Summary
Presentiamo un protocollo per visualizzare direttamente le attività metaboliche nelle cellule regolate da aminoacidi utilizzando la microscopia a diffusione Raman stimolata (DO-SRS) con ossido di deuterio (acqua pesante D2O), che è integrata con la microscopia a fluorescenza di eccitazione a due fotoni (2PEF).
Abstract
Gli amminoacidi aromatici essenziali (AAA) sono elementi costitutivi per sintetizzare nuove biomasse nelle cellule e sostenere le normali funzioni biologiche. Ad esempio, un'abbondante fornitura di AAA è importante per le cellule tumorali per mantenere la loro rapida crescita e divisione. Con questo, c'è una crescente domanda di un approccio di imaging altamente specifico e non invasivo con una preparazione minima del campione per visualizzare direttamente come le cellule sfruttano gli AAA per il loro metabolismo in situ. Qui, sviluppiamo una piattaforma di imaging ottico che combina il sondaggio all'ossido di deuterio (D2O) con lo scattering Raman stimolato (DO-SRS) e integra DO-SRS con fluorescenza di eccitazione a due fotoni (2PEF) in un singolo microscopio per visualizzare direttamente le attività metaboliche delle cellule HeLa sotto regolazione AAA. Collettivamente, la piattaforma DO-SRS fornisce un'elevata risoluzione spaziale e specificità di proteine e lipidi di nuova sintesi in singole unità cellulari HeLa. Inoltre, la modalità 2PEF può rilevare segnali di autofluorescenza di nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) e flavina in modo label-free. Il sistema di imaging qui descritto è compatibile sia con modelli in vitro che in vivo , che è flessibile per vari esperimenti. Il flusso di lavoro generale di questo protocollo include la coltura cellulare, la preparazione dei terreni di coltura, la sincronizzazione cellulare, la fissazione cellulare e l'imaging dei campioni con le modalità DO-SRS e 2PEF.
Introduction
Essendo aminoacidi aromatici essenziali (AAA), la fenilalanina (Phe) e il triptofano (Tryp) possono essere assorbiti dal corpo umano per sintetizzare nuove molecole per sostenere le normali funzioni biologiche1. Phe è necessario per la sintesi di proteine, melanina e tirosina, mentre Tryp è necessario per la sintesi di melatonina, serotonina e niacina 2,3. Tuttavia, il consumo eccessivo di questi AAA può sovraregolare il bersaglio nei mammiferi della via della rapamicina (mTOR), inibire la proteina chinasi attivata da AMP e interferire con il metabolismo mitocondriale, alterando collettivamente la biosintesi delle macromolecole e portando alla produzione di precursori maligni, come le specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle cellule sane 4,5,6. La visualizzazione diretta delle dinamiche metaboliche alterate sotto l'eccesso di regolazione AAA è essenziale per comprendere il ruolo delle AAA nel promuovere lo sviluppo del cancro e la crescita delle cellule sane 7,8,9.
Gli studi AAA tradizionali si basano sulla gascromatografia (GC)10. Altri metodi, come la risonanza magnetica (MRI), hanno risoluzioni spaziali limitate, rendendo difficile eseguire analisi cellulari e subcellulari di campioni biologici11. Recentemente, il desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI) è stato sviluppato per chiarire il ruolo degli AAA nelle sintesi lipidiche e proteiche nella proliferazione del cancro con biomarcatori non invasivi12,13,14. Tuttavia, questa tecnica soffre ancora di profondità di imaging poco profonde, scarsa risoluzione spaziale e ampia preparazione del campione. A livello cellulare, gli isotopi stabili non tossici, come l'azoto-15 e il carbonio-13, possono essere tracciati con imaging multi-isotopico e spettrometria di massa di ioni secondari su scala nanometrica per comprendere la loro incorporazione in macromolecole. Tuttavia, questi metodi sono distruttivi per i campioni biologici viventi15,16. La microscopia a forza atomica (AFM) è un'altra potente tecnica in grado di visualizzare la dinamica metabolica17. La lentezza della scansione durante l'imaging AFM, d'altra parte, può causare la distorsione dell'immagine del risultato dalla deriva termica.
Abbiamo sviluppato una modalità di imaging biortogonale non invasiva accoppiando la microscopia a diffusione Raman stimolata con ossido di deuterio (D2O) (DO-SRS) e la microscopia a fluorescenza a due fotoni senza etichetta (2PEF). Questa modalità raggiunge un'elevata risoluzione spaziale e specificità chimica durante l'imaging di campioni biologici 18,19,20,21,22,23,24. Questo protocollo introduce le applicazioni di DO-SRS e 2PEF per esaminare le dinamiche metaboliche dei lipidi, delle proteine e dei cambiamenti del rapporto redox durante la progressione del cancro. Poiché D2O è una forma isotopica stabile dell'acqua, le biomolecole cellulari possono essere marcate con deuterio (D) a causa della sua rapida compensazione con l'acqua corporea totale nelle cellule, formando legami carbonio-deuterio (C-D) attraverso lo scambio enzimatico21. I legami C-D in macromolecole di nuova sintesi, inclusi lipidi, proteine, DNA / RNA e carboidrati, possono essere rilevati nella regione silenziosa cellulare dello spettro Raman 20,21,22,25,26,27. Con due impulsi laser sincronizzati, i legami C-D di lipidi e proteine appena sintetizzati possono essere visualizzati su singole cellule tramite imaging iperspettrale (HSI) senza estrarli o etichettarli con agenti citotossici. Inoltre, la microscopia SRS ha la capacità di costruire modelli tridimensionali (3D) di regioni selezionate di interesse in campioni biologici catturando e combinando una serie di immagini in sezione trasversale22,26. Con l'imaging iperspettrale e volumetrico 3D, DO-SRS può ottenere distribuzioni spaziali di macromolecole appena sintetizzate in singole cellule, insieme al tipo di organelli che facilitano il processo di promozione della crescita del cancro ai sensi della regola AAA22. Inoltre, utilizzando 2PEF, possiamo ottenere segnali di autofluorescenza di Flavina e nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) ad alta risoluzione, profondità di penetrazione profonda e danni di basso livello in campioni biologici21,23,24. I segnali di autofluorescenza di flavina e NADH sono stati utilizzati per caratterizzare l'omeostasi redox e la perossidazione lipidica nelle cellule tumorali22,26. Pertanto, non solo l'accoppiamento di DO-SRS e 2PEF fornisce un'analisi subcellulare delle dinamiche metaboliche regolate da AAA nelle cellule tumorali con elevata distribuzione spaziale, informazioni sulla specificità chimica e preparazione minima del campione, ma il metodo riduce anche la necessità di estrarre o etichettare molecole endogene con reagenti tossici. In questo protocollo, presentiamo prima le procedure di D2O e la preparazione di aminoacidi, nonché la coltura di cellule tumorali. Quindi, mostriamo i protocolli di imaging DO-SRS e imaging 2PEF. Infine, presentiamo i risultati rappresentativi dell'imaging SRS e 2PEF, che dimostrano i cambiamenti metabolici regolati da AAA di lipidi e proteine e i cambiamenti del rapporto redox nelle cellule tumorali. Un'illustrazione dettagliata del processo è evidenziata nella Figura 1.
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Protocol
1. Preparazione dei supporti
- Preparare 10 mL di AAA di controllo e AAA in eccesso nel mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco contenente il 50% di D2O.
- Per i mezzi di controllo, misurare e miscelare 10 mg di polvere DMEM con 4,7 mL di acqua bidistillata (ddH2O) in un tubo conico da 15 ml. La polvere DMEM contiene tutti gli aminoacidi a concentrazioni standard. Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata. Aggiungere 4,7 ml di D2O, 0,5 ml di siero fetale bovino (5% FBS) e 0,1 ml di penicillina/streptomicina (1%). Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata.
- Per il mezzo di trattamento 15x Phe, misurare e mescolare 10 mg di polvere DMEM con 4,7 ml di ddH2O, 0,5 mL di FBS (5%) e 0,1 mL di penicillina/streptomicina (1%) in un tubo conico da 15 ml. Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata. Aggiungere la polvere di Phe in eccesso ad una concentrazione di 924 mg / L al mezzo. Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata.
- Per il mezzo di trattamento 15x Tryp, misurare e mescolare 10 mg di DMEM in polvere con 4,7 mL di ddH2O, 0,5 mL di FBS (5%) e 0,1 mL di penicillina/streptomicina (1%) in un tubo conico da 15 ml. Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata. Aggiungere la polvere di Tryp in eccesso ad una concentrazione di 224 mg / L al mezzo. Vortice completo e capovolgere il tubo per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata.
- Aggiungere metionina e treonina a 30,0 mg/ml e 95,0 mg/ml, rispettivamente, a tutti i tubi conici dei passaggi precedenti. Vortice completo e capovolgere il tubo. Non è necessario aggiungere piruvato di sodio ai terreni di coltura.
- Filtrare i mezzi di controllo e trattamento con un filtro a siringa da 25 mm con filtri a membrana in polietersulfone da 0,22 μm.
- Sigillare tutti i tubi conici contenuti nei fluidi con parafilm e conservare a 4 °C per un massimo di 3 settimane. Prima di trattare le cellule con i media, riscaldare tutti i mezzi a 37°C.
NOTA: I reagenti in polvere e liquidi devono essere misurati e combinati in base al volume totale dei mezzi di trattamento e di controllo.
2. Preparazione del campione di cellule
- Mantenere le cellule del cancro cervicale (HeLa) in un pallone di coltura (cioè T10, T25, ecc.) utilizzando DMEM standard integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina a 37 ° C e 5% di anidride carbonica (CO2).
- Sub-coltura delle cellule HeLa con un rapporto di divisione di 1:10 fino a raggiungere l'80% o superiore di vitalità cellulare.
- Una volta che le cellule raggiungono l'80% o superiore di confluenza, procedere a seminare 2 x 10 5 cellule per pozzetto su una piastra a 24 pozzetti utilizzando DMEM integrato con0,5 % FBS e 1% penicillina / streptomicina.
- Prima della semina cellulare, preparare una piastra a 24 pozzetti con vetrine rotonde sterilizzate, poli-d-lisina, rivestite di laminina, di 12 mm di diametro. Immergere i vetrini di copertura in etanolo al 70% e asciugare delicatamente con salviette prive di lanugine. Posizionare i coprivetrini puliti negli appositi pozzetti della piastra.
- Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza nella fase 2.2, lavare le cellule una volta con 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) senza ioni magnesio e calcio.
- Aggiungere tripsina allo 0,25% per dissociare le cellule aderenti dal matraccio e incubare a 37 °C e al 5% di CO2 per 3 minuti.
- Aggiungere DMEM integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina, pipettare delicatamente su e giù, e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 300 x g a temperatura ambiente (RT) per 3 minuti.
- Risospendere le cellule in DMEM integrato con 0,5% FBS e 1% penicillina / streptomicina.
- Contare le cellule usando un emocitometro, un microscopio ottico e un tripano blu e seminare una densità di 2 x 105 cellule per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. In alternativa, è possibile utilizzare un contatore automatico delle celle per contare le celle.
- Riportare le cellule nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 e agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le cellule.
- Dopo 8 ore, sostituire i vecchi terreni di coltura con il 50%di D 2 O/eccesso di Phe o il 50% di D2O/eccesso di terreno Tryp. Riportare le cellule nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 36 ore.
- Dopo 36 ore, fissare le cellule su vetrini da microscopio.
- Prima del fissaggio, preparare vetrini da microscopio con distanziatori di imaging di 9 mm di diametro e posizionare 15 μL di 1x PBS integrato con ioni di calcio e magnesio.
- Risciacquare le cellule con 1x PBS integrato con ioni di calcio e magnesio.
- Aggiungere 0,5 ml di soluzione di paraformaldeide (PFA) priva di metanolo al 4% e lasciare la piastra sotto il cappuccio di biosicurezza per circa 15 minuti.
- Aspirare la soluzione di PFA e risciacquare con 1x PBS integrato con ioni di calcio e magnesio due volte.
- Aggiungere 1,5 ml di 1x PBS integrato con ioni di calcio e magnesio in ciascun pozzetto.
- Utilizzare pinzette sterili per afferrare delicatamente i coperchi da ciascun pozzetto. Capovolgere e posizionare il lato contenente la cella dei vetrini di copertura sui distanziatori di imaging per contattare il PBS preparato al punto 2.5.1. Assicurarsi che il lato non contenente celle sia esposto all'aria.
- Utilizzando uno smalto trasparente, sigillare lo strato esterno della vetrina con il distanziatore di imaging.
- Conservare i vetrini del microscopio a 4 °C quando non si esegue l'imaging.
3. Misurazione spontanea della spettroscopia Raman (Figura 2)
- Utilizzare un microscopio Raman confocale per ottenere spettri Raman spontanei (Figura 2A).
- Accendere il laser ruotando la chiave in posizione ON .
- Fare doppio clic sull'icona del software LabSpec6 per aprire il software di acquisizione.
- Caricare il campione biologico sul supporto del campione direttamente sotto la lente dell'obiettivo.
- Sul software, fare clic sull'icona Fotocamera per accendere la videocamera.
- Regolare il piano di messa a fuoco per identificare una regione di interesse con l'obiettivo 50x. Spostare il joystick per controllare la traslazione della pialla dello stadio XY e ruotare il joystick per modificare la profondità di messa a fuoco.
- Dopo aver scelto la posizione per la misurazione, passare all'obiettivo 100x con 40 mW di potenza di eccitazione. Fare clic sull'icona rossa Stop per spegnere la videocamera.
- Selezionare una griglia di 1800 linee/mm e impostare l'intervallo di acquisizione da 400 cm-1 a 3.150 cm-1.
- Impostare il tempo di acquisizione su 90 s, l'accumulo su 3 e il binning su 4 per il minimo rumore e lo spettro più accurato.
NOTA: questi parametri di imaging possono essere ottimizzati per adattarsi all'esperimento. - Fare clic sull'icona della freccia per attivare la visualizzazione in tempo reale.
- Regolate lo spostamento Raman (cm-1) su un valore scelto per ottimizzare il piano di messa a fuoco.
NOTA: In questo esperimento, il laser Raman è stato focalizzato sulle goccioline lipidiche, che contenevano un'alta concentrazione di legami CH2 . Pertanto, è stato selezionato uno spostamento Raman di 2.850 cm-1 che corrispondeva alle modalità di allungamento del legame CH2 . - Regolare il piano di messa a fuoco con il joystick per ottimizzare il miglior rapporto segnale-rumore.
- Dopo aver scelto il piano di messa a fuoco, fare clic sull'icona rossa Stop per visualizzare in tempo reale.
- Selezionare l'icona Cerchio per avviare l'acquisizione dello spettro.
- Una volta presa la regione cellulare, utilizzare lo stesso piano di messa a fuoco per misurare lo sfondo con PBS. Sottrarre lo spettro di fondo da ogni spettro bersaglio subcellulare utilizzando un'applicazione software separata, come Origin (Figura 1B).
4. Esperimenti di imaging con 2PEF e SRS
NOTA: Descrizioni dettagliate dell'allineamento laser SRS sono disponibili in un rapporto precedente28. Questo protocollo si concentra sul funzionamento di un sistema di imaging SRS e 2PEF multimodale (Figura 2C, D).
- Fare clic su Start per riscaldare il laser.
- Seguire l'ordine per impostare gli interruttori principali della centralina e del monitor su: 1) premere l'interruttore principale della scatola di controllo IX3-CBH su On, 2) premere l'interruttore principale del controller del pannello a sfioramento su On, 3) premere l'interruttore principale dell'adattatore CA dell'alimentatore per LD OBIS 6 Laser Remote collegato al combinatore laser principale FV31-SCOMB su One 4) premere l'interruttore principale dell'adattatore CA dell'alimentatore per LD OBIS 6 Laser Remote collegato al combinatore sub laser FV31-SCOMB su On.
- Premere gli interruttori principali del rilevatore di fotodiodi Si e dell'amplificatore di blocco On.
- Impostare il fascio di Stokes a 1.031 nm, la larghezza dell'impulso a 6 ps e la frequenza di ripetizione a 80 MHz.
- Accoppiato al microscopio, impostare il sistema picoEmerald fornito con il fascio della pompa sincronizzato con una lunghezza d'onda sintonizzabile da 720-990 nm, una larghezza di impulso di 5-6 ps e una frequenza di ripetizione di 80 MHz. La potenza di eccitazione media sia della pompa che di Stokes è di 450 mW. Ottimizzare il potere di eccitazione per ridurre al minimo il fotodanneggiamento per il campione.
- Utilizzare un condensatore dell'olio ad apertura numerica (NA) (cioè 1,4 NA) per raccogliere gli Stokes e i raggi della pompa in cui il campione è montato emettendo alcune gocce sul condensatore.
- Montare il campione sull'olio e posizionare una grande goccia d'acqua sopra il vetrino del microscopio dove è fissato il campione. Questo è per l'obiettivo ad immersione in acqua.
- Impostare l'amplificatore lock-in su 20 MHz. Elabora l'immagine ora utilizzando il modulo software super-risoluzione.
- Selezionare 512 pixel x 512 pixel e 80 μs/pixel per il tempo di permanenza.
- Una volta che la regione cellulare desiderata è messa a fuoco correttamente, acquisire l'immagine. Utilizzando il software di acquisizione del microscopio, salvare le immagini come file grafico Olympus .oir.
- Acquisisci un'immagine di sfondo a 1.900 cm-1 e sottrarla da tutte le immagini cellulari.
- Per eseguire l'imaging 2PEF, utilizzare lo stesso laser a picosecondi sintonizzabili e impostare l'autofluorescenza label-free di Flavina e NADH rispettivamente su 800 nm e 780 nm.
- Utilizzare un cubo filtrante da 460 nm/515 nm per raccogliere l'emissione retrodiffusa di autofluorescenza di Flavina e NADH.
- Regolare il tempo di permanenza su 8 μs/pixel e la dimensione dei pixel su 512 pixel x 512 pixel. Impostare il parametro di potenza dell'otturatore laser su 150 mW.
- Per la ricostruzione di immagini 3D, sintonizzare la perdita Raman stimolata a 2.850 cm-1 (797 nm).
- Una volta identificate le singole cellule desiderate, registrare il laser per eseguire la scansione dal piano di messa a fuoco superiore per rilevare gli strati superiore e inferiore di tali cellule.
NOTA: i modelli 3D vengono generati e salvati come file .oir.
5. Spettri e analisi delle immagini
- Analisi spettrale
- Utilizza il software Origin o altre applicazioni pertinenti per sottrarre lo spettro di fondo da tutti gli spettri target subcellulari.
- Utilizza le operazioni di modellazione matematica di MATLAB per elaborare gli spettri Raman con le funzioni integrate nel software. Python può anche essere usato per l'elaborazione degli spettri.
- La pre-elaborazione spettrale inizia con la conversione dei file in una matrice. Gli spettri sono interpolati ad ogni centimetro reciproco.
- Per la convalida, rappresentare graficamente i dati non elaborati. Esegui la correzione della linea di base sugli spettri grezzi usando la funzione integrata msbackadj in MATLAB. In breve, la funzione incorporata stima i punti della linea di base ai valori dell'unità di separazione identificati dagli utenti e restituisce la distanza tra le finestre adiacenti. Dai punti della linea di base, stimare e tracciare una linea di regressione. Applicate Arrotondamento (Smoothing) per smussare la linea di regressione e sottrarre la linea di base da ogni singolo spettro grezzo.
- Eseguire la normalizzazione min-max dividendo l'intensità Raman della proteina a 2.930 cm-1 per l'intensità di ogni spostamento Raman. Il segnale di 2.930 cm-1 è tipicamente la più alta intensità sullo spettro Raman. Con questa normalizzazione, il valore massimo viene trasformato in un 1 mentre il valore minimo viene trasformato in uno 0. Ogni altro valore viene trasformato in un decimale compreso tra 0 e 1.
- Calcola la media dei singoli spettri della stessa condizione in un singolo spettro per ridurre il rumore.
- Una volta elaborato, utilizza applicazioni, come Origin, per visualizzare tutti gli spettri contemporaneamente. I picchi visualizzati negli spettri rappresentano uno specifico legame chimico o gruppo funzionale.
- Analisi 3D delle goccioline lipidiche
- Utilizzare il software FIJI-ImageJ per elaborare tutte le immagini 3D
- Eseguire le funzioni Bandpass Filters e Smoothing per gli stack di immagini 3D.
- Per l'analisi delle immagini 3D, assegnare ogni goccia lipidica a un punteggio sferico calcolato misurando la distanza tra il suo centro di massa e la superficie. Confronta ogni partitura sferica con una partitura sferica di una sfera perfetta sullo stesso piano euclideo. Scartare le goccioline lipidiche con bassi punteggi sferici e valutare le goccioline lipidiche rimanenti per il loro volume e conteggio.
- Analizzare il volume e la conta delle goccioline lipidiche tra diversi trattamenti per la significatività statistica su un'applicazione software statistica appropriata. Qui è stato utilizzato GraphPad Prism.
- Analisi di immagini iperspettrali 2D
- Utilizzare il software FIJI-ImageJ per elaborare tutte le immagini iperspettrali 2D.
- Selezionare il canale 2.930 cm-1 per creare un'immagine maschera contenente valori 0 e 1. Assegna lo sfondo a 0 e la regione cellulare a 1.
- Sottrarre il canale proteico marcato con deuterio (2.175 cm-1) al canale di fondo (1.900 cm-1) per rimuovere gli effetti fluorescenti.
- Dividere il canale proteico marcato con deuterio risultante per il canale proteico (2.930 cm-1) per ottenere immagini del rapporto del tasso di turnover proteico.
- Quindi, moltiplicare l'immagine della maschera creata nel passaggio 5.3.2 per le immagini raziometriche per rimuovere eventuali rumori di fondo rimanenti. Di conseguenza, viene generato uno sfondo scuro in ogni immagine raziometrica.
- Utilizzate lo strumento Selezione a mano libera in FIJI-ImageJ per segmentare e calcolare manualmente le intensità dei pixel visualizzate su singole celle. Le intensità dei pixel corrispondono alle concentrazioni del legame chimico visualizzato.
- Analizzare le intensità dei pixel per la significatività statistica su un'applicazione software statistica appropriata. Qui è stato utilizzato GraphPad Prism. Ripetete questa analisi con l'analisi raziometrica rimanente.
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Representative Results
L'aggiunta di AAA in eccesso a concentrazioni 15x al terreno di coltura cellulare contenente D2O al 50% ha prodotto bande Raman C-D distinte di lipidi e proteine di nuova sintesi nelle cellule HeLa (Figura 2B). Esperimenti precedenti sono stati eseguiti con diversi livelli di concentrazione, come 2x e 5x, e sebbene i dati non siano presentati, la concentrazione 15x ha prodotto le bande Raman C-D più distinte di lipidi e proteine appena sintetizzati. In particolare, studiando le goccioline lipidiche (LD), abbiamo notato che sia 15x Phe che 15x Tryp hanno indotto lipidi e segnali proteici di nuova sintesi a 2.143 cm-1 e 2.172 cm-1, rispettivamente. DO-SRS è stato successivamente utilizzato per visualizzare la distribuzione spaziale dei segnali C-D su singole celle (Figura 3). Utilizzando ImageJ, le intensità dei pixel delle singole celle sono state segmentate e calcolate manualmente, come indicato dai bordi bianchi tratteggiati nella Figura 3A. Le cellule di controllo mostrano bande lipidiche e proteiche C-D moderate; tuttavia, il 15x Phe e il 15x Tryp mostrano bande lipidiche e proteiche C-D più forti. L'analisi quantitativa indica che l'eccesso di AAA può sovraregolare la sintesi lipidica del 10%-17%, ma sottoregolare la sintesi proteica del 10% (Figura 3C,D). I risultati deducono la possibilità di una mancanza di autofagia che accumula lipidi di nuova sintesi, promuove la disfunzione mitocondriale e induce uno squilibrio ossidativo sotto l'eccesso di regolazione AAA7.
SRS multimodale label-free e imaging 2PEF di lipidi insaturi (~3.011 cm-1), lipidi saturi (~2.880 cm-1) e NADH, Flavina sono stati acquisiti per comprendere gli effetti degli AAA sul metabolismo del cancro. Allo stesso modo, le intensità dei pixel delle singole celle sono state segmentate manualmente e calcolate utilizzando ImageJ, come indicato dai bordi bianchi punteggiati nella Figura 3B. L'analisi raziometrica delle cellule trattate con AAA mostra un aumento del 10% dei lipidi insaturi / lipidi saturi e un aumento del 50% di Flavina / Flavina + NADH (Figura 3E, F). Nella catena di trasporto degli elettroni dei mitocondri, i ROS possono essere generati dal trasferimento di elettroni da NADH e FADH2 alle specie molecolari dell'ossigeno. L'accumulo di ROS in molte cellule tumorali provoca uno squilibrio ossidativo che ossida gli acidi grassi insaturi, promuove la sintesi degli acidi grassi saturi e esaurisce i segnali di autofluorescenza del NADH. Pertanto, l'aumento osservato di Flavina / Flavina + NADH è un indicatore di ROS accumulato che riduce i segnali di autofluorescenza NADH. In risposta allo squilibrio ossidativo, le cellule HeLa possono sovraregolare la loro sintesi lipidica insatura per sostituire quelle ossidate. Questa risposta non è osservata in altre linee cellulari tumorali29, il che significa l'eterogeneità metabolica delle cellule tumorali sotto una dieta AAA in eccesso30.
Oltre all'imaging multimodale, SRS può ricostruire immagini 3D label-free di LD in controllo e cellule HeLa trattate con AAA. In breve, la microscopia genera una serie di immagini trasversali in una regione di interesse selezionata. In questo studio, la perdita Raman stimolata (SRL) è stata sintonizzata su 2.845 cm-1 e scansionata dallo strato superiore allo strato inferiore con una dimensione del passo di 1 μm (Figura 4A). Le analisi quantitative delle goccioline lipidiche 3D rivelano che le LD si sono ridotte di dimensioni ma sono aumentate nella conta nelle cellule trattate con AAA rispetto al controllo (Figura 4B, C). L'aumentata presenza di aminoacidi idrofobici voluminosi, come Tryp e Phe può compromettere la funzione delle proteine LD-coating. Questo alla fine riduce la lipolisi, che accumula numerosi piccoli LD. I risultati dell'imaging volumetrico 3D SRS label-free di questo studio corroborano con studi precedenti visualizzando che le cellule trattate con AAA in eccesso mostrano numerose LD più piccole31,32.
Figura 1: Un'illustrazione dell'acquisizione e dell'analisi delle immagini con DO-SRS e 2PEF. (A) Una ricostruzione e analisi di immagini 3D per acquisire il numero di goccioline lipidiche, il volume e il punteggio sferico. (B) Imaging iperspettrale e analisi di lipidi marcati con deuterio (CDL; 2.145 cm-1), lipidi (2.845 cm-1), proteine marcate con deuterio (CDP; 2.175 cm-1), proteine (2.940 cm-1), lipidi insaturi (3.011 cm-1), lipidi saturi (2.880 cm-1), NADH e flavina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Messa a punto fisica della spettroscopia Raman spontanea e della microscopia a diffusione Raman stimolata. (A) Configurazione della spettroscopia Raman spontanea utilizzata per questo studio. (B) Campionare spettri Raman spontanei per etichetta CD (rosso), senza etichetta CD (nero), gruppo di controllo (blu, linea continua), gruppo trattato con Phe 15x (rosso, linea tratteggiata) e gruppo trattato con Tryp 15x (rosa, linea tratteggiata). (C) Diagramma schematico della configurazione della microscopia a diffusione Raman stimolata utilizzata per questa indagine. (D) Configurazione della microscopia a diffusione Raman stimolata utilizzata come piattaforma DO-SRS e 2PEF. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Visualizzazione della dinamica metabolica nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia DO-SRS e 2PEF. (A) Lipidi marcati con deuterio (2.145 cm-1), lipidi (2.845 cm-1), proteine marcate con deuterio (2.175 cm-1), proteine (2.940 cm-1) visualizzate in cellule HeLa sotto controllo (Ctrl), 15x fenilalanina (15x Phe) e 15x triptofano (15x Tryp) con la piattaforma DO-SRS. Il tasso di turnover lipidico e il tasso di turnover proteico sono stati calcolati come 
e 
. Le immagini raw sono state prima sottratte dal segnale PBS per rimuovere l'intensità dello sfondo e mascherate per rimuovere l'intensità al di fuori delle celle utilizzando ImageJ. Per l'analisi raziometrica è stata eseguita una divisione pixel-wise. (B) Canali NADH e Flavina visualizzati con microscopia 2PEF e lipidi insaturi (3.011 cm-1) e lipidi saturi (2.880 cm-1) visualizzati con microscopia SRS label-free. Il rapporto redox ottico e il rapporto di saturazione sono stati calcolati con 
e 
. (C-F) Quantificazione delle intensità raziometriche per ogni cellula HeLa sotto controllo, condizioni 15x Phe e 15x Tryp. La differenza statistica è stata utilizzata per confrontare le condizioni di eccesso di AAA con le condizioni di controllo. p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05 sono stati calcolati da un test ANOVA bidirezionale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Visualizzazione della distribuzione 3D delle goccioline lipidiche di una singola cellula HeLa utilizzando un microscopio SRS label-free. (A) Proiezione del volume delle goccioline lipidiche 3D SRS in cellule HeLa sotto controllo e condizioni di eccesso di AAA. La soglia è stata definita prima dell'analisi, rivelando la distribuzione del segnale delle goccioline lipidiche. (B,C) Quantificazione del volume e della conta delle goccioline lipidiche all'interno delle singole cellule HeLa sotto gruppo di controllo e delle condizioni di eccesso di AAA utilizzando il test ANOVA a due vie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'imaging DO-SRS e 2PEF è stato applicato per studiare la dinamica metabolica in vari modelli ex vivo, tra cui Drosophila e tessuti umani 21,22,23,24,26,27,33. La modalità di imaging utilizzata in questo studio integra la microscopia DO-SRS e 2PEF, che può superare altri metodi di imaging specifici per molecola eliminando la necessità di estrazione o etichettatura molecolare con reagenti citotossici e richiedendo una preparazione minima del campione. In particolare, la microscopia DO-SRS ci permette di sondare de novo la lipogenesi e la sintesi proteica in animali e cellule e visualizzare la loro dinamica metabolica in situ23,27,34. 2PEF cattura i segnali di autofluorescenza di biomolecole presenti in natura, come Flavina e NADH, in campioni biologici35,36. La profondità di penetrazione dell'imaging di SRS può raggiungere fino a 200-500 μm in campioni meno diffusi37. Con i metodi di pulizia dei tessuti come l'urea, la profondità di penetrazione può aumentare di oltre dieci volte37. L'accoppiamento di SRS con 2PEF ci consente di visualizzare fluorofori endogeni come Flavina e NADH in campioni biologici, eliminando ulteriormente la necessità di biomarcatori esogeni per il rilevamento. 2PEF può raggiungere una profondità di penetrazione di 500 μm38. Rispetto ad altre modalità di imaging multiplex, come la microscopia a fluorescenza confocale multicolore a singolo fotone, sia DO-SRS che 2PEF possono raggiungere una profondità di penetrazione significativamente maggiore senza biomarcatori esogeni citotossici.
Per aumentare la risoluzione spaziale di DO-SRS e 2PEF, abbiamo sviluppato uno strumento di post-elaborazione delle immagini di deconvoluzione del puntinismo (A-PoD) basato sulla stima adattiva del momento (Adam)34. A-PoD può convertire immagini DO-SRS e 2PEF limitate alla diffrazione in immagini super-risolte senza la necessità di miglioramenti hardware. Inoltre, lo spettro Raman contiene molte modalità di vibrazione chimica specifiche che possono essere sfruttate per aumentare il numero di molecole rilevabili. Sfruttando questo vantaggio, il nostro laboratorio ha ulteriormente generato un metodo di corrispondenza di riferimento penalizzato (PRF) per distinguere più specie lipidiche in modelli cellulari e tissutali36. Questi due sviluppi tecnici aprono nuove strade per studiare i processi biologici in modo più dettagliato a livello cellulare e subcellulare, che sono stati utilizzati per caratterizzare i cambiamenti metabolici nel cervello, nel cancro e nei processi di invecchiamento26,27,35.
Una delle principali limitazioni di questo protocollo è la concentrazione e l'incubazione temporale di campioni cellulari con D2O per produrre bande Raman C-D distinte e quantificabili. Linee cellulari più robuste e metabolicamente attive, come le cellule HeLa, possono incorporare atomi di deuterio in macromolecole di nuova sintesi ad un ritmo più veloce rispetto alle linee cellulari di mammiferi non malati, come le cellule di rene embrionale umano (HEK), portando a varie intensità C-D osservate per la stessa concentrazione e incubazione temporale con D2O in due diverse linee cellulari21. Inoltre, la somministrazione di D2O ad una concentrazione pari o superiore all'80% per 48 ore può introdurre tossicità per i campioni cellulari. Un esperimento di ottimizzazione per identificare la concentrazione ottimale di D2O e l'incubazione del tempo è necessario per ottenere risultati desiderabili.
Un aspetto critico del protocollo è l'integrazione dell'imaging DO-SRS e 2PEF. Tipicamente, le modalità DO-SRS e 2PEF condividono lo stesso laser di eccitazione a picosecondi, poiché la sua larghezza di banda ridotta può essere ottimizzata con segnali SRS e 2PEF. Sebbene la nostra tecnologia sia costruita in casa, questa piattaforma è disponibile in commercio39. Per rilevare il segnale Raman sono necessarie apparecchiature aggiuntive, come due impulsi laser sincronizzati con un modulatore, un rilevatore di fotodiodi, un amplificatore lock-in e gli sforzi congiunti di un microscopio a scansione. D2O può essere facilmente acquistato dai fornitori di biotecnologie. Pertanto, i ricercatori possono accedere a questa tecnologia molto facilmente.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Yajuan Li e Anthony Fung per il loro supporto tecnico e il laboratorio Fraley per la linea cellulare. Riconosciamo i fondi iniziali di UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 e Hellman Fellow Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
References
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