Krebszellen mit hoher räumlicher Verteilung, chemischen Spezifitätsinformationen und minimaler Probenvorbereitung, sondern reduziert auch die Notwendigkeit, endogene Moleküle mit toxischen Reagenzien zu extrahieren oder zu markieren. In diesem Protokoll stellen wir zunächst die Verfahren derD2O- und Aminosäurepräparation sowie der Krebszellkultur vor. Anschließend zeigen wir die Protokolle der DO-SRS-Bildgebung und der 2PEF-Bildgebung. Abschließend präsentieren wir die repräsentativen Ergebnisse der SRS- und 2PEF-Bildgebung, die AAA-regulierte metabolische Veränderungen von Lipiden und Proteinen sowie Änderungen des Redoxverhältnisses in Krebszellen zeigen. Eine detaillierte Darstellung des Prozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.
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Protocol
1. Medienaufbereitung
- Bereiten Sie 10 ml Kontroll- und überschüssige AAAs in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 50 %D2Ovor.
- Für die Kontrollmedien werden 10 mg DMEM-Pulver mit 4,7 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) in einem konischen 15-ml-Röhrchen gemessen und gemischt. Das DMEM-Pulver enthält alle Aminosäuren in Standardkonzentrationen. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist. Fügen Sie 4,7 mlD2O, 0,5 ml fötales Kälberserum (5 % FBS) und 0,1 ml Penicillin/Streptomycin (1 %) hinzu. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist.
- Für das 15x Phe-Behandlungsmedium werden 10 mg DMEM-Pulver mit 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5 %) und 0,1 ml Penicillin/Streptomycin (1 %) in einem konischen 15-ml-Röhrchen abgemessen und gemischt. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist. Überschüssiges Phe-Pulver in einer Konzentration von 924 mg/L in das Medium geben. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist.
- Für das 15x Tryp Behandlungsmedium 10 mg DMEM-Pulver mit 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5 %) und 0,1 ml Penicillin/Streptomycin (1 %) in einem konischen 15-ml-Röhrchen abmessen und mischen. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist. Überschüssiges Tryp-Pulver in einer Konzentration von 224 mg/L in das Medium geben. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist.
- Methionin und Threonin in einer Konzentration von 30,0 mg/ml bzw. 95,0 mg/ml werden zu allen konischen Röhrchen der vorherigen Schritte zugegeben. Wirbeln Sie das Rohr gründlich vor und drehen Sie es um. Natriumpyruvat muss den Nährmedien nicht zugesetzt werden.
- Filtern Sie die Kontroll- und Behandlungsmedien mit einem 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit 0,22 μm Polyethersulfon-Membranfiltern.
- Versiegeln Sie alle konischen Röhrchen mit Parafolie und lagern Sie sie bei 4 °C bis zu 3 Wochen. Bevor Sie die Zellen mit Medien behandeln, erwärmen Sie alle Medien auf 37 °C.
HINWEIS: Die pulverförmigen und flüssigen Reagenzien sollten auf der Grundlage des Gesamtvolumens der Behandlungs- und Kontrollmedien gemessen und kombiniert werden.
2. Vorbereitung der Zellprobe
- Halten Sie Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa-Zellen) in einem Kulturkolben (d. h. T10, T25 usw.) unter Verwendung von Standard-DMEM, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid (CO2) ergänzt wird.
- Subkultur der HeLa-Zellen in einem Split-Verhältnis von 1:10, bis die Zelllebensfähigkeit von 80 % oder höher erreicht ist.
- Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % oder mehr erreicht haben, werden 2 x 10 5 Zellen pro Well auf eine 24-Well-Platte gesät, wobei DMEM mit0,5 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt wird.
- Bereiten Sie vor der Zellaussaat eine 24-Well-Platte mit sterilisierten, lamininbeschichteten, runden Deckgläsern aus Poly-D-Lysin mit einem Durchmesser von 12 mm vor. Tauchen Sie die Deckgläser in 70%iges Ethanol und trocknen Sie sie vorsichtig mit fusselfreien Tüchern. Legen Sie die sauberen Deckgläser in die entsprechenden Vertiefungen der Platte.
- Sobald die Zellen in Schritt 2.2 eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, waschen Sie die Zellen einmal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Magnesium- und Kalziumionen.
- Man fügt 0,25 % Trypsin hinzu, um die adhärenten Zellen aus dem Kolben zu dissoziieren, und inkubiert bei 37 °C und 5 %CO2 für 3 min.
- Fügen Sie DMEM hinzu, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt ist, pipettieren Sie vorsichtig auf und ab und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g bei Raumtemperatur (RT) für 3 Minuten.
- Resuspendieren Sie die Zellen in DMEM, ergänzt mit 0,5 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, einem Lichtmikroskop und Trypanblau und säen Sie eine Dichte von 2 x 105 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Alternativ kann ein automatisierter Zellzähler verwendet werden, um die Zellen zu zählen.
- Die Zellen werden bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator zurückgelegt und die Platte vorsichtig geschüttelt, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
- Ersetzen Sie nach 8 Stunden das alte Nährmedium durch 50 % D2O/überschüssiges Phe oder 50 %D2O/überschüssiges Tryp-Medium. Die Zellen werden 36 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator zurückgelegt.
- Nach 36 h fixieren Sie die Zellen auf Objektträgern.
- Bereiten Sie vor der Fixierung Objektträger mit Abstandshaltern mit einem Durchmesser von 9 mm vor und geben Sie 15 μl 1x PBS mit Kalzium- und Magnesiumionen anreichern.
- Spülen Sie die Zellen mit 1x PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen.
- Geben Sie 0,5 ml 4%ige methanolfreie Paraformaldehyd-Lösung (PFA) hinzu und lassen Sie die Platte ca. 15 Minuten lang unter der Biosicherheitshaube.
- Saugen Sie die PFA-Lösung an und spülen Sie zweimal mit 1x PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen.
- Geben Sie 1,5 ml 1x PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen, in jede Vertiefung.
- Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Deckgläser vorsichtig aus jeder Vertiefung zu ziehen. Invertieren Sie die zellhaltige Seite der Deckgläser und legen Sie sie auf die Abstandshalter für die Bildgebung, um das in Schritt 2.5.1 vorbereitete PBS zu kontaktieren. Stellen Sie sicher, dass die nicht zellhaltige Seite mit Luft in Berührung kommt.
- Versiegeln Sie die äußere Schicht des Deckglases mit transparentem Nagellack mit dem Abstandshalter.
- Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C, wenn Sie nicht bebildern.
3. Spontane Raman-Spektroskopie-Messung (Abbildung 2)
- Verwenden Sie ein konfokales Raman-Mikroskop, um spontane Raman-Spektren zu erhalten (Abbildung 2A).
- Schalten Sie den Laser ein, indem Sie den Schlüssel in die Position ON drehen.
- Doppelklicken Sie auf das LabSpec6-Softwaresymbol , um die Erfassungssoftware zu öffnen.
- Legen Sie die biologische Probe auf den Probenhalter direkt unter der Objektivlinse.
- Klicken Sie in der Software auf das Kamerasymbol , um die Videokamera einzuschalten.
- Passen Sie die Fokusebene an, um einen Interessenbereich mit dem 50-fach-Objektiv zu identifizieren. Bewegen Sie den Joystick, um die Hobelverschiebung des XY-Tisches zu steuern, und drehen Sie den Joystick, um die Schärfentiefe zu ändern.
- Nachdem Sie die Position für die Messung gewählt haben, wechseln Sie zum 100-fach-Objektiv mit 40 mW Anregungsleistung. Klicken Sie auf das rote Stopp-Symbol , um die Videokamera auszuschalten.
- Wählen Sie ein Gitter von 1800 Linien/mm und stellen Sie den Erfassungsbereich von 400 cm-1 bis 3.150 cm-1 ein.
- Stellen Sie die Erfassungszeit auf 90 s, die Akkumulation auf 3 und das Binning auf 4 ein, um das geringste Rauschen und das genaueste Spektrum zu erzielen.
HINWEIS: Diese Bildgebungsparameter können für das Experiment optimiert werden. - Klicken Sie auf das Pfeilsymbol , um die Echtzeitanzeige einzuschalten.
- Stellen Sie die Raman-Verschiebung (cm-1) auf einen Wert Ihrer Wahl ein, um die Fokusebene fein abzustimmen.
ANMERKUNG: In diesem Experiment wurde der Raman-Laser auf die Lipidtröpfchen fokussiert, die eine hohe Konzentration anCH2-Bindungen enthielten. Zu diesem Zweck wurde daher eine Raman-Verschiebung von 2.850 cm-1 gewählt, die den Streckmoden derCH2-Bindung entsprach. - Stellen Sie die Fokusebene mit dem Joystick ein, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren.
- Nachdem Sie die Fokusebene ausgewählt haben, klicken Sie auf das rote Stopp-Symbol , um eine Echtzeitanzeige anzuzeigen.
- Wählen Sie das Kreissymbol aus, um die Spektrumerfassung zu starten.
- Sobald die Zellregion aufgenommen wurde, verwenden Sie dieselbe Fokusebene, um den Hintergrund mit PBS zu messen. Subtrahieren Sie das Hintergrundspektrum von jedem subzellulären Zielspektrum mit einer separaten Computersoftwareanwendung, z. B. Origin (Abbildung 1B).
4. Bildgebende Experimente mit 2PEF und SRS
HINWEIS: Detaillierte Beschreibungen der SRS-Laserausrichtung finden Sie in einem früheren Bericht28. Dieses Protokoll konzentriert sich auf den Betrieb eines multimodalen SRS- und 2PEF-Bildgebungssystems (Abbildung 2C, D).
- Klicken Sie auf Start , um den Laser aufzuwärmen.
- Befolgen Sie die Reihenfolge, um die Hauptschalter des Steuergeräts und des Monitors einzuschalten: 1) Drücken Sie den Hauptschalter der Steuereinheit IX3-CBH auf Ein, 2) Drücken Sie den Hauptschalter des Touchpanel-Controllers auf Ein, 3) Drücken Sie den Hauptschalter des Netzteils des Netzteils für LD OBIS 6 Laser Remote, das mit dem Hauptlaserkombinator FV31-SCOMB verbunden ist, auf Einund 4) Drücken Sie den Hauptschalter des Netzteils des Netzteils für LD OBIS 6 Laser Remote, das mit dem Sub-Laser-Combiner FV31-SCOMB verbunden ist, auf Ein.
- Drücken Sie die Hauptschalter des Si-Fotodiodendetektors und des Lock-in-Verstärkers auf Ein.
- Stellen Sie den Stokes-Strahl auf 1.031 nm, die Pulsbreite auf 6 ps und die Wiederholrate auf 80 MHz ein.
- Gekoppelt mit dem Mikroskop stellen Sie das picoEmerald-System ein, das mit dem synchronisierten Pumpstrahl mit einer abstimmbaren Wellenlänge von 720-990 nm, einer Pulsbreite von 5-6 ps und einer Wiederholrate von 80 MHz geliefert wird. Die durchschnittliche Erregerleistung sowohl der Pumpe als auch der Stokes beträgt 450 mW. Optimieren Sie die Anregungsleistung, um Lichtschäden für die Probe zu minimieren.
- Verwenden Sie einen Ölkondensator mit hoher numerischer Apertur (NA) (d. h. 1,4 NA), um die Stokes- und Pumpbalken zu sammeln, an denen die Probe montiert ist, indem einige Tropfen auf den Kondensator abgegeben werden.
- Montieren Sie die Probe auf das Öl und platzieren Sie einen großen Wassertropfen auf dem Objektträger, an dem die Probe befestigt ist. Dies gilt für das Wasserimmersionsobjektiv.
- Stellen Sie den Lock-in-Verstärker auf 20 MHz ein. Bearbeiten Sie das Bild nun mit dem Super-Resolution-Softwaremodul.
- Wählen Sie 512 Pixel x 512 Pixel und 80 μs/Pixel für die Verweilzeit.
- Sobald die gewünschte Zellregion richtig fokussiert ist, nehmen Sie das Bild auf. Speichern Sie die Bilder mit der Erfassungssoftware des Mikroskops als .oir-Grafikdatei von Olympus.
- Erfassen Sie ein Hintergrundbild bei 1.900 cm-1 und subtrahieren Sie es von allen zellulären Bildern.
- Um eine 2PEF-Bildgebung durchzuführen, verwenden Sie denselben abstimmbaren Pikosekundenlaser und stellen Sie die markierungsfreie Autofluoreszenz von Flavin und NADH auf 800 nm bzw. 780 nm ein.
- Verwenden Sie einen 460 nm/515 nm Filterwürfel, um die rückgestreute Flavin- und NADH-Autofluoreszenzemission zu sammeln.
- Stellen Sie die Verweilzeit auf 8 μs/Pixel und die Pixelgröße auf 512 Pixel x 512 Pixel ein. Stellen Sie den Parameter für die Laserverschlussleistung auf 150 mW ein.
- Für die 3D-Bildrekonstruktion stellen Sie den stimulierten Raman-Verlust auf 2.850 cm-1 (797 nm) ein.
- Sobald die gewünschten Einzelzellen identifiziert wurden, registrieren Sie den Laser, um von der oberen Fokusebene aus zu scannen, um die oberen und unteren Schichten dieser Zellen zu erkennen.
HINWEIS: 3D-Modelle werden als OIR-Dateien generiert und gespeichert.
5. Spektren und Bildanalyse
- Spektrenanalyse
- Verwenden Sie die Origin-Software oder andere relevante Anwendungen, um das Hintergrundspektrum von allen subzellulären Zielspektren zu subtrahieren.
- Verwenden Sie die mathematischen Modellierungsoperationen von MATLAB, um die Raman-Spektren mit den integrierten Funktionen der Software zu verarbeiten. Python kann auch für die Spektrenverarbeitung verwendet werden.
- Die spektrale Vorverarbeitung beginnt mit der Konvertierung der Dateien in ein Array. Die Spektren werden auf jedem reziproken Zentimeter interpoliert.
- Stellen Sie zur Validierung die Rohdaten grafisch dar. Führen Sie die Basislinienkorrektur für die Rohspektren mit der integrierten Funktion msbackadj in MATLAB durch. Kurz gesagt, die integrierte Funktion schätzt Basislinienpunkte anhand von Trennungseinheitenwerten, die von Benutzern identifiziert wurden, und gibt den Abstand zwischen benachbarten Fenstern zurück. Schätzen und zeichnen Sie anhand der Basislinienpunkte eine Regressionsgerade. Wenden Sie Glättung an, um die Regressionsgerade zu glätten und die Basislinie von jedem einzelnen Rohspektrum zu subtrahieren.
- Führen Sie eine Min-Max-Normalisierung durch, indem Sie die Raman-Intensität des Proteins bei 2.930 cm-1 durch die Intensität jeder Raman-Verschiebung dividieren. Das 2.930 cm-1-Signal ist typischerweise die höchste Intensität im Raman-Spektrum . Bei dieser Normalisierung wird der Maximalwert in eine 1 umgewandelt, während der Minimalwert in eine 0 umgewandelt wird. Jeder zweite Wert wird in eine Dezimalzahl zwischen 0 und 1 umgewandelt.
- Mitteln Sie die einzelnen Spektren desselben Zustands zu einem einzigen Spektrum, um das Rauschen zu reduzieren.
- Verwenden Sie nach der Verarbeitung Anwendungen wie Origin, um alle Spektren gleichzeitig anzuzeigen. Die in den Spektren dargestellten Peaks stellen eine bestimmte chemische Bindung oder funktionelle Gruppe dar.
- 3D-Bildanalyse von Lipidtröpfchen
- Verwenden Sie die FIJI-ImageJ-Software, um alle 3D-Bilder zu verarbeiten
- Führen Sie die Funktionen Bandpassfilter und Glättung für die 3D-Bildstapel aus.
- Für die 3D-Bildanalyse weisen Sie jedem Lipidtröpfchen einen sphärischen Score zu, der durch Messung des Abstands zwischen seinem Massenschwerpunkt und der Oberfläche berechnet wird. Vergleichen Sie jede sphärische Partitur mit einer sphärischen Partitur einer perfekten Kugel auf derselben euklidischen Ebene. Verwerfen Sie Lipidtröpfchen mit niedrigen sphärischen Werten und bewerten Sie die verbleibenden Lipidtröpfchen auf ihr Volumen und ihre Anzahl.
- Analysieren Sie das Volumen und die Anzahl der Lipidtröpfchen zwischen verschiedenen Behandlungen auf statistische Signifikanz in einer geeigneten statistischen Softwareanwendung. Hier kam GraphPad Prism zum Einsatz.
- Hyperspektrale 2D-Bildanalyse
- Verwenden Sie die FIJI-ImageJ-Software, um alle hyperspektralen 2D-Bilder zu verarbeiten.
- Wählen Sie den Kanal 2.930 cm-1 aus, um ein Maskenbild mit den Werten 0 und 1 zu erstellen. Weisen Sie den Hintergrund 0 und den Zellbereich 1 zu.
- Subtrahieren Sie den Deuterium-markierten Proteinkanal (2.175 cm-1) vom Hintergrundkanal (1.900 cm-1), um die Fluoreszenzeffekte zu entfernen.
- Dividieren Sie den resultierenden Deuterium-markierten Proteinkanal durch den Proteinkanal (2.930 cm-1), um ratiometrische Bilder der Proteinumsatzrate zu erhalten.
- Multiplizieren Sie dann das in Schritt 5.3.2 erstellte Maskenbild mit den ratiometrischen Bildern, um alle verbleibenden Hintergrundgeräusche zu entfernen. Dadurch wird in jedem ratiometrischen Bild ein dunkler Hintergrund erzeugt.
- Verwenden Sie das Freihandauswahl-Werkzeug in FIJI-ImageJ, um die in einzelnen Zellen angezeigten Pixelintensitäten manuell zu segmentieren und zu berechnen. Die Pixelintensitäten entsprechen den Konzentrationen der chemischen Bindung, die visualisiert wird.
- Analysieren Sie die Pixelintensitäten auf statistische Signifikanz in einer geeigneten Statistiksoftwareanwendung. Hier kam GraphPad Prism zum Einsatz. Wiederholen Sie diese Analyse mit der verbleibenden ratiometrischen Analyse.
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Representative Results
Die Zugabe von überschüssigen AAAs in 15-facher Konzentration zu den 50%D2O-haltigenZellkulturmedien führte zu deutlichen C-D-Raman-Banden neu synthetisierter Lipide und Proteine in HeLa-Zellen (Abbildung 2B). Frühere Experimente wurden mit unterschiedlichen Konzentrationsniveaus durchgeführt, z. B. 2x und 5x, und obwohl die Daten nicht präsentiert werden, erzeugte die 15-fache Konzentration die deutlichsten C-D-Raman-Banden neu synthetisierter Lipide und Proteine. Insbesondere durch die Untersuchung von Lipidtröpfchen (LDs) stellten wir fest, dass sowohl 15x Phe als auch 15x Tryp neu synthetisierte Lipide und Proteinsignale bei 2.143 cm-1 bzw. 2.172 cm-1 induzierten. DO-SRS wurde anschließend verwendet, um die räumliche Verteilung von C-D-Signalen auf einzelnen Zellen zu visualisieren (Abbildung 3). Mit ImageJ wurden die Pixelintensitäten einzelner Zellen manuell segmentiert und berechnet, wie in Abbildung 3A durch gepunktete weiße Ränder dargestellt. Die Kontrollzellen weisen moderate C-D-Lipid- und Proteinbanden auf; Das 15-fache Phe und das 15-fache Tryp weisen jedoch stärkere C-D-Lipid- und Proteinbanden auf. Quantitative Analysen deuten darauf hin, dass überschüssige AAAs die Lipidsynthese um 10 % bis 17 % hochregulieren, die Proteinsynthese jedoch um 10 % herunterregulieren können (Abbildung 3C, D). Die Ergebnisse deuten auf die Möglichkeit eines Mangels an Autophagie hin, der neu synthetisierte Lipide akkumuliert, die mitochondriale Dysfunktion fördert und ein oxidatives Ungleichgewicht unter übermäßiger AAA-Regulation induziert7.
Markierungsfreie multimodale SRS- und 2PEF-Bildgebung von ungesättigtem Lipid (~3.011 cm-1), gesättigtem Lipid (~2.880 cm-1) und NADH, Flavin wurden erworben, um die Auswirkungen von AAAs auf den Krebsstoffwechsel zu verstehen. In ähnlicher Weise wurden die Pixelintensitäten einzelner Zellen manuell segmentiert und mit ImageJ berechnet, wie in Abbildung 3B durch gepunktete weiße Ränder dargestellt. Die ratiometrische Analyse von AAA-behandelten Zellen zeigt einen Anstieg von 10 % an ungesättigten Lipiden/gesättigten Lipiden und einen 50 %igen Anstieg von Flavin/Flavin + NADH (Abbildung 3E,F). In der Elektronentransportkette der Mitochondrien kann ROS durch den Transfer von Elektronen von NADH undFADH2 auf molekulare Sauerstoffspezies erzeugt werden. Die Anhäufung von ROS in vielen Krebszellen führt zu einem oxidativen Ungleichgewicht, das ungesättigte Fettsäuren oxidiert, die Synthese gesättigter Fettsäuren fördert und die NADH-Autofluoreszenzsignale abbaut. Daher ist der beobachtete Anstieg von Flavin/Flavin + NADH ein Indikator für akkumulierte ROS, der NADH-Autofluoreszenzsignale reduziert. Als Reaktion auf ein oxidatives Ungleichgewicht können HeLa-Zellen ihre ungesättigte Lipidsynthese hochregulieren, um die oxidierten zu ersetzen. Diese Reaktion wird bei anderen Krebszelllinien29 nicht beobachtet, was auf die metabolische Heterogenität von Krebszellen unter einer übermäßigen AAA-Diät hinweist30.
Zusätzlich zur multimodalen Bildgebung kann SRS markierungsfreie 3D-Bilder von LDs in Kontroll- und AAA-behandelten HeLa-Zellen rekonstruieren. Kurz gesagt, die Mikroskopie erzeugt eine Reihe von Querschnittsbildern in einer ausgewählten Region von Interesse. In dieser Studie wurde der stimulierte Raman-Verlust (SRL) auf 2.845 cm-1 eingestellt und mit einer Schrittweite von 1 μm von der obersten zur unteren Schicht abgetastet (Abbildung 4A). Quantitative Analysen von 3D-Lipidtröpfchen zeigen, dass die LDs in AAA-behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle abnahmen, aber in der Anzahl zunahmen (Abbildung 4B,C). Das erhöhte Vorhandensein von sperrigen hydrophoben Aminosäuren wie Tryp und Phe kann die Funktion von LD-Beschichtungsproteinen beeinträchtigen. Dies reduziert letztendlich die Lipolyse, die zahlreiche kleine LDs ansammelt. Die Ergebnisse der markierungsfreien volumetrischen 3D-SRS-Bildgebung dieser Studie bestätigen frühere Studien, indem sie sichtbar machen, dass überschüssige AAA-behandelte Zellen zahlreiche kleinere LDs aufweisen31,32.
Abbildung 1: Eine Illustration der Bildaufnahme und -analyse mit DO-SRS und 2PEF. (A) Eine 3D-Bildrekonstruktion und -analyse zur Erfassung der Lipidtröpfchenanzahl, des Volumens und des sphärischen Scores. (B) Hyperspektrale Bildgebung und Analyse von Deuterium-markiertem Lipid (CDL; 2.145 cm-1), Lipid (2.845 cm-1), Deuterium-markiertem Protein (CDP; 2.175 cm-1), Protein (2.940 cm-1), ungesättigtem Lipid (3.011 cm-1), gesättigtem Lipid (2.880 cm-1), NADH und Flavin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Physikalischer Aufbau der spontanen Raman-Spektroskopie und der stimulierten Raman-Streumikroskopie. (A) Spontane Raman-Spektroskopie, die für diese Studie verwendet wurde. (B) Probe spontaner Raman-Spektren für CD-Etikett (rot), ohne CD-Etikett (schwarz), Kontrollgruppe (blau, durchgezogene Linie), 15x Phe-behandelte Gruppe (rot, gestrichelte Linie) und 15x Tryp-behandelte Gruppe (rosa, gestrichelte Linie). (C) Schematische Darstellung des für diese Untersuchung verwendeten stimulierten Raman-Streumikroskopie-Aufbaus. (D) Stimulierter Raman-Streumikroskopie-Aufbau, der als DO-SRS- und 2PEF-Plattform verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Visualisierung der Stoffwechseldynamik in HeLa-Zellen mittels DO-SRS- und 2PEF-Mikroskopie. (A) Deuterium-markiertes Lipid (2.145 cm-1), Lipid (2.845 cm-1), Deuterium-markiertes Protein (2.175 cm-1), Protein (2.940 cm-1), visualisiert in HeLa-Zellen unter Kontrolle (Ctrl), 15x Phenylalanin (15x Phe) und 15x Tryptophan (15x Tryp) mit der DO-SRS-Plattform. Die Lipidumsatzrate und die Proteinumsatzrate wurden als 
und berechnet. Die RAW-Bilder wurden zunächst vom PBS-Signal subtrahiert, um die Hintergrundintensität zu entfernen, und maskiert, um die Intensität außerhalb der Zellen mit ImageJ zu entfernen. Für die ratiometrische Analyse wurde eine pixelweise Division durchgeführt. (B) NADH- und Flavin-Kanäle, die mit 2PEF-Mikroskopie visualisiert wurden, und ungesättigtes Lipid (3.011 cm-1) und gesättigtes Lipid (2.880 cm-1), das mit markierungsfreier SRS-Mikroskopie visualisiert wurde. Das optische Redoxverhältnis und das Sättigungsverhältnis wurden mit 
und 
berechnet. (C-F) Quantifizierung der ratiometrischen Intensitäten für jede kontrollierte HeLa-Zelle, 15x Phe und 15x Tryp Bedingungen. Die statistische Differenz wurde verwendet, um überschüssige AAA-Bedingungen mit den Kontrollbedingungen zu vergleichen. p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05 wurden aus einem Zwei-Wege-ANOVA-Test berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Visualisierung der 3D-Lipidtröpfchenverteilung einer einzelnen HeLa-Zelle mit einem markierungsfreien SRS-Mikroskop. (A) SRS 3D-Lipidtröpfchen-Volumenprojektion in HeLa-Zellen unter Kontrolle und überschüssigen AAA-Bedingungen. Der Schwellenwert wurde vor der Analyse definiert und zeigte die Signalverteilung der Lipidtröpfchen. (B,C) Quantifizierung des Lipidtröpfchenvolumens und der Lipidanzahl innerhalb einzelner HeLa-Zellen unter Kontrollgruppe und überschüssigen AAA-Bedingungen unter Verwendung des Zwei-Wege-ANOVA-Tests. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
DO-SRS- und 2PEF-Bildgebung wurden eingesetzt, um die Stoffwechseldynamik in verschiedenen Ex-vivo-Modellen zu untersuchen, darunter Drosophila und menschliches Gewebe 21,22,23,24,26,27,33. Die in dieser Studie verwendete Bildgebungsmodalität integriert DO-SRS und 2PEF-Mikroskopie, die andere molekülspezifische Bildgebungsmethoden übertreffen kann, indem sie die Notwendigkeit einer Molekülextraktion oder Markierung mit zytotoxischen Reagenzien eliminiert und eine minimale Probenvorbereitung erfordert. Insbesondere ermöglicht uns die DO-SRS-Mikroskopie, die de novo Lipogenese und Proteinsynthese in Tieren und Zellen zu untersuchen und ihre metabolische Dynamik in situ sichtbar zu machen 23,27,34. 2PEF erfasst die Autofluoreszenzsignale von natürlich vorkommenden Biomolekülen wie Flavin und NADH in biologischen Proben35,36. Die Eindringtiefe der Bildgebung von SRS kann bis zu 200-500 μm in weniger streuenden Proben erreichen37. Mit Tissue-Clearing-Methoden wie Harnstoff kann sich die Eindringtiefe um mehr als das Zehnfache erhöhen37. Die Kopplung von SRS mit 2PEF ermöglicht es uns, endogene Fluorophore wie Flavin und NADH in biologischen Proben abzubilden, wodurch exogene Biomarker für den Nachweis überflüssig werden. 2PEF kann eine Eindringtiefe von 500 μmerreichen 38. Im Vergleich zu anderen Multiplex-Bildgebungsmodalitäten, wie z. B. der konfokalen Mehrfarben-Einzelphotonen-Fluoreszenzmikroskopie, können sowohl DO-SRS als auch 2PEF eine deutlich größere Eindringtiefe ohne zytotoxische exogene Biomarker erreichen.
Um die räumliche Auflösung von DO-SRS und 2PEF zu erhöhen, haben wir ein auf adaptiver Momentenschätzung (Adam) basierendes Pointillismus-Dekonvolutionswerkzeug (A-PoD) entwickelt34. A-PoD kann beugungsbegrenzte DO-SRS- und 2PEF-Bilder in superaufgelöste Bilder umwandeln, ohne dass Hardwareverbesserungen erforderlich sind. Darüber hinaus enthält das Raman-Spektrum viele spezifische chemische Schwingungsmodi, die genutzt werden können, um die Anzahl der nachweisbaren Moleküle zu erhöhen. Unter Ausnutzung dieses Vorteils hat unser Labor außerdem eine bestrafte Referenz-Matching-Methode (PRF) entwickelt, um mehrere Lipidspezies in Zell- und Gewebemodellen zu unterscheiden36. Diese beiden technischen Entwicklungen eröffnen neue Wege für die detailliertere Untersuchung biologischer Prozesse auf zellulärer und subzellulärer Ebene, die zur Charakterisierung von Stoffwechselveränderungen im Gehirn, Krebs und Alterungsprozessen verwendet wurden26,27,35.
Eine wesentliche Einschränkung dieses Protokolls ist die Konzentration und die zeitliche Inkubation von zellulären Proben mitD2O, um eindeutige, quantifizierbare C-D-Raman-Banden zu erzeugen. Robustere, metabolisch aktive Zelllinien, wie z. B. HeLa-Zellen, können Deuteriumatome schneller in neu synthetisierte Makromoleküle einbauen als nicht erkrankte Säugetierzelllinien, wie z. B. menschliche embryonale Nierenzellen (HEK), was zu verschiedenen C-D-Intensitäten führt, die für die gleiche Konzentration und Inkubationszeit mitD2Oin zwei verschiedenen Zelllinien beobachtet werden21. Darüber hinaus kann die Verabreichung vonD2Oin einer Konzentration von 80 % oder mehr über einen Zeitraum von 48 Stunden zu einer Toxizität für zelluläre Proben führen. Ein Optimierungsexperiment zur Identifizierung der optimalenD2O-Konzentrationund Zeitinkubation ist notwendig, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen.
Ein kritischer Aspekt des Protokolls ist die Integration von DO-SRS und 2PEF-Bildgebung. Typischerweise teilen sich DO-SRS- und 2PEF-Modalitäten den gleichen Pikosekunden-Anregungslaser, da seine schmale Bandbreite mit SRS- und 2PEF-Signalen optimiert werden kann. Obwohl unsere Technologie selbst entwickelt wurde, ist diese Plattform kommerziell erhältlich39. Um das Raman-Signal zu detektieren, sind zusätzliche Geräte erforderlich, wie z. B. zwei synchronisierte Laserpulse mit einem Modulator, einem Fotodiodendetektor, einem Lock-in-Verstärker und den gemeinsamen Anstrengungen eines Rastermikroskops. D2O kann ohne weiteres von Biotechnologieanbietern erworben werden. Daher können Forscher sehr einfach auf diese Technologie zugreifen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Yajuan Li und Anthony Fung für ihre technische Unterstützung und dem Fraley-Labor für die Zelllinie. Wir bedanken uns für die Anschubfinanzierung von UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 und Hellman Fellow Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
References
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