Summary

Imagen química bioortogonal del metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos

Published: May 12, 2023
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Summary

Presentamos un protocolo para visualizar directamente las actividades metabólicas en células reguladas por aminoácidos utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada con sonda de óxido de deuterio (agua pesada D2O) (DO-SRS), que se integra con microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones (2PEF).

Abstract

Los aminoácidos aromáticos esenciales (AAA) son componentes básicos para sintetizar nuevas biomasas en las células y mantener las funciones biológicas normales. Por ejemplo, un suministro abundante de AAA es importante para que las células cancerosas mantengan su rápido crecimiento y división. Con esto, existe una creciente demanda de un enfoque de imagen altamente específico y no invasivo con una preparación mínima de la muestra para visualizar directamente cómo las células aprovechan los AAA para su metabolismo in situ. Aquí, desarrollamos una plataforma de imágenes ópticas que combina el sondeo de óxido de deuterio (D2O) con la dispersión Raman estimulada (DO-SRS) e integra DO-SRS con fluorescencia de excitación de dos fotones (2PEF) en un solo microscopio para visualizar directamente las actividades metabólicas de las células HeLa bajo regulación AAA. En conjunto, la plataforma DO-SRS proporciona una alta resolución espacial y especificidad de proteínas y lípidos recién sintetizados en unidades celulares HeLa individuales. Además, la modalidad 2PEF puede detectar señales de autofluorescencia de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavina de forma libre de marcas. El sistema de imágenes descrito aquí es compatible con modelos in vitro e in vivo , lo que es flexible para varios experimentos. El flujo de trabajo general de este protocolo incluye el cultivo celular, la preparación de los medios de cultivo, la sincronización celular, la fijación celular y la obtención de imágenes de muestras con las modalidades DO-SRS y 2PEF.

Introduction

Al ser aminoácidos aromáticos esenciales (AAA), la fenilalanina (Phe) y el triptófano (Tryp) pueden ser absorbidos por el cuerpo humano para sintetizar nuevas moléculas para mantener las funciones biológicas normales1. La Phe es necesaria para la síntesis de proteínas, melanina y tirosina, mientras que Tryp es necesaria para la síntesis de melatonina, serotonina y niacina 2,3. Sin embargo, el consumo excesivo de estos AAA puede aumentar la diana de la vía de la rapamicina (mTOR) en los mamíferos, inhibir la proteína quinasa activada por AMP e interferir con el metabolismo mitocondrial, alterando colectivamente la biosíntesis de macromoléculas y conduciendo a la producción de precursores malignos, como las especies reactivas de oxígeno (ROS) en células sanas 4,5,6. La visualización directa de la dinámica metabólica alterada bajo un exceso de regulación de AAA es esencial para comprender el papel de los AAA en la promoción del desarrollo del cáncer y el crecimiento de células sanas 7,8,9.

Los estudios tradicionales de AAA se basan en la cromatografía de gases (GC)10. Otros métodos, como la resonancia magnética (RM), tienen resoluciones espaciales limitadas, lo que dificulta la realización de análisis celulares y subcelulares de muestras biológicas11. Recientemente, se ha desarrollado la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) para dilucidar el papel de los AAA en la síntesis de lípidos y proteínas en la proliferación del cáncer con biomarcadores no invasivos12,13,14. Sin embargo, esta técnica todavía adolece de profundidades de imagen poco profundas, poca resolución espacial y una amplia preparación de la muestra. A nivel celular, los isótopos estables no tóxicos, como el nitrógeno-15 y el carbono-13, se pueden rastrear con imágenes de isótopos múltiples y espectrometría de masas de iones secundarios a nanoescala para comprender su incorporación en macromoléculas. Sin embargo, estos métodos son destructivos para las muestras biológicas vivas15,16. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es otra técnica poderosa que puede visualizar la dinámica metabólica17. Por otro lado, la lentitud de la exploración durante las imágenes AFM puede provocar una distorsión de la imagen del resultado debido a la deriva térmica.

Desarrollamos una modalidad de imagen biortogonal no invasiva mediante el acoplamiento de la microscopía de dispersión Raman estimulada por sonda de óxido de deuterio (D2O) y la microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones sin marcaje (2PEF). Esta modalidad logra una alta resolución espacial y especificidad química al tomar imágenes de muestras biológicas 18,19,20,21,22,23,24. Este protocolo presenta las aplicaciones de DO-SRS y 2PEF para examinar la dinámica metabólica de los lípidos, las proteínas y los cambios en la proporción redox durante la progresión del cáncer. Dado que elD2Oes una forma isotópica estable del agua, las biomoléculas celulares pueden marcarse con deuterio (D) debido a su rápida compensación con el agua corporal total en las células, formando enlaces carbono-deuterio (C-D) a través del intercambio enzimático21. Los enlaces C-D en macromoléculas recién sintetizadas, incluidos lípidos, proteínas, ADN/ARN y carbohidratos, se pueden detectar en la región silenciosa celular del espectro Raman 20,21,22,25,26,27. Con dos pulsos láser sincronizados, los enlaces C-D de lípidos y proteínas recién sintetizados se pueden mostrar en células individuales a través de imágenes hiperespectrales (HSI) sin extraerlos ni marcarlos con agentes citotóxicos. Además, la microscopía SRS tiene la capacidad de construir modelos tridimensionales (3D) de regiones seleccionadas de interés en muestras biológicas mediante la captura y combinación de un conjunto de imágenes transversales22,26. Con imágenes hiperespectrales y volumétricas en 3D, DO-SRS puede obtener distribuciones espaciales de macromoléculas recién sintetizadas en células individuales, junto con el tipo de orgánulos que facilitan el proceso de promoción del crecimiento del cáncer bajo la regulación AAA22. Además, utilizando 2PEF, podemos obtener señales de autofluorescencia de flavina y nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) con alta resolución, profundidad de penetración profunda y daño de bajo nivel en muestras biológicas21,23,24. Las señales de autofluorescencia de flavina y NADH se han utilizado para caracterizar la homeostasis redox y la peroxidación lipídica en células cancerosas22,26. Como tal, el acoplamiento de DO-SRS y 2PEF no solo proporciona un análisis subcelular de la dinámica metabólica regulada por AAA en células cancerosas con alta distribución espacial, información de especificidad química y preparación mínima de muestras, sino que el método también reduce la necesidad de extraer o marcar moléculas endógenas con reactivos tóxicos. En este protocolo, primero presentamos los procedimientos de preparación deD2Oy aminoácidos, así como el cultivo de células cancerosas. A continuación, se muestran los protocolos de imagen DO-SRS y 2PEF. Finalmente, presentamos los resultados representativos de las imágenes SRS y 2PEF, que demuestran los cambios metabólicos regulados por AAA de lípidos y proteínas, y los cambios en la relación redox en las células cancerosas. En la Figura 1 se destaca una ilustración detallada del proceso.

Protocol

1. Preparación de los medios Prepare 10 mL de control y exceso de AAA en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 50% de D2O.Para el medio de control, mida y mezcle 10 mg de polvo de DMEM con 4,7 ml de agua bidestilada (ddH2O) en un tubo cónico de 15 ml. El polvo de DMEM contiene todos los aminoácidos en concentraciones estándar. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada. Añadir 4,7…

Representative Results

La adición de un exceso de AAA a concentraciones de 15x a los medios de cultivo celular que contienen D2O al 50% produjo distintas bandas C-D Raman de lípidos y proteínas recién sintetizados en células HeLa (Figura 2B). Los experimentos anteriores se realizaron con diferentes niveles de concentración, como 2x y 5x, y aunque no se presentan los datos, la concentración de 15x produjo las bandas C-D Raman más distintivas de lípidos y proteínas recién sintetizados. Específ…

Discussion

Las imágenes DO-SRS y 2PEF se han aplicado para investigar la dinámica metabólica en varios modelos ex vivo, incluyendo Drosophila y tejidos humanos 21,22,23,24,26,27,33. La modalidad de imagen utilizada en este estudio integra DO-SRS y microscopía 2PEF, que puede superar a otro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Yajuan Li y Anthony Fung por su apoyo técnico, y al laboratorio Fraley por la línea celular. Agradecemos los fondos iniciales de UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 y Hellman Fellow Award.

Materials

10 mL Serological Pipettes  Avantor (by VWR) 75816-100 https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 mL Conical Centrifuge Tube VWR 89039-664 https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664
16% Formaldehyde, Methanol-free ThermoFisher Scientific 28906 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
24-well plate Fisherbrand FB0112929 https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
25 mm Syringe Filter, 2 μm PES Foxx Life Sciences 381-2216-OEM https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 nm Filter Cube Olympus OCT-ET460/50M32
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote Olympus Supply power to the laser
Band-pass Filter KR Electronics KR2724 8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator  Mini Circuits STRM-50
BNC Cable Thorlabs 2249-C Coaxial Cable, BNC Male/Male
Broadband Dielectric Mirror Thorlabs BB1-E03 750 – 1100 nm
Centrifuge
Condenser Olympus
Cover Glass Corning 2850-25 https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
DC power supply TopWard 6302D
Dichroic Mount Thorlabs KM100CL
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent mpbio  196055 https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate MilliporeSigma 38210000 https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder
With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Corning MT10027CV https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20
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Heavy Water (Deuterium Oxide) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. 7732-18-5 https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
Hela Cells ATCC CCL-2 https://www.atcc.org/products/ccl-2
Hemocymeter MilliporeSigma Z359629-1EA https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI
zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk
QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr
SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL
w_wcB&gclsrc=aw.ds
High O.D. Bandpass Filter Chroma Technology ET890/220m Filter the Stokes beam and transmit the pump beam
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) Cytiva  SH300880340 https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340
HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution Cytiva SH30042.02 https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
Integrated SRS Laser System Applied Physics & Electronics, Inc. picoEMERALD picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam.  The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted Laser-scanning Microscope Olympus FV1200MPE
IX3-CBH Control box Olympus Control the laser-scanning microscope
Kinematic Mirror Mount Thorlabs POLARIS-K1-2AH 2 Low-Profile Hex Adjusters
L-Phenalynine Sigma P5482-25G https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-Tryptophan Sigma T8941-25G https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941
LabSpec 6 Horiba XploRA N/A https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
Lock-In Amplifier Zurich Instruments N/A https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
Long-pass Dichroic Beam Splitter Semrock Di02-R980-25×36 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MATLAB MathWorks Version: R2022b https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-003 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003
Microscopy Imaging Software Olympus FluoView
MPLN 100x, Olympus Olympus MPLAPON https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364
MPLN 50x, Olympus Olympus MPLAPON  https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363
NA Oil Condenser Olympus  6-U130 https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
Nail Polish Wet n Wild B01EO2G5O4 https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW
HHQP38FXXDC_0
Origin OriginLab Origin 2022b (9.95) https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
Parafilm Fisher Scientific S37440 https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Thermofischer – Gibco 14040117 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
Penicillin/Streptomycin Thermofischer – Gibco 15140122 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Periscope Assembly Thorlabs RS99 Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
picoEmerald System A.P.E N/A https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
Shielded Box with BNC Connectors Pomona Electronics 2902 Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female
Si Photodiode Detector Home Built N/A DYI series
Silicon Wafer
Spacers Grace Bio-Labs 654008 https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
Spontaneous Raman spectroscopy Horiba XploRA N/A https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
Stimulated Raman Scattering Microscopy Home Built N/A
Touch  Panel Controller Olympus Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl)  Lonza 17-942E https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
Tweezers Kaverme – Amazon B07RNVXXV1 https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"
Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy Home Built N/A
Weighing Paper  VWR 12578-165 https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper
Zurich LabOneQ Software Zurich Instruments Control the Zurich lock-in amplifier

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Bagheri, P., Hoang, K., Kuo, C., Trivedi, H., Jang, H., Shi, L. Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids. J. Vis. Exp. (195), e65121, doi:10.3791/65121 (2023).

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