Summary

Bioortogonal kjemisk avbildning av cellemetabolisme regulert av aromatiske aminosyrer

Published: May 12, 2023
doi:

Summary

Vi presenterer en protokoll for direkte å visualisere metabolske aktiviteter i celler regulert av aminosyrer ved bruk av deuteriumoksid (tungtvann D2O) probed stimulert Raman-spredning (DO-SRS) mikroskopi, som er integrert med to-foton eksitasjonsfluorescensmikroskopi (2PEF).

Abstract

Essensielle aromatiske aminosyrer (AAA) er byggesteiner for å syntetisere nye biomasser i celler og opprettholde normale biologiske funksjoner. For eksempel er en rikelig tilførsel av AAA viktig for kreftceller for å opprettholde sin raske vekst og deling. Med dette er det en økende etterspørsel etter en svært spesifikk, ikke-invasiv bildebehandling tilnærming med minimal prøveforberedelse for direkte å visualisere hvordan celler utnytter AAA for deres metabolisme in situ. Her utvikler vi en optisk bildebehandlingsplattform som kombinerer deuteriumoksid (D2O) sondering med stimulert Raman-spredning (DO-SRS) og integrerer DO-SRS med to-foton eksitasjonsfluorescens (2PEF) i et enkelt mikroskop for direkte å visualisere de metabolske aktivitetene til HeLa-celler under AAA-regulering. Samlet gir DO-SRS-plattformen høy romlig oppløsning og spesifisitet av nylig syntetiserte proteiner og lipider i enkelt HeLa-celleenheter. I tillegg kan 2PEF-modaliteten oppdage autofluorescenssignaler av nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) og Flavin på en etikettfri måte. Avbildningssystemet beskrevet her er kompatibelt med både in vitro – og in vivo-modeller , som er fleksibelt for ulike eksperimenter. Den generelle arbeidsflyten til denne protokollen inkluderer cellekultur, forberedelse av kulturmedier, cellesynkronisering, cellefiksering og prøveavbildning med DO-SRS- og 2PEF-modaliteter.

Introduction

Å være essensielle aromatiske aminosyrer (AAA), fenylalanin (Phe) og tryptofan (Tryp) kan absorberes av menneskekroppen for å syntetisere nye molekyler for å opprettholde normale biologiske funksjoner1. Phe er nødvendig for syntese av proteiner, melanin og tyrosin, mens Tryp er nødvendig for syntesen av melatonin, serotonin og niacin 2,3. Imidlertid kan overskytende forbruk av disse AAAene oppregulere pattedyrmålet for rapamycin (mTOR) -banen, hemme AMP-aktivert proteinkinase og forstyrre mitokondriell metabolisme, kollektivt endre makromolekylbiosyntese og føre til produksjon av ondartede forløpere, slik som reaktive oksygenarter (ROS) i friske celler 4,5,6. Direkte visualisering av endret metabolsk dynamikk under overflødig AAA-regulering er avgjørende for å forstå AAAs roller i å fremme kreftutvikling og vekst av friske celler 7,8,9.

Tradisjonelle AAA-studier er avhengige av gasskromatografi (GC)10. Andre metoder, som magnetisk resonansavbildning (MR), har begrensede romlige oppløsninger, noe som gjør det vanskelig å utføre cellulær og subcellulær analyse av biologiske prøver11. Nylig har matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) blitt utviklet for å belyse AAAs rolle i lipid- og proteinsynteser i kreftproliferasjon med ikke-invasive biomarkører12,13,14. Imidlertid lider denne teknikken fortsatt av grunne bildedybder, dårlig romlig oppløsning og omfattende prøvepreparering. På mobilnivå kan ikke-toksiske stabile isotoper, som nitrogen-15 og karbon-13, spores med multi-isotopavbildning og nanoskala sekundærionmassespektrometri for å forstå deres innlemmelse i makromolekyler. Disse metodene er imidlertid ødeleggende for levende biologiske prøver15,16. Atomkraftmikroskopi (AFM) er en annen kraftig teknikk som kan visualisere metabolsk dynamikk17. Den langsomme skannehastigheten under AFM-avbildning kan derimot forårsake bildeforvrengning av resultatet fra termisk drift.

Vi utviklet en ikke-invasiv biortogonal avbildningsmodalitet ved å koble deuteriumoksid (D2O) probed stimulert Raman-spredning (DO-SRS) mikroskopi og etikettfri to-foton eksitasjonsfluorescensmikroskopi (2PEF). Denne modaliteten oppnår en høy romlig oppløsning og kjemisk spesifisitet ved avbildning av biologiske prøver 18,19,20,21,22,23,24. Denne protokollen introduserer anvendelsene av DO-SRS og 2PEF for å undersøke den metabolske dynamikken til lipider, protein og redoksforhold under kreftprogresjoner. Med D2O som en stabil isotopform av vann, kan cellulære biomolekyler merkes med deuterium (D) på grunn av sin raske kompensasjon med totalt kroppsvann i celler, og danner karbon-deuterium (C-D) bindinger gjennom enzymatisk utveksling21. C-D-bindingene i nylig syntetiserte makromolekyler, inkludert lipider, proteiner, DNA / RNA og karbohydrater, kan detekteres i den cellestille regionen av Raman-spekteret 20,21,22,25,26,27. Med to synkroniserte laserpulser kan C-D-bindinger av nylig syntetiserte lipider og proteiner vises på enkeltceller via hyperspektral avbildning (HSI) uten å ekstrahere eller merke dem med cytotoksiske midler. I tillegg har SRS-mikroskopi evnen til å konstruere tredimensjonale (3D) modeller av utvalgte regioner av interesse for biologiske prøver ved å fange og kombinere et sett med tverrsnittsbilder22,26. Med hyperspektral og 3D volumetrisk avbildning kan DO-SRS oppnå romlige fordelinger av nylig syntetiserte makromolekyler i enkeltceller, sammen med typen organeller som letter prosessen med å fremme kreftvekst under AAA-regulering22. Videre kan vi ved hjelp av 2PEF oppnå autofluorescenssignaler av Flavin og nikotinamid-adenindinukleotid (NADH) med høy oppløsning, dyp penetrasjonsdybde og lavnivåskade i biologiske prøver21,23,24. Flavin og NADH autofluorescenssignaler har blitt brukt til å karakterisere redokshomeostase og lipidperoksidasjon i kreftceller22,26. Som sådan gir ikke bare koblingen av DO-SRS og 2PEF subcellulær analyse av AAA-regulert metabolsk dynamikk i kreftceller med høy romlig fordeling, kjemisk spesifisitetsinformasjon og minimal prøvepreparering, men metoden reduserer også behovet for å trekke ut eller merke endogene molekyler med giftige reagenser. I denne protokollen presenterer vi først prosedyrene forD2O– og aminosyrepreparat, samt kreftcellekultur. Deretter viser vi protokollene til DO-SRS-avbildning og 2PEF-bildebehandling. Til slutt presenterer vi de representative resultatene av SRS og 2PEF-avbildning, som viser AAA-regulerte metabolske endringer av lipider og protein, og endringer i redoksforhold i kreftceller. En detaljert illustrasjon av prosessen er uthevet i figur 1.

Protocol

1. Media forberedelse Klargjør 10 ml kontroll og overflødig AAA i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) som inneholder 50 % D2O.For kontrollmediet måles og blandes 10 mg DMEM pulver med 4,7 ml dobbeltdestillert vann (ddH2O) i et 15 ml konisk rør. DMEM-pulveret inneholder alle aminosyrene ved standardkonsentrasjoner. Virvel grundig og snu røret for å sikre at oppløsningen er godt blandet. Tilsett 4,7 ml D2O, 0,5 ml føtal bovint serum (5% FBS) …

Representative Results

Tilsetningen av overskytende AAA ved 15x konsentrasjoner til 50% D2O-holdige cellekulturmedier produserte distinkte C-D Raman-bånd av nylig syntetiserte lipider og proteiner i HeLa-celler (figur 2B). Tidligere eksperimenter ble utført med forskjellige konsentrasjonsnivåer, for eksempel 2x og 5x, og selv om dataene ikke presenteres, produserte 15x-konsentrasjonen de mest distinkte C-D Raman-båndene av nylig syntetiserte lipider og proteiner. Spesielt, ved å undersøke lipiddr?…

Discussion

DO-SRS og 2PEF-avbildning har blitt brukt til å undersøke metabolsk dynamikk i ulike ex vivo-modeller, inkludert Drosophila og humant vev 21,22,23,24,26,27,33. Avbildningsmodaliteten som brukes i denne studien integrerer DO-SRS og 2PEF-mikroskopi, som kan overgå andre molekylspes…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Yajuan Li og Anthony Fung for deres tekniske støtte, og Fraley-laboratoriet for cellelinjen. Vi anerkjenner oppstartsmidlene fra UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 og Hellman Fellow Award.

Materials

10 mL Serological Pipettes  Avantor (by VWR) 75816-100 https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 mL Conical Centrifuge Tube VWR 89039-664 https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664
16% Formaldehyde, Methanol-free ThermoFisher Scientific 28906 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
24-well plate Fisherbrand FB0112929 https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
25 mm Syringe Filter, 2 μm PES Foxx Life Sciences 381-2216-OEM https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 nm Filter Cube Olympus OCT-ET460/50M32
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote Olympus Supply power to the laser
Band-pass Filter KR Electronics KR2724 8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator  Mini Circuits STRM-50
BNC Cable Thorlabs 2249-C Coaxial Cable, BNC Male/Male
Broadband Dielectric Mirror Thorlabs BB1-E03 750 – 1100 nm
Centrifuge
Condenser Olympus
Cover Glass Corning 2850-25 https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
DC power supply TopWard 6302D
Dichroic Mount Thorlabs KM100CL
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent mpbio  196055 https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate MilliporeSigma 38210000 https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder
With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Corning MT10027CV https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20
FIJI ImageJ ImageJ Version 1.53t 24 August 2022 https://imagej.net/software/fiji/downloads
Heavy Water (Deuterium Oxide) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. 7732-18-5 https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
Hela Cells ATCC CCL-2 https://www.atcc.org/products/ccl-2
Hemocymeter MilliporeSigma Z359629-1EA https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI
zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk
QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr
SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL
w_wcB&gclsrc=aw.ds
High O.D. Bandpass Filter Chroma Technology ET890/220m Filter the Stokes beam and transmit the pump beam
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) Cytiva  SH300880340 https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340
HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution Cytiva SH30042.02 https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
Integrated SRS Laser System Applied Physics & Electronics, Inc. picoEMERALD picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam.  The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted Laser-scanning Microscope Olympus FV1200MPE
IX3-CBH Control box Olympus Control the laser-scanning microscope
Kinematic Mirror Mount Thorlabs POLARIS-K1-2AH 2 Low-Profile Hex Adjusters
L-Phenalynine Sigma P5482-25G https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-Tryptophan Sigma T8941-25G https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941
LabSpec 6 Horiba XploRA N/A https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
Lock-In Amplifier Zurich Instruments N/A https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
Long-pass Dichroic Beam Splitter Semrock Di02-R980-25×36 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MATLAB MathWorks Version: R2022b https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-003 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003
Microscopy Imaging Software Olympus FluoView
MPLN 100x, Olympus Olympus MPLAPON https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364
MPLN 50x, Olympus Olympus MPLAPON  https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363
NA Oil Condenser Olympus  6-U130 https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
Nail Polish Wet n Wild B01EO2G5O4 https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW
HHQP38FXXDC_0
Origin OriginLab Origin 2022b (9.95) https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
Parafilm Fisher Scientific S37440 https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Thermofischer – Gibco 14040117 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
Penicillin/Streptomycin Thermofischer – Gibco 15140122 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Periscope Assembly Thorlabs RS99 Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
picoEmerald System A.P.E N/A https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
Shielded Box with BNC Connectors Pomona Electronics 2902 Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female
Si Photodiode Detector Home Built N/A DYI series
Silicon Wafer
Spacers Grace Bio-Labs 654008 https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
Spontaneous Raman spectroscopy Horiba XploRA N/A https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
Stimulated Raman Scattering Microscopy Home Built N/A
Touch  Panel Controller Olympus Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl)  Lonza 17-942E https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
Tweezers Kaverme – Amazon B07RNVXXV1 https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"
Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy Home Built N/A
Weighing Paper  VWR 12578-165 https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper
Zurich LabOneQ Software Zurich Instruments Control the Zurich lock-in amplifier

References

  1. Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
  2. Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837 (2020).
  3. Parthasarathy, A., et al. A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29 (2018).
  4. Wang, H., et al. l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells. The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).
  5. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
  6. Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).
  7. Kimura, T., Watanabe, Y. Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction. Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).
  8. Ma, Q., et al. Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice. Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).
  9. Cheng, C., et al. Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).
  10. Lubes, G., Goodarzi, M. GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).
  11. Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R. The potential of metabolic imaging. Seminars in Nuclear Medicine. 46 (1), 28-39 (2016).
  12. Bowman, A. P., et al. Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).
  13. Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).
  14. Pirman, D. A., et al. Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), e61379 (2013).
  15. Li, Z., et al. Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 2869 (2021).
  16. Miyagi, M., Kasumov, T. Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378 (2016).
  17. Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy. Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).
  18. Fung, A. A., Shi, L. Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501 (2020).
  19. Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).
  20. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  21. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  22. Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702 (2021).
  23. Li, Y., et al. Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy. Frontiers in Aging. 2, 819903 (2022).
  24. Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila. Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).
  25. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  26. Fung, A. A., et al. Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism. Frontiers in Oncology. 12, 858017 (2022).
  27. Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes. Aging Cell. 21 (4), e13586 (2022).
  28. Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547 (2022).
  29. Rysman, E., et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).
  30. Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia. BMC Cancer. 19 (1), 501 (2019).
  31. Thiam, A. R., Dugail, I. Lipid droplet-membrane contact sites – from protein binding to function. Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).
  32. Schott, M. B., et al. Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes. The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).
  33. Hoang, K., et al. Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis. Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).
  34. Jang, H., et al. Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD. bioRxiv. , (2022).
  35. Li, Y., et al. Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain. bioRxiv. , (2022).
  36. Zhang, W., et al. Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging. bioRxiv. , (2022).
  37. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  38. Chang, T., et al. Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy. Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).
  39. Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope – Label Free Imaging. Leica Microsystems Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/ (2023)

Play Video

Cite This Article
Bagheri, P., Hoang, K., Kuo, C., Trivedi, H., Jang, H., Shi, L. Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids. J. Vis. Exp. (195), e65121, doi:10.3791/65121 (2023).

View Video