Summary
2光子励起蛍光顕微鏡(2PEF)と統合された酸化重水素(重水D2O)プローブ誘導ラマン散乱(DO-SRS)顕微鏡を使用して、アミノ酸によって制御される細胞の代謝活動を直接視覚化するプロトコルを提示します。
Abstract
必須芳香族アミノ酸(AAA)は、細胞内で新しいバイオマスを合成し、正常な生物学的機能を維持するための構成要素です。例えば、AAAの豊富な供給は、癌細胞が急速な成長と分裂を維持するために重要です。これに伴い、細胞がその 場での代謝のためにAAAをどのように利用しているかを直接視覚化するために、最小限のサンプル調製で高度に特異的で非侵襲的なイメージングアプローチに対する需要が高まっています。ここでは、酸化重水素(D2O)プロービングと誘導ラマン散乱(DO-SRS)を組み合わせた光学イメージングプラットフォームを開発し、DO-SRSと2光子励起蛍光(2PEF)を1つの顕微鏡に統合して、AAA制御下でのHeLa細胞の代謝活動を直接可視化します。DO-SRSプラットフォームは、単一のHeLa細胞ユニットで新たに合成されたタンパク質と脂質の高い空間分解能と特異性を提供します。さらに、2PEFモダリティは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)およびフラビンの自己蛍光シグナルをラベルフリーで検出できます。ここで説明するイメージングシステムは、in vitro モデルと in vivo モデルの両方に対応しており、さまざまな実験に柔軟に対応します。このプロトコルの一般的なワークフローには、細胞培養、培地調製、細胞同期、細胞固定、およびDO-SRSおよび2PEFモダリティによるサンプルイメージングが含まれます。
Introduction
必須の芳香族アミノ酸(AAA)であるフェニルアラニン(Phe)とトリプトファン(Tryp)は、人体に吸収されて、正常な生物学的機能を維持するための新しい分子を合成することができます1。Pheはタンパク質、メラニン、チロシンの合成に必要であり、Trypはメラトニン、セロトニン、ナイアシンの合成に必要です2,3。しかし、これらのAAAの過剰摂取は、ラパマイシン(mTOR)経路の哺乳類標的をアップレギュレートし、AMP活性化プロテインキナーゼを阻害し、ミトコンドリア代謝を妨害し、高分子生合成を集合的に変化させ、健康な細胞における活性酸素種(ROS)などの悪性前駆体の産生につながる可能性があります4,5,6.過剰なAAA調節下での変化した代謝動態の直接的な可視化は、がんの発生と健康な細胞の成長を促進するAAAの役割を理解するために不可欠です7,8,9。
従来のAAA研究は、ガスクロマトグラフィー(GC)10に依存しています。磁気共鳴画像法(MRI)などの他の方法は、空間分解能が制限されており、生物学的試料の細胞および細胞内分析を行うことを困難にしている11。最近、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)が開発され、非侵襲的バイオマーカーを用いて癌増殖における脂質およびタンパク質合成におけるAAAの役割を解明しました12,13,14。ただし、この手法では、イメージング深度が浅く、空間分解能が低く、サンプル調製が不十分です。細胞レベルでは、窒素15や炭素13などの無毒の安定同位体をマルチ同位体イメージングとナノスケールの二次イオン質量分析で追跡し、高分子への取り込みを理解することができます。しかしながら、これらの方法は、生きた生物学的試料に対して破壊的である15、16。原子間力顕微鏡(AFM)は、代謝動態を視覚化できるもう17つの強力な技術です。一方、AFMイメージング中のスキャン速度が遅いと、熱ドリフトによる結果の画像歪みが発生する可能性があります。
我々は、酸化重水素(D2O)プローブ誘導ラマン散乱(DO-SRS)顕微鏡とラベルフリー2光子励起蛍光顕微鏡(2PEF)を組み合わせることにより、非侵襲的な双直交イメージングモダリティを開発しました。このモダリティは、生物学的試料を画像化する際に高い空間分解能および化学的特異性を達成する18、19、20、21、22、23、24。このプロトコルでは、がんの進行に伴う脂質、タンパク質、および酸化還元比の変化の代謝動態を調べるためのDO-SRSおよび2PEFのアプリケーションを紹介します。D2Oは水の安定同位体形態であり、細胞内の全身水分との迅速な補償により、細胞生体分子は重水素(D)で標識され、酵素交換を介して炭素-重水素(C-D)結合を形成することができる21。脂質、タンパク質、DNA/RNA、炭水化物など、新たに合成された高分子のC-D結合は、ラマンスペクトル20,21,22,25,26,27の細胞サイレント領域で検出できます。2つの同期レーザーパルスにより、新たに合成された脂質とタンパク質のC-D結合を、細胞毒性物質で抽出または標識することなく、ハイパースペクトルイメージング(HSI)を介して単一細胞上に表示できます。加えて、SRS顕微鏡は、一組の断面画像を捕捉して組み合わせることによって、生物学的試料中の選択された関心領域の3次元(3D)モデルを構築する能力を有する22、26。ハイパースペクトルおよび3D体積イメージングにより、DO-SRSは、AAA規制22の下で癌の成長を促進するプロセスを促進する細胞小器官のタイプとともに、単一細胞で新しく合成された高分子の空間分布を取得できます。さらに、2PEFを使用すると、生体サンプル中のフラビンおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)の自己蛍光シグナルを、高分解能、深い浸透深さ、および低レベルの損傷で取得できます21、23、24。フラビンおよびNADHの自己蛍光シグナルは、癌細胞における酸化還元恒常性および脂質過酸化を特徴付けるために使用されています22,26。このように、DO-SRSと2PEFのカップリングは、高い空間分布、化学的特異性情報、および最小限のサンプル調製で、癌細胞におけるAAA調節代謝動態の細胞内分析を提供するだけでなく、内因性分子を毒性試薬で抽出または標識する必要性も低減します。このプロトコールでは、まずD2Oおよびアミノ酸調製、ならびに癌細胞培養の手順を提示する。次に、DO-SRSイメージングと2PEFイメージングのプロトコルを示します。最後に、AAA制御による脂質やタンパク質の代謝変化、がん細胞の酸化還元比変化などを示すSRSと2PEFイメージングの代表的な結果を紹介します。このプロセスの詳細な図を図 1 に示します。
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Protocol
1. 培地調製
- 50%D2Oを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10mLのコントロールおよび過剰のAAAを調製する。
- コントロール培地については、15 mLのコニカルチューブで10 mgのDMEM粉末を4.7 mLの二重蒸留水(ddH2O)と測定して混合します。DMEM粉末には、標準濃度のすべてのアミノ酸が含まれています。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。4.7 mLのD2O、0.5 mLのウシ胎児血清(5%FBS)、および0.1 mLのペニシリン/ストレプトマイシン(1%)を追加します。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。
- 15x Phe処理培地の場合、10 mgのDMEM粉末を4.7 mLのddH2O、0.5 mLのFBS(5%)、および0.1 mLのペニシリン/ストレプトマイシン(1%)と15 mLのコニカルチューブで測定および混合します。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。924 mg/Lの濃度で過剰なPhe粉末を培地に加えます。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。
- 15x Tryp処理培地の場合、10 mgのDMEM粉末を4.7 mLのddH2O、0.5 mLのFBS(5%)、および0.1 mLのペニシリン/ストレプトマイシン(1%)と15 mLのコニカルチューブで測定および混合します。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。224 mg/Lの濃度で過剰なトリップパウダーを培地に加えます。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。
- 前のステップのすべての円錐管に、メチオニンとスレオニンをそれぞれ30.0 mg / mLと95.0 mg / mLで追加します。チューブを完全に渦巻いて反転させます。ピルビン酸ナトリウムは、培地に添加する必要はありません。
- 0.22 μmポリエーテルスルホンメンブレンフィルターを備えた25 mmシリンジフィルターでコントロールおよび処理媒体をろ過します。
- すべてのメディアを含むコニカルチューブをパラフィルムで密封し、4°Cで最大3週間保管します。細胞を培地で処理する前に、すべての培地を37°Cに温めます。
注意: 粉末試薬と液体試薬は、処理媒体と対照媒体の総量に基づいて測定および組み合わせる必要があります。
2. 細胞サンプルの調製
- 子宮頸がん(HeLa)細胞を培養フラスコ(T10、T25など)で維持し、10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した標準DMEMを37°Cで、5%二酸化炭素(CO2)で維持します。
- HeLa細胞を1:10の分割比で、80%以上の細胞生存率に達するまで継代培養します。
- 細胞が80%以上のコンフルエント性に達したら、0.5%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEMを使用して、ウェルあたり2 x 105 細胞を24ウェルプレートに播種します。
- 細胞播種の前に、滅菌済みのポリ-d-リジン、ラミニンコーティングされた直径12 mmの丸いカバースリップを含む24ウェルプレートを準備します。カバーガラスを70%エタノールに浸し、糸くずの出ないワイプを使用して穏やかに乾かします。きれいなカバーガラスをプレートの適切なウェルに置きます。
- ステップ2.2で細胞が80%のコンフルエントに達したら、マグネシウムイオンとカルシウムイオンを含まない1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を1回洗浄します。
- 0.25%トリプシンを加えて接着細胞をフラスコから解離させ、37°Cおよび5%CO2 で3分間インキュベートします。
- 10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEMを添加し、上下に穏やかにピペットで移動させ、室温(RT)で300 x g で3分間遠心分離して細胞を回収します。
- 0.5%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEMに細胞を再懸濁します。
- 血球計算盤、光学顕微鏡、およびトリパンブルーを使用して細胞をカウントし、24ウェルプレートのウェルあたり2 x 105 細胞の密度を播種します。あるいは、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントすることもできます。
- 細胞を37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに戻し、プレートを静かに振って細胞を均等に分配する。
- 8時間後、古い培地を50%D2O/過剰Pheまたは50%D2O/過剰のトリップ培地と交換します。細胞を37°C、5%CO2 のインキュベーターに36時間戻す。
- 36時間後、細胞を顕微鏡スライドに固定します。
- 固定する前に、直径9 mmのイメージングスペーサーを備えた顕微鏡スライドを準備し、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを添加した1x PBSを15 μL置きます。
- カルシウムイオンとマグネシウムイオンを添加した1x PBSで細胞をすすぎます。
- 0.5 mLの4%メタノールフリーパラホルムアルデヒド(PFA)溶液を加え、プレートをバイオセーフティフードの下に約15分間放置します。
- PFA溶液を吸引し、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを2回添加した1x PBSですすいでください。
- カルシウムイオンとマグネシウムイオンを添加した1.5 mLの1x PBSを各ウェルに追加します。
- 滅菌ピンセットを使用して、各ウェルからカバーガラスをそっとつかみます。カバーガラスの細胞含有側を反転させてイメージングスペーサーに配置し、手順2.5.1で準備したPBSに接触させます。セルを含まない側が空気にさらされていることを確認してください。
- 透明なマニキュアを使用して、カバーガラスの外層をイメージングスペーサーでシールします。
- 顕微鏡スライドは、イメージングしないときは4°Cで保管してください。
3. 自発ラマン分光測定(図2)
- 共焦点ラマン顕微鏡を使用して、自発ラマンスペクトルを取得します(図2A)。
- キーを オン の位置に回して、レーザーをオンにします。
- LabSpec6ソフトウェアアイコンをダブルクリックして、集録ソフトウェアを開きます。
- 生体試料を対物レンズの真下のサンプルホルダーに装填します。
- ソフトウェアで、 をクリックします カメラ アイコン をクリックしてビデオカメラをオンにします。
- フォーカス面を調整して、50倍の対物レンズで関心領域を識別します。ジョイスティックを動かしてXYステージの平面移動を制御し、ジョイスティックを回転させて焦点深度を変更します。
- 測定位置を選択したら、40mWの励起電力を備えた100倍の対物レンズに切り替えます。赤い [停止 ] アイコンをクリックして、ビデオ カメラの電源を切ります。
- 1800ライン/mmのグレーティングを選択し、取得範囲を400 cm-1から3,150 cm-1に設定します。
- アクイジション時間を90秒、累積時間を3秒、ビニングを4に設定すると、ノイズが最も少なく、スペクトラムの精度が最も高くなります。
注:これらのイメージングパラメータは、実験に合わせて最適化できます。 - 矢印アイコンをクリックして、リアルタイム表示をオンにします。
- ラマンシフト(cm-1)を選択した値に調整して、フォーカス面を微調整します。
注:この実験では、ラマンレーザーを、高濃度のCH2結合を含む脂肪滴に集束させた。そこで、CH2結合の延伸モードに合致した2,850cm-1のラマンシフトを目的に選定した。 - ジョイスティックでフォーカスプレーンを調整して、最適な信号対雑音比を最適化します。
- フォーカス面を選択したら、赤い 停止 アイコンをクリックしてリアルタイム表示します。
- 円アイコンを選択して、スペクトル取得を開始します。
- 細胞領域を撮影したら、同じフォーカス面を使用してPBSで背景を測定します。Originなどの個別のコンピュータソフトウェアアプリケーションを使用して、各サブセルラーターゲットスペクトルからバックグラウンドスペクトルを差し引きます(図1B)。
4. 2PEFとSRSを用いたイメージング実験
注:SRSレーザーアライメントの詳細な説明は、以前のレポート28に記載されています。このプロトコルは、マルチモーダルSRSおよび2PEFイメージングシステムの動作に焦点を当てています(図2C、D)。
- クリック 開始 レーザーをウォームアップします。
- 指示に従って、コントロールユニットとモニターのメインスイッチをオンにします:1)コントロールボックスIX3-CBHのメインスイッチをオンに押し、2)タッチパネルコントローラーのメインスイッチをオンにし、3)メインレーザーコンバイナーFV31-SCOMBに接続されたLDOBIS 6レーザーリモートの電源のACアダプターのメインスイッチをオンにします、4)サブレーザーコンバイナーFV31-COMBに接続されているLD OBIS 6レーザーリモートの電源のACアダプターのメインスイッチをONにします。
- Siフォトダイオード検出器とロックインアンプのメインスイッチを押します amp。
- ストークスビームを1,031nm、パルス幅を6ps、繰り返し周波数を80MHzに設定します。
- 顕微鏡に結合して、波長720〜990nm、パルス幅5〜6ps、繰り返し速度80MHzの同期ポンプビームが供給されるピコエメラルドシステムを設定します。ポンプとストークスの両方の平均励起電力は450mWです。励起パワーを最適化して、サンプルの光損傷を最小限に抑えます。
- 高開口数(NA)オイルコンデンサー(つまり、1.4 NA)を使用して、コンデンサーに数滴を放出することにより、サンプルが取り付けられているストークスとポンプビームを収集します。
- サンプルをオイルにマウントし、サンプルが固定されている顕微鏡スライドの上に大きな水滴を置きます。水浸対物レンズ用です。
- ロックインアンプを20MHzに設定し、超解像ソフトウェアモジュールを使用して画像を処理します。
- 滞留時間には512ピクセルx512ピクセルと80μs/ピクセルを選択します。
- 目的の細胞領域が適切に焦点を合わせられたら、画像を取得します。顕微鏡の取得ソフトウェアを使用して、画像をオリンパスの.oirグラフィックファイルとして保存します。
- 1,900 cm-1 の背景画像を取得し、すべてのセルラー画像から減算します。
- 2PEFイメージングを行うには、同じチューナブルピコ秒レーザーを使用し、フラビンとNADHのラベルフリー自家蛍光をそれぞれ800 nmと780 nmに設定します。
- 460 nm/515 nmのフィルターキューブを使用して、フラビンおよびNADHの自家蛍光後方散乱放射を収集します。
- 滞留時間を 8 μs/ピクセルに、ピクセル サイズを 512 ピクセル x 512 ピクセルに調整します。レーザーシャッター出力パラメータを150mWに設定します。
- 3D画像再構成の場合は、誘導ラマン損失を2,850 cm-1 (797 nm)に調整します。
- 目的の単一細胞が特定されたら、レーザーを登録して上焦点面からスキャンし、それらの細胞の最上層と最下層を検出します。
注: 3D モデルが生成され、.oir ファイルとして保存されます。
5. スペクトルと画像解析
- スペクトル解析
- Originソフトウェアまたはその他の関連アプリケーションを使用して、すべての細胞内ターゲットスペクトルからバックグラウンドスペクトルを差し引きます。
- MATLABの数学的モデリング操作を使用して、ソフトウェアの組み込み関数でラマンスペクトルを処理します。Pythonはスペクトル処理にも使用できます。
- スペクトルの前処理は、ファイルを配列に変換することから始まります。スペクトルは、すべての逆センチメートルで補間されます。
- 検証のために、生データをグラフ化します。MATLAB の組み込み関数 msbackadj を使用して、生のスペクトルのベースライン補正を実行します。簡単に言うと、組み込み関数は、ユーザーが識別した分離単位値でベースラインポイントを推定し、隣接するウィンドウ間の距離を返します。ベースラインポイントから、回帰直線を推定して描画します。 スムージング を適用して回帰直線を平滑化し、個々の生スペクトルからベースラインを減算します。
- 2,930 cm-1におけるタンパク質のラマン強度を各ラマンシフトの強度で割ることにより、min-max 正規化を実行します。2,930 cm-1 の信号は、通常、ラマンスペクトル上で最も高い強度です。この正規化では、最大値は 1 に変換され、最小値は 0 に変換されます。他のすべての値は、0 から 1 までの 10 進数に変換されます。
- 同じ条件の個々のスペクトルを単一のスペクトルに平均化して、ノイズを低減します。
- 処理が完了したら、Originなどのアプリケーションを使用して、すべてのスペクトルを同時に表示します。スペクトルに表示されるピークは、特定の化学結合または官能基を表します。
- 脂肪滴の3D画像解析
- FIJI-ImageJソフトウェアを使用してすべての3D画像を処理する
- 3D画像スタックの バンドパスフィルター と スムージング の機能を実行します。
- 3D画像解析では、各脂肪滴を、その重心から表面までの距離を測定することによって計算された球面スコアに割り当てます。各球面スコアを、同じユークリッド平面上の完全な球面の球面スコアと比較します。球状スコアの低い脂肪滴を廃棄し、残りの脂肪滴の量と数を評価します。
- 適切な統計ソフトウェアアプリケーションで統計的有意性を得るために、異なる処理間の脂肪滴の量と数を分析します。ここでは、グラフパッドプリズムを使用しました。
- 2Dハイパースペクトル画像解析
- FIJI-ImageJソフトウェアを使用して、すべての2Dハイパースペクトル画像を処理します。
- 2,930 cm-1 チャンネルを選択して、0 と 1 の値を含むマスク画像を作成します。背景を 0 に、セルラー領域を 1 に割り当てます。
- 重水素標識タンパク質チャネル(2,175 cm-1)をバックグラウンドチャネル(1,900 cm-1)に減算して、蛍光効果を除去します。
- 得られた重水素標識タンパク質チャネルをタンパク質チャネル(2,930 cm-1)で除し、タンパク質代謝回転率レシオメトリック画像を取得します。
- 次に、手順5.3.2で作成したマスク画像にレシオメトリック画像を掛けて、残っているバックグラウンドノイズを取り除きます。その結果、各レシオメトリック画像に暗い背景が生成されます。
- FIJI-ImageJの フリーハンド選択 ツールを使用して、単一セルに表示されるピクセル強度を手動でセグメント化して計算します。ピクセル強度は、視覚化されている化学結合の濃度に対応します。
- 適切な統計ソフトウェアアプリケーションで統計的有意性のピクセル強度を分析します。ここでは、グラフパッドプリズムを使用しました。残りのレシオメトリック分析でこの分析を繰り返します。
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Representative Results
50%D2O含有細胞培養培地に15倍の濃度で過剰のAAAを添加すると、HeLa細胞において新たに合成された脂質およびタンパク質の明確なC-Dラマンバンドが生じた(図2B)。以前の実験は、2倍や5倍などの異なる濃度レベルで行われ、データは提示されていませんが、15倍の濃度は、新しく合成された脂質とタンパク質の最も明確なC-Dラマンバンドを生成しました。具体的には、脂肪滴(LD)を調べることにより、15x Pheと15x Trypの両方が、それぞれ2,143 cm-1 と2,172 cm-1で新しく合成された脂質とタンパク質シグナルを誘導することを発見しました。その後、DO-SRSを使用して、単一細胞上のC-Dシグナルの空間分布を視覚化しました(図3)。ImageJを使用して、 図3Aの白い点線の境界線で示されているように、個々のセルのピクセル強度を手動でセグメント化して計算しました。コントロール細胞は、中程度のC-D脂質およびタンパク質バンドを示します。ただし、15x Pheおよび15x Trypは、より強いC-D脂質およびタンパク質バンドを示します。定量分析では、過剰なAAAは脂質合成を10%〜17%アップレギュレートするが、タンパク質シンセシスを10%ダウンレギュレートする可能性があることを示しています(図3C、D)。結果は、新たに合成された脂質を蓄積し、ミトコンドリアの機能不全を促進し、過剰なAAA調節下で酸化的不均衡を誘発するオートファジーの欠如の可能性を推測します7。
がん代謝に対するAAAの効果を理解するために、不飽和脂質(~3,011 cm-1)、飽和脂質(~2,880 cm-1)、およびNADH、FlavinのラベルフリーマルチモーダルSRSおよび2PEFイメージングを取得しました。同様に、個々のセルのピクセル強度は、 図3Bの白い点線の境界線で示されているように、ImageJを使用して手動でセグメント化および計算されました。AAA処理細胞のレシオメトリック分析では、不飽和脂質/飽和脂質が10%増加し、フラビン/フラビン+ NADHが50%増加しました(図3E、F)。ミトコンドリアの電子伝達系において、ROSは、NADHおよびFADH2 から分子状酸素種への電子の移動から生成され得る。多くの癌細胞におけるROSの蓄積は、不飽和脂肪酸を酸化し、飽和脂肪酸合成を促進し、NADH自家蛍光シグナルを枯渇させる酸化的不均衡をもたらす。したがって、観察されたフラビン/フラビン+ NADHの増加は、NADH自家蛍光シグナルを減少させる蓄積ROSの指標である。酸化的不均衡に応答して、HeLa細胞は不飽和脂質合成をアップレギュレートして酸化されたものを置き換える可能性があります。この応答は、他の癌細胞株29では観察されず、これは、過剰のAAA食餌30下での癌細胞の代謝不均一性を意味する。
マルチモーダルイメージングに加えて、SRSは、コントロールおよびAAA処理HeLa細胞のLDのラベルフリー3D画像を再構築できます。簡単に言うと、顕微鏡は、選択した関心領域全体で一連の断面画像を生成します。この研究では、誘導ラマン損失(SRL)を2,845 cm-1に調整し、1 μmのステップサイズで最上層から最下層までスキャンしました(図4A)。3D脂肪滴の定量分析により、LDは対照と比較してAAA処理細胞ではサイズが小さくなりましたが、カウントが増加したことが明らかになりました(図4B、C)。TrypやPheなどのかさばる疎水性アミノ酸の存在の増加は、LDコーティングタンパク質の機能を損なう可能性があります。これは最終的に脂肪分解を減少させ、それは多数の小さなLDを蓄積する。この研究のラベルフリー3D SRS体積イメージング結果は、過剰なAAA処理細胞が多数のより小さなLDを示すことを視覚化することにより、以前の研究を裏付けています31,32。
図1:DO-SRSと2PEFによる画像取得と解析の説明図。 (A)脂肪滴数、体積、球面スコアを取得するための3D画像の再構成と解析。(B)重水素標識脂質(CDL;2,145 cm-1)、脂質(2,845 cm-1)、重水素標識タンパク質(CDP;2,175 cm-1)、タンパク質(2,940 cm-1)、不飽和脂質(3,011cm-1)、飽和脂質(2,880 cm-1)、NADH、およびフラビンのハイパースペクトルイメージングと分析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:自発ラマン分光法と誘導ラマン散乱顕微鏡の物理的セットアップ 。 (A)この研究に使用した自発ラマン分光法のセットアップ。(B)CDラベル(赤)、CDラベルなし(黒)、対照群(青、実線)、15x Phe処理群(赤、点線)、および15x Tryp処理群(ピンク、点線)の自発ラマンスペクトルのサンプル。(C)この調査に使用した誘導ラマン散乱顕微鏡セットアップの概略図。(D)DO-SRSおよび2PEFプラットフォームとして使用される誘導ラマン散乱顕微鏡のセットアップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:DO-SRSおよび2PEF顕微鏡を用いたHeLa細胞の代謝動態の可視化。 (A)重水素標識脂質(2,145 cm-1)、脂質(2,845 cm-1)、重水素標識タンパク質(2,175 cm-1)、タンパク質(2,940 cm-1)を制御下(Ctrl)のHeLa細胞で可視化し、15xフェニルアラニン(15x Phe)、および15xトリプトファン(15xトリップ)をDO-SRSプラットフォームで可視化しました。脂質代謝回転率およびタンパク質代謝回転率は、 および 
として算出
した。生の画像を最初にPBS信号によって差し引いてバックグラウンド強度を除去し、ImageJを使用して細胞外の強度を除去するためにマスクしました。レシオメトリック分析のためにピクセル単位の分割が行われました。(B)2PEF顕微鏡で可視化したNADHおよびフラビンチャネル、およびラベルフリーSRS顕微鏡で可視化した不飽和脂質(3,011 cm-1)および飽和脂質(2,880 cm-1)。光学酸化還元比および飽和比は、および
を用いて
算出した。(C-F)制御下の各HeLa細胞、15x Phe、および15x Tryp条件のレシオメトリック強度の定量化。統計的差を用いて、過剰AAA条件を対照条件と比較した。p < 0.0001, **p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05は、二元配置分散分析検定から計算されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ラベルフリーSRS顕微鏡を用いた単一HeLa細胞の3D脂肪滴分布の可視化 。 (A)制御下および過剰AAA条件下でのHeLa細胞におけるSRS 3D脂肪滴量の投影。閾値は分析前に定義され、脂肪滴シグナル分布が明らかになりました。(B,C)二元配置分散分析法を用いた対照群および過剰AAA条件下の個々のHeLa細胞内の脂肪滴量およびカウントの定量化。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
DO-SRSおよび2PEFイメージングは、ショウジョウバエおよびヒト組織を含む様々なex vivoモデルにおける代謝動態を調べるために適用されている21,22,23,24,26,27,33。この研究で使用されたイメージングモダリティは、DO-SRSと2PEF顕微鏡を統合しており、分子抽出や細胞毒性試薬による標識の必要性を排除し、最小限のサンプル調製で済むため、他の分子特異的イメージング法を凌駕することができます。具体的には、DO-SRS顕微鏡は、動物や細胞におけるde novo脂質生成とタンパク質合成を調べ、その場でそれらの代謝動態を視覚化することを可能にします23,27,34。 2PEFは、生物学的サンプル中のフラビンやNADHなどの天然に存在する生体分子の自家蛍光シグナルを捕捉します35,36。SRSの画像化浸透深さは、より少ない散乱試料37において200〜500μmまで達成することができる。尿素などの組織透明化法では、浸透深さは10倍以上増加する可能性があります37。SRSと2PEFを組み合わせることで、生体サンプル中のフラビンやNADHなどの内因性蛍光色素をイメージングすることができ、検出のための外因性バイオマーカーの必要性がさらになくなります。2PEFは500μm38の浸透深さを達成することができます。マルチカラー単光子共焦点蛍光顕微鏡などの他のマルチプレックスイメージングモダリティと比較して、DO-SRSと2PEFはどちらも、細胞毒性の外因性バイオマーカーなしで有意に大きな浸透深さを達成できます。
DO−SRSおよび2PEFの空間分解能を高めるために、我々は、適応モーメント推定(Adam)ベースの点描画デコンボリューション(A−PoD)画像後処理ツール34を開発した。A-PoDは、回折限界のDO-SRSおよび2PEF画像を、ハードウェアの改善を必要とせずに超解像画像に変換できます。さらに、ラマンスペクトルには、検出可能な分子の数を増やすために利用できる多くの特定の化学振動モードが含まれています。この利点を利用して、私たちの研究室は、細胞および組織モデル36における複数の脂質種を区別するためのペナルティ付き参照マッチング(PRF)法をさらに生成しました。これらの2つの技術開発は、脳、癌、および老化プロセスの代謝変化を特徴付けるために使用されてきた細胞および細胞内レベルで生物学的プロセスをより詳細に研究するための新しい道を開きます26,27,35。
このプロトコルの1つの主な制限は、明瞭で定量化可能なC−Dラマンバンドを生成するための細胞試料とD2Oとのインキュベーションの濃度および時間である。HeLa細胞などのより堅牢で代謝的に活性な細胞株は、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞などの非罹患哺乳動物細胞株よりも速い速度で、新たに合成された高分子に重水素原子を取り込むことができ、2つの異なる細胞株におけるD2Oとの同じ濃度および時間のインキュベーションについて観察される様々なC−D強度をもたらす21。さらに、D2Oを80%以上の濃度で48時間投与すると、細胞試料に毒性が導入され得る。最適なD2O濃度およびインキュベーション時間を特定するための最適化実験は、望ましい結果を達成するために必要である。
このプロトコルの重要な側面は、DO-SRSと2PEFイメージングの統合です。通常、DO-SRSと2PEFモダリティは、その狭い帯域幅をSRSおよび2PEF信号で最適化できるため、同じピコ秒励起レーザーを共有します。当社の技術は自社開発ですが、このプラットフォームは市販されています39。ラマン信号を検出するには、変調器を備えた2つの同期レーザーパルス、フォトダイオード検出器、ロックインアンプ、走査型顕微鏡の共同の取り組みなどの追加の機器が必要です。D2Oは、バイオテクノロジーベンダーから容易に購入することができる。したがって、研究者はこのテクノロジーに非常に簡単にアクセスできます。
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Disclosures
著者には、競合する金銭的利益またはその他の利益相反はありません。
Acknowledgments
技術サポートを提供してくださったYajuan Li博士とAnthony Fung博士、そして細胞株を提供してくれたFraleyラボに感謝します。UCSD、NIH U54CA132378、NIH 5R01NS111039、NIH R21NS125395、NIHU54DK134301、NIHU54 HL165443、ヘルマンフェロー賞からのスタートアップ資金に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
References
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