Summary
Vi præsenterer en protokol til direkte visualisering af metaboliske aktiviteter i celler reguleret af aminosyrer ved hjælp af deuteriumoxid (tungt vand D2O) sondet stimuleret Raman-spredning (DO-SRS) mikroskopi, som er integreret med to-foton excitation fluorescens mikroskopi (2PEF).
Abstract
Essentielle aromatiske aminosyrer (AAA'er) er byggesten til syntetisering af nye biomasser i celler og opretholdelse af normale biologiske funktioner. For eksempel er en rigelig forsyning af AAA'er vigtig for kræftceller for at opretholde deres hurtige vækst og deling. Med dette er der en stigende efterspørgsel efter en meget specifik, ikke-invasiv billeddannelsesmetode med minimal prøveforberedelse til direkte visualisering af, hvordan celler udnytter AAA'er til deres stofskifte in situ. Her udvikler vi en optisk billeddannelsesplatform, der kombinerer deuteriumoxid (D2O) sondering med stimuleret Raman-spredning (DO-SRS) og integrerer DO-SRS med to-foton excitationsfluorescens (2PEF) i et enkelt mikroskop for direkte at visualisere HeLa-cellernes metaboliske aktiviteter under AAA-regulering. Samlet set giver DO-SRS-platformen høj rumlig opløsning og specificitet af nyligt syntetiserede proteiner og lipider i enkelte HeLa-celleenheder. Derudover kan 2PEF-modaliteten detektere autofluorescenssignaler af nicotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) og Flavin på en etiketfri måde. Det billeddannelsessystem, der beskrives her, er kompatibelt med både in vitro- og in vivo-modeller , som er fleksibelt til forskellige forsøg. Den generelle arbejdsgang i denne protokol inkluderer cellekultur, tilberedning af kulturmedier, cellesynkronisering, cellefiksering og prøvebilleddannelse med DO-SRS- og 2PEF-modaliteter.
Introduction
At være essentielle aromatiske aminosyrer (AAA'er), phenylalanin (Phe) og tryptophan (Tryp) kan absorberes af menneskekroppen for at syntetisere nye molekyler til opretholdelse af normale biologiske funktioner1. Phe er nødvendig til syntese af proteiner, melanin og tyrosin, mens Tryp er nødvendig til syntese af melatonin, serotonin og niacin 2,3. Imidlertid kan overskydende forbrug af disse AAA'er opregulere pattedyrets mål for rapamycin (mTOR) -vejen, hæmme AMP-aktiveret proteinkinase og forstyrre mitokondriemetabolismen, kollektivt ændre makromolekylebiosyntese og føre til produktion af ondartede forstadier, såsom reaktive iltarter (ROS) i raske celler 4,5,6. Direkte visualisering af ændret metabolisk dynamik under overskydende AAA-regulering er afgørende for at forstå AAA's roller i at fremme kræftudvikling og vækst af sunde celler 7,8,9.
Traditionelle AAA-undersøgelser er afhængige af gaskromatografi (GC)10. Andre metoder, såsom magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), har begrænsede rumlige opløsninger, hvilket gør det svært at udføre cellulær og subcellulær analyse af biologiske prøver11. For nylig er matrixassisteret laserdesorption / ionisering (MALDI) blevet udviklet til at belyse AAA'ernes rolle i lipid- og proteinsynteser i kræftproliferation med ikke-invasive biomarkører12,13,14. Denne teknik lider dog stadig af lave billeddybder, dårlig rumlig opløsning og omfattende prøveforberedelse. På celleniveau kan ikke-toksiske stabile isotoper, såsom nitrogen-15 og kulstof-13, spores med multiisotopbilleddannelse og nanoskala sekundær ionmassespektrometri for at forstå deres inkorporering i makromolekyler. Disse metoder er imidlertid ødelæggende for levende biologiske prøver15,16. Atomkraftmikroskopi (AFM) er en anden kraftfuld teknik, der kan visualisere metabolisk dynamik17. Den langsomme scanningshastighed under AFM-billeddannelse kan på den anden side forårsage billedforvrængning af resultatet fra termisk drift.
Vi udviklede en ikke-invasiv biortogonal billeddannelsesmodalitet ved at koble deuteriumoxid (D2O) sondet stimuleret Raman-spredning (DO-SRS) mikroskopi og etiketfri to-foton excitation fluorescens mikroskopi (2PEF). Denne modalitet opnår en høj rumlig opløsning og kemisk specificitet ved billeddannelse af biologiske prøver 18,19,20,21,22,23,24. Denne protokol introducerer anvendelserne af DO-SRS og 2PEF til at undersøge den metaboliske dynamik af lipider, protein og redoxforholdsændringer under kræftprogressioner. Da D2O er en stabil isotopform af vand, kan cellulære biomolekyler mærkes med deuterium (D) på grund af dets hurtige kompensation med total kropsvand i celler, der danner carbon-deuterium (C-D) bindinger gennem enzymatisk udveksling21. C-D-bindingerne i nyligt syntetiserede makromolekyler, herunder lipider, proteiner, DNA / RNA og kulhydrater, kan detekteres i celletavsområdet i Raman-spektret 20,21,22,25,26,27. Med to synkroniserede laserpulser kan C-D-bindinger af nyligt syntetiserede lipider og proteiner vises på enkeltceller via hyperspektral billeddannelse (HSI) uden at ekstrahere eller mærke dem med cytotoksiske midler. Derudover har SRS-mikroskopi evnen til at konstruere tredimensionelle (3D) modeller af udvalgte områder af interesse for biologiske prøver ved at fange og kombinere et sæt tværsnitsbilleder22,26. Med hyperspektral og 3D volumetrisk billeddannelse kan DO-SRS opnå rumlige fordelinger af nyligt syntetiserede makromolekyler i enkeltceller sammen med den type organeller, der letter processen med at fremme kræftvækst under AAA-regulering22. Desuden kan vi ved hjælp af 2PEF opnå autofluorescenssignaler af Flavin og nicotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) med høj opløsning, dyb penetrationsdybde og skader på lavt niveau i biologiske prøver21,23,24. Flavin og NADH autofluorescens signaler er blevet brugt til at karakterisere redoxhomeostase og lipidperoxidering i kræftceller22,26. Som sådan giver koblingen af DO-SRS og 2PEF ikke kun subcellulær analyse af AAA-reguleret metabolisk dynamik i kræftceller med høj rumlig fordeling, kemisk specificitetsinformation og minimal prøveforberedelse, men metoden reducerer også behovet for at ekstrahere eller mærke endogene molekyler med toksiske reagenser. I denne protokol præsenterer vi først procedurerne for D2O og aminosyrepræparation samt kræftcellekultur. Derefter viser vi protokollerne for DO-SRS-billeddannelse og 2PEF-billeddannelse. Endelig præsenterer vi de repræsentative resultater af SRS og 2PEF-billeddannelse, som demonstrerer AAA-regulerede metaboliske ændringer af lipider og protein og ændringer i redoxforholdet i kræftceller. En detaljeret illustration af processen er fremhævet i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af medier
- Forbered 10 ml kontrol og overskydende AAA'er i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 50% D2O.
- Til kontrolmediet måles og blandes 10 mg DMEM-pulver med 4,7 ml dobbeltdestilleret vand (ddH2O) i et 15 ml konisk rør. DMEM-pulveret indeholder alle aminosyrerne i standardkoncentrationer. Grundigt hvirvel og vend røret for at sikre, at opløsningen er godt blandet. Tilsæt 4,7 ml D2O, 0,5 ml føtalt bovint serum (5% FBS) og 0,1 ml penicillin / streptomycin (1%). Grundigt hvirvel og vend røret for at sikre, at opløsningen er godt blandet.
- Til 15x Phe-behandlingsmediet måles og blandes 10 mg DMEM-pulver med 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5%) og 0,1 ml penicillin/streptomycin (1%) i et 15 ml konisk rør. Grundigt hvirvel og vend røret for at sikre, at opløsningen er godt blandet. Der tilsættes overskydende Phe-pulver i en koncentration på 924 mg/l til mediet. Grundigt hvirvel og vend røret for at sikre, at opløsningen er godt blandet.
- Til 15x Tryp-behandlingsmediet måles og blandes 10 mg DMEM-pulver med 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5%) og 0,1 ml penicillin/streptomycin (1%) i et 15 ml konisk rør. Grundigt hvirvel og vend røret for at sikre, at opløsningen er godt blandet. Tilsæt overskydende Tryp pulver i en koncentration på 224 mg/l til mediet. Grundigt hvirvel og vend røret for at sikre, at opløsningen er godt blandet.
- Tilsæt methionin og threonin ved henholdsvis 30,0 mg / ml og 95,0 mg / ml til alle koniske rør i de foregående trin. Grundigt hvirvel og inverter røret. Natriumpyruvat skal ikke tilsættes til kulturmediet.
- Kontrol- og behandlingsmediet filtreres med et 25 mm sprøjtefilter med 0,22 μm polyethersulfonmembranfiltre.
- Alle medieindeholdte koniske rør forsegles med parafilm og opbevares ved 4 °C i op til 3 uger. Før cellerne behandles med medier, opvarmes alle medier til 37 °C.
BEMÆRK: Pulver- og væskereagenserne skal måles og kombineres baseret på det samlede volumen af behandlings- og kontrolmedier.
2. Forberedelse af celleprøve
- Oprethold livmoderhalskræftceller (HeLa) i en dyrkningskolbe (dvs. T10, T25 osv.) ved hjælp af standard DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin ved 37 ° C og 5% kuldioxid (CO2).
- Subkultur HeLa-cellerne i et splitforhold på 1:10, indtil de når 80% eller højere cellelevedygtighed.
- Når cellerne opnår 80% eller højere sammenløb, fortsæt med at frø 2 x 10 5 celler pr. Brønd på en 24-brøndplade ved hjælp af DMEM suppleret med0,5 % FBS og 1% penicillin / streptomycin.
- Før cellesåning fremstilles en 24-brøndplade med steriliserede, poly-d-lysin, lamininbelagte, runde dæksedler, 12 mm i diameter. Nedsænk dækslerne i 70% ethanol og tør forsigtigt med fnugfri servietter. Anbring de rene dæksler i de relevante huller på pladen.
- Når cellerne når 80% sammenløb i trin 2.2, vaskes cellerne en gang med 1x fosfatbufret saltvand (PBS) uden magnesium og calciumioner.
- Der tilsættes 0,25% trypsin for at adskille de vedhængende celler fra kolben og inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 3 minutter.
- Der tilsættes DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin, pipetteres forsigtigt op og ned, og cellerne opsamles ved centrifugering ved 300 x g ved stuetemperatur (RT) i 3 min.
- Resuspendere cellerne i DMEM suppleret med 0,5% FBS og 1% penicillin/streptomycin.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer, lysmikroskop og trypanblåt, og frø en densitet på 2 x 105 celler pr. Brønd i en 24-brøndplade. Alternativt kan en automatiseret celletæller bruges til at tælle cellerne.
- Returner cellerne til inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2, og ryst forsigtigt pladen for at fordele cellerne jævnt.
- Efter 8 timer udskiftes de gamle kulturmedier med 50% D 2 O/overskydende Phe eller 50% D2O/overskydende Tryp medier. Cellerne hældes tilbage i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i 36 timer.
- Efter 36 timer fastgøres cellerne på mikroskopglas.
- Før fastgørelse skal du forberede mikroskopglas med billedafstandsstykker 9 mm i diameter og placere 15 μL 1x PBS suppleret med calcium- og magnesiumioner.
- Skyl cellerne med 1x PBS suppleret med calcium- og magnesiumioner.
- Tilsæt 0,5 ml 4% methanolfri paraformaldehyd (PFA) opløsning og lad pladen stå under biosikkerhedshætten i ca. 15 minutter.
- PFA-opløsningen suges til synk og skyl med 1x PBS suppleret med calcium- og magnesiumioner to gange.
- Tilsæt 1,5 ml 1x PBS suppleret med calcium- og magnesiumioner i hver brønd.
- Brug steril pincet til forsigtigt at få fat i dæksedlerne ud af hver brønd. Vend og anbring den celleholdige side af dæksedlerne på billedafstandsstykkerne for at komme i kontakt med PBS forberedt i trin 2.5.1. Sørg for, at den ikke-celleholdige side udsættes for luft.
- Brug gennemsigtig neglelak til at forsegle det ydre lag af dækselen med billedafstandsstykket.
- Opbevar mikroskopets dias ved 4 °C, når der ikke er billeddannelse.
3. Spontan Raman-spektroskopimåling (figur 2)
- Brug et konfokal Raman-mikroskop til at opnå spontane Raman-spektre (figur 2A).
- Tænd laseren ved at dreje nøglen til positionen ON .
- Dobbeltklik på LabSpec6-softwareikonet for at åbne anskaffelsessoftwaren.
- Læg den biologiske prøve på prøveholderen direkte under objektivlinsen.
- Klik på Kamera på softwaren ikon for at tænde videokameraet.
- Juster fokusplanet for at identificere et interesseområde med 50x objektivet. Flyt joysticket for at styre planeroversættelsen af XY-trinnet, og drej joysticket for at ændre fokusdybden.
- Når du har valgt målepositionen, skal du skifte til 100x objektivobjektivet med 40 mW excitationseffekt. Klik på det røde Stop-ikon for at slukke for videokameraet.
- Vælg en rist på 1800 linjer/mm, og indstil anskaffelsesområdet fra 400 cm-1 til 3.150 cm-1.
- Indstil anskaffelsestiden til 90 s, akkumuleringen til 3 og binningen til 4 for det mindste støj og mest nøjagtige spektrum.
BEMÆRK: Disse billeddannelsesparametre kan optimeres, så de passer til eksperimentet. - Klik på pilikonet for at aktivere realtidsvisningen.
- Indstil Raman-skiftet (cm-1) til en værdi efter eget valg for at finjustere fokusplanet.
BEMÆRK: I dette eksperiment blev Raman-laseren fokuseret på lipiddråberne, som indeholdt en høj koncentration afCH2-bindinger . Derfor blev der valgt et Raman-skift på 2.850 cm-1, der matchedeCH2-bindingens strækningstilstande. - Juster fokusplanet med joysticket for at optimere det bedste signal-støj-forhold.
- Når du har valgt fokusplanet, skal du klikke på det røde Stop-ikon for at få vist det i realtid.
- Vælg cirkelikonet for at starte spektrumoptagelsen.
- Når det cellulære område er taget, skal du bruge det samme fokusplan til at måle baggrunden med PBS. Træk baggrundsspektret fra hvert subcellulært målspektrum ved hjælp af en separat computersoftwareapplikation, såsom Origin (figur 1B).
4. Billeddannelseseksperimenter med 2PEF og SRS
BEMÆRK: Detaljerede beskrivelser af SRS-laserjustering findes i en tidligere rapport28. Denne protokol fokuserer på driften af et multimodalt SRS- og 2PEF-billeddannelsessystem (figur 2C, D).
- Klik på Start for at varme laseren op.
- Følg rækkefølgen for at indstille hovedafbryderne på styreenheden og skærmen på: 1) tryk på hovedkontakten på kontrolboksen IX3-CBH til Til, 2) tryk på hovedkontakten på berøringspanelcontrolleren til Til, 3) tryk på hovedafbryderen på vekselstrømsadapteren til strømforsyningen til LD OBIS 6 Laser Remote tilsluttet hovedlaserkombinereren FV31-SCOMB til Til, og 4) tryk på hovedafbryderen på vekselstrømsadapteren til LD OBIS 6 Laser Remote, der er tilsluttet sublaserkombinereren FV31-SCOMB, til Til.
- Tryk på hovedafbryderne på Si-fotodiodedetektoren og låseforstærkeren Til.
- Indstil Stokes Beam til 1.031 nm, pulsbredde til 6 ps og gentagelseshastighed til 80 MHz.
- Koblet ind i mikroskopet indstilles picoEmerald-systemet, der leveres med den synkroniserede pumpestråle med en justerbar bølgelængde fra 720-990 nm, en pulsbredde på 5-6 ps og en gentagelseshastighed på 80 MHz. Den gennemsnitlige excitationseffekt for både pumpen og Stokes er 450 mW. Optimer excitationskraften for at minimere fotoskader for prøven.
- Brug en oliekondensator med høj numerisk blænde (NA) (dvs. 1,4 NA) til at opsamle Stokes og pumpebjælker, hvor prøven monteres ved at udsende et par dråber på kondensatoren.
- Monter prøven på olien og læg en stor vanddråbe oven på mikroskopglasset, hvor prøven er fastgjort. Dette er til objektivobjektivet til nedsænkning i vand.
- Indstil låseforstærkeren til 20 MHz. Behandl billedet nu ved hjælp af softwaremodulet med superopløsning.
- Vælg 512 pixels x 512 pixels og 80 μs/pixel som opholdstid.
- Når det ønskede cellulære område er fokuseret korrekt, skal du erhverve billedet. Brug mikroskopets erhvervelsessoftware til at gemme billederne som en Olympus .oir grafisk fil.
- Få et baggrundsbillede ved 1.900 cm-1 og træk det fra alle cellulære billeder.
- For at udføre 2PEF-billeddannelse skal du bruge den samme justerbare picosekundlaser og indstille den etiketfri autofluorescens af Flavin og NADH til henholdsvis 800 nm og 780 nm.
- Brug en 460 nm/515 nm filterterning til at opsamle Flavin og NADH autofluorescens backscattered emission.
- Juster opholdstiden til 8 μs/pixel og pixelstørrelsen til 512 pixel x 512 pixels. Indstil laserlukkereffektparameteren til 150 mW.
- For 3D-billedrekonstruktion skal du indstille det stimulerede Raman-tab til 2.850 cm-1 (797 nm).
- Når de ønskede enkeltceller er identificeret, skal du registrere laseren til scanning fra det øverste fokusplan for at detektere de øverste og nederste lag af disse celler.
BEMÆRK: 3D-modeller genereres og gemmes som .oir-filer.
5. Spektre og billedanalyse
- Spektre analyse
- Brug Origin-softwaren eller andre relevante programmer til at trække baggrundsspektret fra alle subcellulære målspektre.
- Brug MATLABs matematiske modelleringsoperationer til at behandle Raman-spektrene med softwarens indbyggede funktioner. Python kan også bruges til spektrebehandling.
- Spektral forbehandling begynder med at konvertere filerne til et array. Spektrene interpoleres ved hver gensidig centimeter.
- Til validering skal du tegne grafen over de rå data. Udfør baselinekorrektionen på de rå spektre ved hjælp af den indbyggede funktion msbackadj i MATLAB. Kort fortalt estimerer den indbyggede funktion basispunkter ved separationsenhedsværdier, der er identificeret af brugerne, og returnerer afstanden mellem tilstødende vinduer. Fra basispunkterne estimeres og tegnes en regressionslinje. Anvend udjævning for at udjævne regressionslinjen for at trække basislinjen fra hvert enkelt råspektrum.
- Udfør min-max normalisering ved at dividere Raman-intensiteten af proteinet ved 2.930 cm-1 med intensiteten af hvert Raman-skift. 2.930 cm-1 signalet er typisk den højeste intensitet på Raman-spektret. Med denne normalisering omdannes den maksimale værdi til en 1, mens minimumsværdien omdannes til en 0. Hver anden værdi omdannes til en decimal mellem 0 og 1.
- Gennemsnit de enkelte spektre af samme tilstand i et enkelt spektrum for at reducere støj.
- Når de er behandlet, skal du bruge applikationer, såsom Origin, til at vise alle spektrene samtidigt. De toppe, der vises i spektrene, repræsenterer en specifik kemisk binding eller funktionel gruppe.
- 3D-billedanalyse af lipiddråber
- Brug FIJI-ImageJ-software til at behandle alle 3D-billeder
- Udfør funktionerne Bandpass-filtre og udjævning til 3D-billedstakke.
- Til 3D-billedanalyse skal du tildele hver lipiddråbe til en sfærisk score beregnet ved at måle afstanden mellem dens massecenter og overfladen. Sammenlign hver sfærisk score med en sfærisk score af en perfekt kugle på den samme euklidiske plan. Kassér lipiddråber med lave sfæriske scorer og evaluer de resterende lipiddråber for deres volumen og antal.
- Analyser volumen og antal lipiddråber mellem forskellige behandlinger for statistisk signifikans på en passende statistisk softwareapplikation. Her blev GraphPad Prism brugt.
- 2D hyperspektral billedanalyse
- Brug FIJI-ImageJ-software til at behandle alle 2D hyperspektrale billeder.
- Vælg kanalen 2.930 cm-1 for at oprette et maskebillede, der indeholder værdierne 0 og 1. Tildel baggrunden til 0 og mobilområdet til 1.
- Træk den deuteriummærkede proteinkanal (2.175 cm-1) til baggrundskanalen (1.900 cm-1) for at fjerne de fluorescerende virkninger.
- Opdel den resulterende deuteriummærkede proteinkanal med proteinkanalen (2,930 cm-1) for at opnå proteinomsætningshastighedsforholdmetriske billeder.
- Multiplicer derefter maskebilledet i trin 5.3.2 med ratiometriske billeder for at fjerne eventuel resterende baggrundsstøj. Som et resultat genereres en mørk baggrund i hvert ratiometrisk billede.
- Brug værktøjet Frihåndsmarkering i FIJI-ImageJ til manuelt at segmentere og beregne pixelintensiteter, der vises på enkelte celler. Pixelintensiteterne svarer til koncentrationerne af den kemiske binding, der visualiseres.
- Analyser pixelintensiteterne for statistisk signifikans på et passende statistisk softwareprogram. Her blev GraphPad Prism brugt. Gentag denne analyse med den resterende ratiometriske analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tilsætningen af overskydende AAA'er ved 15x koncentrationer til de 50% D2O-holdige cellekulturmedier producerede forskellige C-D Raman-bånd af nyligt syntetiserede lipider og proteiner i HeLa-celler (figur 2B). Tidligere eksperimenter blev udført med forskellige koncentrationsniveauer, såsom 2x og 5x, og selvom dataene ikke præsenteres, producerede 15x-koncentrationen de mest tydelige C-D Raman-bånd af nyligt syntetiserede lipider og proteiner. Specifikt ved at undersøge lipiddråber (LD'er) bemærkede vi, at både 15x Phe og 15x Tryp inducerede nyligt syntetiserede lipider og proteinsignaler ved henholdsvis 2,143 cm-1 og 2,172 cm-1. DO-SRS blev efterfølgende brugt til at visualisere den rumlige fordeling af C-D-signaler på enkeltceller (figur 3). Ved hjælp af ImageJ blev pixelintensiteterne for individuelle celler manuelt segmenteret og beregnet, som angivet med stiplede hvide kanter i figur 3A. Kontrolcellerne viser moderate C-D lipid- og proteinbånd; dog viser 15x Phe og 15x Tryp stærkere C-D lipid- og proteinbånd. Kvantitativ analyse indikerer, at overskydende AAA'er kan opregulere lipidsyntese med 10% -17%, men nedregulere proteinsyntese med 10% (figur 3C, D). Resultaterne udleder muligheden for mangel på autofagi, der akkumulerer nyligt syntetiserede lipider, fremmer mitokondriel dysfunktion og inducerer oxidativ ubalance under overskydende AAA-regulering7.
Etiketfri multimodal SRS og 2PEF-billeddannelse af umættet lipid (~ 3.011 cm-1), mættet lipid (~ 2.880 cm-1) og NADH, Flavin blev erhvervet for at forstå virkningerne af AAA'er på kræftmetabolisme. På samme måde blev pixelintensiteter for individuelle celler manuelt segmenteret og beregnet ved hjælp af ImageJ, som angivet med stiplede hvide kanter i figur 3B. Ratiometrisk analyse af AAA-behandlede celler viser en stigning på 10% i umættet lipid / mættet lipid og en 50% stigning i Flavin / Flavin + NADH (figur 3E, F). I mitokondriernes elektrontransportkæde kan ROS genereres ved overførsel af elektroner fra NADH og FADH2 til molekylære oxygenarter. Akkumuleringen af ROS i mange kræftceller resulterer i en oxidativ ubalance, der oxiderer umættede fedtsyrer, fremmer mættet fedtsyresyntese og udtømmer NADH-autofluorescenssignaler. Derfor er den observerede stigning i Flavin / Flavin + NADH en indikator for akkumuleret ROS, der reducerer NADH-autofluorescenssignaler. Som reaktion på oxidativ ubalance kan HeLa-celler opregulere deres umættede lipidsyntese for at erstatte de oxiderede. Dette respons observeres ikke i andre kræftcellelinjer29, hvilket betyder den metaboliske heterogenitet af kræftceller under en overskydende AAA-diæt30.
Ud over multimodal billeddannelse kan SRS rekonstruere etiketfrie 3D-billeder af LD'er i kontrol- og AAA-behandlede HeLa-celler. Kort sagt genererer mikroskopi et sæt tværsnitsbilleder i et udvalgt område af interesse. I denne undersøgelse blev det stimulerede Raman-tab (SRL) indstillet til 2.845 cm-1 og scannet fra det øverste lag til bundlaget med en trinstørrelse på 1 μm (figur 4A). Kvantitative analyser af 3D-lipiddråber afslører, at LD'er reduceret i størrelse, men steg i antal i AAA-behandlede celler sammenlignet med kontrollen (figur 4B, C). Den øgede tilstedeværelse af voluminøse hydrofobe aminosyrer, såsom Tryp og Phe, kan forringe funktionen af LD-belægningsproteiner. Dette reducerer i sidste ende lipolyse, som akkumulerer adskillige små LD'er. De etiketfri 3D SRS volumetriske billeddannelsesresultater fra denne undersøgelse bekræfter tidligere undersøgelser ved at visualisere, at overskydende AAA-behandlede celler udviser adskillige mindre LD'er31,32.
Figur 1: En illustration af billedoptagelse og analyse med DO-SRS og 2PEF. (A) En 3D-billedrekonstruktion og analyse for at erhverve lipiddråbeantal, volumen og sfærisk score. (B) Hyperspektral billeddannelse og analyse af deuteriummærket lipid (CDL; 2,145 cm-1), lipid (2,845 cm-1), deuteriummærket protein (CDP; 2,175 cm-1), protein (2,940 cm-1), umættet lipid (3,011cm-1), mættet lipid (2,880 cm-1), NADH og flavin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fysisk opsætning af spontan Raman-spektroskopi og stimuleret Raman-spredningsmikroskopi . (A) Spontan Raman-spektroskopiopsætning anvendt til denne undersøgelse. (B) Prøve spontane Raman-spektre til CD-etiket (rød), uden CD-etiket (sort), kontrolgruppe (blå, solid linje), 15x Phe-behandlet gruppe (rød, stiplet linje) og 15x Tryp-behandlet gruppe (lyserød, stiplet linje). (C) Skematisk diagram over den stimulerede Raman-spredningsmikroskopiopsætning, der anvendes til denne undersøgelse. (D) Stimuleret Raman-spredningsmikroskopiopsætning, der bruges som DO-SRS- og 2PEF-platform. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Visualisering af metabolisk dynamik i HeLa-celler ved hjælp af DO-SRS og 2PEF-mikroskopi. (A) Deuteriummærket lipid (2.145 cm-1), lipid (2.845 cm-1), deuteriummærket protein (2.175 cm-1), protein (2.940 cm-1) visualiseret i HeLa-celler under kontrol (Ctrl), 15x phenylalanin (15x Phe) og 15x tryptophan (15x Tryp) med DO-SRS-platformen. Lipidomsætningshastighed og proteinomsætningshastighed blev beregnet som 
og 
. Raw-billeder blev først trukket fra PBS-signalet for at fjerne baggrundsintensitet og maskeret for at fjerne intensitet uden for cellerne ved hjælp af ImageJ. Pixelvis division blev udført til ratiometrisk analyse. (B) NADH- og Flavin-kanaler visualiseret med 2PEF-mikroskopi og umættet lipid (3.011 cm-1) og mættet lipid (2.880 cm-1) visualiseret med etiketfri SRS-mikroskopi. Optisk redoxforhold og mætningsforhold blev beregnet med 
og 
. (C-F) Kvantificering af ratiometriske intensiteter for hver HeLa-celle under kontrol, 15x Phe og 15x Tryp betingelser. Den statistiske forskel blev brugt til at sammenligne overskydende AAA-betingelser med kontrolbetingelserne. p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05 blev beregnet ud fra en tovejs ANOVA test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Visualisering af 3D-lipiddråbefordeling af en enkelt HeLa-celle ved hjælp af et etiketfrit SRS-mikroskop. (A) SRS 3D-lipiddråbevolumenprojektion i HeLa-celler under kontrol og overskydende AAA-betingelser. Tærsklen blev defineret før analysen, hvilket afslørede lipiddråbesignalfordeling. (B,C) Kvantificering af lipiddråbevolumen og tællinger inden for individuelle HeLa-celler under kontrolgruppe og overskydende AAA-betingelser ved hjælp af tovejs ANOVA testen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DO-SRS og 2PEF billeddannelse er blevet anvendt til at undersøge metabolisk dynamik i forskellige ex vivo modeller, herunder Drosophila og humane væv 21,22,23,24,26,27,33. Den billeddannelsesmodalitet, der anvendes i denne undersøgelse, integrerer DO-SRS og 2PEF-mikroskopi, som kan overgå andre molekylespecifikke billeddannelsesmetoder ved at eliminere behovet for molekyleekstraktion eller mærkning med cytotoksiske reagenser og kræve minimal prøveforberedelse. Specifikt gør DO-SRS-mikroskopi os i stand til at undersøge de novo lipogenese og proteinsyntese i dyr og celler og visualisere deres metaboliske dynamik in situ23,27,34. 2PEF opfanger autofluorescenssignalerne fra naturligt forekommende biomolekyler, såsom Flavin og NADH, i biologiske prøver35,36. SRS' billedindtrængningsdybde kan opnå op til 200-500 μm i mindre spredningsprøver37. Med vævsrensningsmetoder som urinstof kan penetrationsdybden øges mere end ti gange37. Koblingen af SRS med 2PEF gør det muligt for os at afbilde endogene fluoroforer som Flavin og NADH i biologiske prøver, hvilket yderligere eliminerer behovet for eksogene biomarkører til detektion. 2PEF kan opnå en gennemtrængningsdybde på 500 μm38. Sammenlignet med andre multiplexbilleddannelsesmetoder, såsom flerfarvet enkeltfotonkonfokal fluorescensmikroskopi, kan både DO-SRS og 2PEF opnå en signifikant større penetrationsdybde uden cytotoksiske eksogene biomarkører.
For at øge den rumlige opløsning af DO-SRS og 2PEF udviklede vi et adaptivt øjebliksestimering (Adam)-baseret pointillisme dekonvolution (A-PoD) billedefterbehandlingsværktøj34. A-PoD kan konvertere diffraktionsbegrænsede DO-SRS- og 2PEF-billeder til superopløste uden behov for hardwareforbedringer. Derudover indeholder Raman-spektret mange specifikke kemiske vibrationstilstande, der kan udnyttes til at øge antallet af detekterbare molekyler. Ved at udnytte denne fordel har vores laboratorium yderligere genereret en straffet referencematchningsmetode (PRF) til at skelne mellem flere lipidarter i celle- og vævsmodeller36. Disse to tekniske udviklinger åbner nye muligheder for at studere biologiske processer mere detaljeret på cellulære og subcellulære niveauer, som er blevet brugt til at karakterisere metaboliske ændringer i hjerne-, kræft- og aldringsprocesser26,27,35.
En hovedbegrænsning i denne protokol er koncentrationen og tidsinkubationen af cellulære prøver med D2O for at producere forskellige, kvantificerbare C-D Raman-bånd. Mere robuste, metabolisk aktive cellelinjer, såsom HeLa-celler, kan inkorporere deuteriumatomer i nyligt syntetiserede makromolekyler hurtigere end ikke-syge pattedyrcellelinjer, såsom humane embryonale nyreceller (HEK), hvilket fører til forskellige C-D-intensiteter observeret for samme koncentration og tidsinkubation med D2O i to forskellige cellelinjer21. Endvidere kan administration af D2O i en koncentration på 80 % eller derover i 48 timer medføre toksicitet for celleprøver. Et optimeringseksperiment for at identificere den optimale D2O-koncentration og tidsinkubation er nødvendig for at opnå ønskelige resultater.
Et kritisk aspekt af protokollen er integrationen af DO-SRS og 2PEF-billeddannelse. Typisk deler DO-SRS- og 2PEF-modaliteter den samme picosekund-excitationslaser, da dens smalle båndbredde kan optimeres med SRS- og 2PEF-signaler. Selvom vores teknologi er hjemmebygget, er denne platform kommercielt tilgængelig39. Yderligere udstyr, såsom to synkroniserede laserimpulser med en modulator, fotodiodedetektor, en låseforstærker og et scanningsmikroskops fælles indsats er påkrævet for at detektere Raman-signalet. D2O kan let købes hos leverandører af bioteknologi. Derfor kan forskere få adgang til denne teknologi meget let.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Yajuan Li og Anthony Fung for deres tekniske support og Fraley-laboratoriet for cellelinjen. Vi anerkender opstartsmidlerne fra UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 og Hellman Fellow Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
References
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P.
- Parthasarathy, A., et al. A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29 (2018).
- Wang, H., et al. l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells. The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
- Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).
- Kimura, T., Watanabe, Y. Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction. Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).
- Ma, Q., et al. Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice. Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).
- Cheng, C., et al. Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).
- Lubes, G., Goodarzi, M. GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).
- Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R.
- Bowman, A. P., et al. Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).
- Pirman, D. A., et al. Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), e61379 (2013).
- Li, Z., et al. Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 2869 (2021).
- Miyagi, M., Kasumov, T. Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378 (2016).
- Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy. Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).
- Fung, A. A., Shi, L. Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501 (2020).
- Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).
- Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
- Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
- Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702 (2021).
- Li, Y., et al. Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy. Frontiers in Aging. 2, 819903 (2022).
- Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila. Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Fung, A. A., et al. Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism. Frontiers in Oncology. 12, 858017 (2022).
- Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes. Aging Cell. 21 (4), e13586 (2022).
- Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547 (2022).
- Rysman, E., et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).
- Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia. BMC Cancer. 19 (1), 501 (2019).
- Thiam, A. R., Dugail, I. Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function. Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).
- Schott, M. B., et al. Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes. The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).
- Hoang, K., et al. Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis. Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).
- Jang, H., et al. Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD. bioRxiv. , (2022).
- Li, Y., et al. Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, W., et al.
- Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
- Chang, T., et al. Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy. Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).
- Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/ (2023).
