Summary
Vi presenterar ett protokoll för att direkt visualisera metaboliska aktiviteter i celler som regleras av aminosyror med hjälp av deuteriumoxid (tungt vatten D2O) sonderad stimulerad Raman-spridning (DO-SRS) mikroskopi, som är integrerad med två-fotonexcitationsfluorescensmikroskopi (2PEF).
Abstract
Essentiella aromatiska aminosyror (AAA) är byggstenar för att syntetisera ny biomassa i celler och upprätthålla normala biologiska funktioner. Till exempel är ett rikligt utbud av AAA viktigt för cancerceller att behålla sin snabba tillväxt och delning. Med detta finns det en ökande efterfrågan på en mycket specifik, icke-invasiv bildmetod med minimal provberedning för att direkt visualisera hur celler utnyttjar AAA för sin metabolism in situ. Här utvecklar vi en optisk avbildningsplattform som kombinerar deuteriumoxid (D2O) sondering med stimulerad Raman-spridning (DO-SRS) och integrerar DO-SRS med tvåfotonexcitationsfluorescens (2PEF) i ett enda mikroskop för att direkt visualisera de metaboliska aktiviteterna hos HeLa-celler under AAA-reglering. Sammantaget ger DO-SRS-plattformen hög rumslig upplösning och specificitet av nyligen syntetiserade proteiner och lipider i enskilda HeLa-cellenheter. Dessutom kan 2PEF-modaliteten detektera autofluorescenssignaler av nikotinamidadenindinukleotid (NADH) och Flavin på ett etikettfritt sätt. Bildsystemet som beskrivs här är kompatibelt med både in vitro- och in vivo-modeller , vilket är flexibelt för olika experiment. Det allmänna arbetsflödet för detta protokoll inkluderar cellodling, förberedelse av odlingsmedia, cellsynkronisering, cellfixering och provavbildning med DO-SRS- och 2PEF-modaliteter.
Introduction
Att vara essentiella aromatiska aminosyror (AAA), fenylalanin (Phe) och tryptofan (Tryp) kan absorberas av människokroppen för att syntetisera nya molekyler för att upprätthålla normala biologiska funktioner1. Phe behövs för syntesen av proteiner, melanin och tyrosin, medan Tryp krävs för syntesen av melatonin, serotonin och niacin 2,3. Överdriven konsumtion av dessa AAA kan dock uppreglera däggdjursmålet för rapamycinvägen (mTOR), hämma AMP-aktiverat proteinkinas och störa mitokondriell metabolism, kollektivt förändra makromolekylbiosyntesen och leda till produktion av maligna prekursorer, såsom reaktiva syreradikaler (ROS) i friska celler 4,5,6. Direkt visualisering av förändrad metabolisk dynamik under överskott av AAA-reglering är avgörande för att förstå AAA: s roller för att främja cancerutveckling och tillväxt av friska celler 7,8,9.
Traditionella AAA-studier bygger på gaskromatografi (GC)10. Andra metoder, såsom magnetisk resonanstomografi (MRT), har begränsade rumsliga upplösningar, vilket gör det svårt att utföra cellulär och subcellulär analys av biologiska prover11. Nyligen har matrisassisterad laserdesorption / jonisering (MALDI) utvecklats för att belysa AAA: s roll i lipid- och proteinsynteser vid cancerproliferation med icke-invasiva biomarkörer12,13,14. Denna teknik lider dock fortfarande av grunda bilddjup, dålig rumslig upplösning och omfattande provberedning. På cellulär nivå kan icke-toxiska stabila isotoper, såsom kväve-15 och kol-13, spåras med multiisotopavbildning och nanoskala sekundär jonmasspektrometri för att förstå deras införlivande i makromolekyler. Dessa metoder är dock destruktiva för levande biologiska prover15,16. Atomkraftmikroskopi (AFM) är en annan kraftfull teknik som kan visualisera metabolisk dynamik17. Den långsamma skanningshastigheten under AFM-avbildning kan å andra sidan orsaka bildförvrängning av resultatet från termisk drift.
Vi utvecklade en icke-invasiv biortogonal avbildningsmodalitet genom att koppla deuteriumoxid (D2O) sonderad stimulerad Raman-spridning (DO-SRS) mikroskopi och etikettfri tvåfotonexcitationsfluorescensmikroskopi (2PEF). Denna modalitet uppnår en hög rumslig upplösning och kemisk specificitet vid avbildning av biologiska prover 18,19,20,21,22,23,24. Detta protokoll introducerar tillämpningar av DO-SRS och 2PEF för att undersöka den metaboliska dynamiken hos lipider, protein och redoxkvotförändringar under cancerprogressioner. EftersomD2Oär en stabil isotopform av vatten kan cellulära biomolekyler märkas med deuterium (D) på grund av dess snabba kompensation med totalt kroppsvatten i celler och bildar kol-deuterium (C-D) bindningar genom enzymatisk utbyte21. C-D-bindningarna i nyligen syntetiserade makromolekyler, inklusive lipider, proteiner, DNA / RNA och kolhydrater, kan detekteras i den celltysta regionen av Raman-spektrumet 20,21,22,25,26,27. Med två synkroniserade laserpulser kan C-D-bindningar av nyligen syntetiserade lipider och proteiner visas på enskilda celler via hyperspektral avbildning (HSI) utan att extrahera eller märka dem med cytotoxiska medel. Dessutom har SRS-mikroskopi förmågan att konstruera tredimensionella (3D) modeller av utvalda regioner av intresse för biologiska prover genom att fånga och kombinera en uppsättning tvärsnittsbilder22,26. Med hyperspektral och 3D-volymetrisk avbildning kan DO-SRS erhålla rumsliga fördelningar av nyligen syntetiserade makromolekyler i enskilda celler, tillsammans med den typ av organeller som underlättar processen att främja cancertillväxt enligt AAA-förordning22. Vidare kan vi med hjälp av 2PEF erhålla autofluorescenssignaler av flavin och nikotinamidadenindinukleotid (NADH) med hög upplösning, djupt penetrationsdjup och lågnivåskador i biologiska prover21,23,24. Flavin och NADH autofluorescenssignaler har använts för att karakterisera redoxhomeostas och lipidperoxidation i cancerceller22,26. Kopplingen mellan DO-SRS och 2PEF ger inte bara subcellulär analys av AAA-reglerad metabolisk dynamik i cancerceller med hög rumslig fördelning, kemisk specificitetsinformation och minimal provberedning, utan metoden minskar också behovet av att extrahera eller märka endogena molekyler med toxiska reagens. I detta protokoll presenterar vi först procedurerna förD2O- och aminosyrapreparat samt cancercellodling. Därefter visar vi protokollen för DO-SRS-avbildning och 2PEF-avbildning. Slutligen presenterar vi de representativa resultaten av SRS- och 2PEF-avbildning, som visar AAA-reglerade metaboliska förändringar av lipider och protein, och redoxkvotförändringar i cancerceller. En detaljerad illustration av processen markeras i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av media
- Bered 10 ml kontroll och överskott av AAA i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) innehållande 50% D2O.
- För kontrollmediet, mät och blanda 10 mg DMEM-pulver med 4,7 ml dubbeldestillerat vatten (ddH2O) i ett 15 ml koniskt rör. DMEM-pulvret innehåller alla aminosyror vid standardkoncentrationer. Virvla noggrant och vänd röret för att säkerställa att lösningen är väl blandad. Tillsätt 4,7 mlD2O, 0,5 ml fetalt bovint serum (5% FBS) och 0,1 ml penicillin/streptomycin (1%). Virvla noggrant och vänd röret för att säkerställa att lösningen är väl blandad.
- För 15x Phe-behandlingsmediet, mät och blanda 10 mg DMEM-pulver med 4,7 mlddH2O, 0,5 ml FBS (5%) och 0,1 ml penicillin / streptomycin (1%) i ett 15 ml koniskt rör. Virvla noggrant och vänd röret för att säkerställa att lösningen är väl blandad. Tillsätt överskott av Phe-pulver i en koncentration av 924 mg / L till mediet. Virvla noggrant och vänd röret för att säkerställa att lösningen är väl blandad.
- För 15x Tryp behandlingsmedium, mäta och blanda 10 mg DMEM pulver med 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5%) och 0,1 ml penicillin / streptomycin (1%) i en 15 ml konisk rör. Virvla noggrant och vänd röret för att säkerställa att lösningen är väl blandad. Tillsätt överskott av tryp pulver i en koncentration av 224 mg / L till mediet. Virvla noggrant och vänd röret för att säkerställa att lösningen är väl blandad.
- Tillsätt metionin och treonin vid 30,0 mg/ml respektive 95,0 mg/ml till alla koniska rör i föregående steg. Virvel noggrant och invertera röret. Natriumpyruvat behöver inte tillsättas till odlingsmediet.
- Filtrera kontroll- och behandlingsmediet med ett 25 mm sprutfilter med 0,22 μm polyetersulfonmembranfilter.
- Förslut alla medieinneslutna koniska rör med parafilm och förvara vid 4 °C i upp till 3 veckor. Innan cellerna behandlas med media, värm alla medier till 37 °C.
OBS: Pulvret och de flytande reagenserna ska mätas och kombineras baserat på den totala volymen av behandlings- och kontrollmedier.
2. Förberedelse av cellprov
- Behåll celler från livmoderhalscancer (HeLa) i en odlingskolv (dvs. T10, T25, etc.) med standard DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin vid 37 °C och 5% koldioxid (CO2).
- Subkultur HeLa-cellerna med ett delningsförhållande på 1:10 tills de når 80% eller högre cellviabilitet.
- När cellerna uppnår 80% eller högre sammanflöde, fortsätt att fröa 2 x 10 5 celler per brunn på en 24-brunnsplatta med DMEM kompletterad med0,5 % FBS och 1% penicillin / streptomycin.
- Före cellsådd, förbered en 24-brunnsplatta med steriliserad, poly-d-lysin, lamininbelagda, runda täckglas, 12 mm i diameter. Sänk ner täckglasen i 70% etanol och torka försiktigt med luddfria våtservetter. Placera de rena täckglasen i lämpliga brunnar på plattan.
- När cellerna når 80% sammanflöde i steg 2.2, tvätta cellerna en gång med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan magnesium och kalciumjoner.
- Tillsätt 0,25 % trypsin för att skilja de vidhäftande cellerna från kolven och inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i 3 minuter.
- Tillsätt DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin, pipettera försiktigt upp och ner och samla cellerna genom centrifugering vid 300 x g vid rumstemperatur (RT) i 3 minuter.
- Resuspendera cellerna i DMEM kompletterat med 0,5% FBS och 1% penicillin/streptomycin.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer, ljusmikroskop och trypanblått och frö en densitet på 2 x 105 celler per brunn på en 24-brunnsplatta. Alternativt kan en automatiserad cellräknare användas för att räkna cellerna.
- Sätt tillbaka cellerna i inkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2 och skaka försiktigt plattan för att fördela cellerna jämnt.
- Efter 8 timmar, byt ut det gamla odlingsmediet mot 50% D2 O / överskott Phe eller 50% D2O / överskott av Tryp media. Återför cellerna till inkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2 i 36 timmar.
- Efter 36 timmar, fixa cellerna på mikroskopglas.
- Före fixering, förbered mikroskopglas med bilddistanser 9 mm i diameter och placera 15 μL 1x PBS kompletterat med kalcium- och magnesiumjoner.
- Skölj cellerna med 1x PBS kompletterat med kalcium- och magnesiumjoner.
- Tillsätt 0,5 ml 4% metanolfri paraformaldehydlösning (PFA) och låt plattan stå under biosäkerhetshuven i cirka 15 minuter.
- Aspirera PFA-lösningen och skölj med 1x PBS kompletterat med kalcium- och magnesiumjoner två gånger.
- Tillsätt 1,5 ml 1x PBS kompletterat med kalcium- och magnesiumjoner i varje brunn.
- Använd steril pincett för att försiktigt ta tag i täckglasen ur varje brunn. Vänd upp och ned på den cellinnehållande sidan av täckglasen på distanserna för bildbehandling för att komma i kontakt med PBS som förberetts i steg 2.5.1. Se till att den icke-cellinnehållande sidan utsätts för luft.
- Använd transparent nagellack och försegla det yttre lagret av täckglaset med bilddistansen.
- Förvara mikroskopglasen vid 4 °C när de inte avbildas.
3. Spontan Ramanspektroskopimätning (figur 2)
- Använd ett konfokalt Raman-mikroskop för att erhålla spontana Ramanspektra (figur 2A).
- Slå på lasern genom att vrida nyckeln till ON-läge .
- Dubbelklicka på LabSpec6-programvaruikonen för att öppna förvärvsprogramvaran.
- Fyll det biologiska provet på provhållaren direkt under objektivlinsen.
- Klicka på Kamera på programvaran för att slå på videokameran.
- Justera fokusplanet för att identifiera ett område av intresse med 50x objektivet. Flytta joysticken för att styra geometriöversättningen av XY-steget och rotera joysticken för att ändra skärpedjupet.
- När du har valt position för mätning, byt till 100x objektivlinsen med 40 mW excitationseffekt. Klicka på den röda stoppikonen för att stänga av videokameran.
- Välj ett galler på 1800 linjer/mm och ställ in förvärvsområdet från 400 cm-1 till 3 150 cm-1.
- Ställ in förvärvstiden på 90 s, ackumuleringen på 3 och binningen på 4 för minsta brus och mest exakta spektrum.
Dessa bildparametrar kan optimeras för att passa experimentet. - Klicka på pilikonen för att aktivera realtidsvisningen.
- Ställ in Raman-förskjutningen (cm-1) till ett valfritt värde för att finjustera fokusplanet.
OBS: I detta experiment fokuserades Raman-lasern på lipiddropparna, som innehöll en hög koncentration avCH2-bindningar. Därför valdes en Raman-förskjutning på 2 850 cm-1 som matchade sträckningslägena för CH 2-bindningen för ändamålet. - Justera fokusplanet med joysticken för att optimera det bästa signal-brusförhållandet.
- När du har valt fokusplan klickar du på den röda stoppikonen för en realtidsvisning.
- Välj ikonen Cirkel för att starta spektrumförvärvet.
- När cellområdet har tagits, använd samma fokusplan för att mäta bakgrunden med PBS. Subtrahera bakgrundsspektrumet från varje subcellulärt målspektrum med hjälp av ett separat datorprogram, till exempel Origin (Figur 1B).
4. Bildexperiment med 2PEF och SRS
OBS: Detaljerade beskrivningar av SRS laseruppriktning finns i en tidigare rapport28. Detta protokoll fokuserar på driften av ett multimodalt SRS- och 2PEF-bildsystem (figur 2C, D).
- Klicka på Start för att värma upp lasern.
- Följ ordern för att sätta på styrenhetens huvudbrytare och monitorn: 1) tryck på huvudströmbrytaren på kontrollboxen IX3-CBH till På, 2) tryck på huvudströmbrytaren på pekskärmskontrollen till På, 3) tryck på huvudströmbrytaren på nätadaptern på strömförsörjningen för LD OBIS 6 Laser Remote ansluten till huvudlaserkombineraren FV31-SCOMB till Påoch 4) tryck på huvudströmbrytaren på nätadaptern på strömförsörjningen för LD OBIS 6 Laser Remote ansluten till sublaserkombineraren FV31-SCOMB till På.
- Tryck på huvudbrytarna på Si-fotodioddetektorn och låsförstärkaren På.
- Ställ in Stokes Beam på 1 031 nm, pulsbredden på 6 hk och repetitionshastigheten på 80 MHz.
- Kopplat till mikroskopet, ställ in picoEmerald-systemet som levereras med den synkroniserade pumpstrålen med en avstämbar våglängd från 720-990 nm, en pulsbredd på 5-6 ps och en repetitionshastighet på 80 MHz. Den genomsnittliga excitationseffekten för både pumpen och Stokes är 450 mW. Optimera excitationseffekten för att minimera fotoskador för provet.
- Använd en oljekondensor med hög numerisk öppning (NA) (dvs. 1,4 NA) för att samla upp Stokes och pumpbalkarna där provet är monterat genom att avge några droppar på kondensorn.
- Montera provet på oljan och placera en stor vattendroppe ovanpå mikroskopglaset där provet är fixerat. Detta är för objektivlinsen för vatten-nedsänkning.
- Ställ in lock-in-förstärkaren på 20 MHz. Bearbeta bilden nu med hjälp av programvarumodulen för superupplösning.
- Välj 512 pixlar x 512 pixlar och 80 μs/pixel för uppehållstiden.
- När den önskade cellulära regionen är korrekt fokuserad, skaffa bilden. Använd mikroskopets förvärvsprogramvara och spara bilderna som en Olympus .oir-grafikfil.
- Hämta en bakgrundsbild på 1 900 cm-1 och subtrahera den från alla mobilbilder.
- För att utföra 2PEF-avbildning, använd samma avstämbara pikosekundlaser och ställ in den etikettfria autofluorescensen för Flavin och NADH till 800 nm respektive 780 nm.
- Använd en 460 nm/515 nm filterkub för att samla upp Flavin och NADH autofluorescens bakåtspridd emission.
- Justera uppehållstiden till 8 μs/pixel och pixelstorleken till 512 pixlar x 512 pixlar. Ställ in laserslutareffektparametern på 150 mW.
- För 3D-bildrekonstruktion, ställ in den stimulerade Raman-förlusten till 2 850 cm-1 (797 nm).
- När de önskade enskilda cellerna har identifierats, registrera lasern för att skanna från det övre fokusplanet för att detektera de övre och nedre lagren av dessa celler.
3D-modeller genereras och sparas som .oir-filer.
5. Spektra och bildanalys
- Spektra analys
- Använd Origin-programvaran eller andra relevanta applikationer för att subtrahera bakgrundsspektrumet från alla subcellulära målspektra.
- Använd MATLABs matematiska modelleringsoperationer för att bearbeta Raman-spektra med programvarans inbyggda funktioner. Python kan också användas för spektrabearbetning.
- Spektral förbehandling börjar med att konvertera filerna till en matris. Spektra interpoleras vid varje ömsesidig centimeter.
- För validering visar du rådata. Utför baslinjekorrigeringen på råspektra med hjälp av den inbyggda funktionen msbackadj i MATLAB. I korthet uppskattar den inbyggda funktionen baslinjepunkter vid separationsenhetsvärden som identifieras av användare och returnerar avståndet mellan intilliggande fönster. Från baslinjepunkterna uppskattar och ritar du en regressionslinje. Använd utjämning för att jämna ut regressionslinjen för att subtrahera baslinjen från varje enskilt råspektrum.
- Utför min-max normalisering genom att dividera proteinets Raman-intensitet vid 2,930 cm-1 med intensiteten för varje Raman-skift. 2,930 cm-1-signalen är vanligtvis den högsta intensiteten på Raman-spektrumet. Med den här normaliseringen omvandlas det maximala värdet till en 1 medan minimivärdet omvandlas till en 0. Vartannat värde omvandlas till ett decimaltal mellan 0 och 1.
- Medelvärde de enskilda spektra av samma tillstånd i ett enda spektrum för att minska brus.
- När du har bearbetat, använd applikationer, till exempel Origin, för att visa alla spektra samtidigt. Topparna som visas i spektra representerar en specifik kemisk bindning eller funktionell grupp.
- 3D-bildanalys av lipiddroppar
- Använd FIJI-ImageJ-programvara för att bearbeta alla 3D-bilder
- Utför funktionerna Bandpassfilter och Utjämning för 3D-bildstaplarna.
- För 3D-bildanalys, tilldela varje lipiddroppe till en sfärisk poäng beräknad genom att mäta avståndet mellan dess masscentrum till ytan. Jämför varje sfärisk poäng med en sfärisk poäng av en perfekt sfär på samma euklidiska plan. Kassera lipiddroppar med låga sfäriska poäng och utvärdera de återstående lipiddropparna för deras volym och räkningar.
- Analysera volymen och antalet lipiddroppar mellan olika behandlingar för statistisk signifikans på en lämplig statistisk programvara. Här användes GraphPad Prism.
- 2D hyperspektral bildanalys
- Använd FIJI-ImageJ-programvara för att bearbeta alla 2D-hyperspektrala bilder.
- Markera kanalen 2 930 cm-1 om du vill skapa en maskbild som innehåller värdena 0 och 1. Tilldela bakgrunden till 0 och mobilområdet till 1.
- Subtrahera den deuteriummärkta proteinkanalen (2,175 cm-1) till bakgrundskanalen (1,900 cm-1) för att ta bort de fluorescerande effekterna.
- Dela den resulterande deuteriummärkta proteinkanalen med proteinkanalen (2,930 cm-1) för att erhålla proteinomsättningshastighetmetriska bilder.
- Multiplicera sedan maskbilden som gjordes i steg 5.3.2 med de ratiometriska bilderna för att ta bort eventuella återstående bakgrundsljud. Som ett resultat genereras en mörk bakgrund i varje ratiometrisk bild.
- Använd markeringsverktyget på frihand i FIJI-ImageJ för att manuellt segmentera och beräkna pixelintensiteter som visas på enskilda celler. Pixelintensiteterna motsvarar koncentrationerna av den kemiska bindningen som visualiseras.
- Analysera pixelintensiteterna för statistisk signifikans på en lämplig statistisk programvara. Här användes GraphPad Prism. Upprepa denna analys med den återstående ratiometriska analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillsatsen av överskott av AAA vid 15x koncentrationer till 50% D2O-innehållande cellodlingsmedia producerade distinkta C-D Raman-band av nyligen syntetiserade lipider och proteiner i HeLa-celler (figur 2B). Tidigare experiment utfördes med olika koncentrationsnivåer, såsom 2x och 5x, och även om data inte presenteras, producerade 15x-koncentrationen de mest distinkta C-D Raman-banden av nyligen syntetiserade lipider och proteiner. Specifikt, genom att undersöka lipiddroppar (LD), märkte vi att både 15x Phe och 15x Tryp inducerade nysyntetiserade lipider och proteinsignaler vid 2,143 cm-1 respektive 2,172 cm-1. DO-SRS användes därefter för att visualisera den rumsliga fördelningen av C-D-signaler på enskilda celler (figur 3). Med hjälp av ImageJ segmenterades och beräknades pixelintensiteterna för enskilda celler manuellt, vilket indikeras av prickade vita kanter i figur 3A. Kontrollcellerna visar måttliga C-D-lipid- och proteinband; 15x Phe och 15x Tryp visar dock starkare C-D-lipid- och proteinband. Kvantitativ analys indikerar att överskott av AAA kan uppreglera lipidsyntesen med 10% -17% men nedreglera proteinsyntesen med 10% (figur 3C, D). Resultaten drar slutsatsen om möjligheten till brist på autofagi som ackumulerar nyligen syntetiserade lipider, främjar mitokondriell dysfunktion och inducerar oxidativ obalans under överskott av AAA-reglering7.
Etikettfri multimodal SRS och 2PEF-avbildning av omättad lipid (~ 3,011 cm-1), mättad lipid (~ 2,880 cm-1) och NADH, Flavin förvärvades för att förstå effekterna av AAA på cancermetabolism. På liknande sätt segmenterades och beräknades pixelintensiteter för enskilda celler manuellt med hjälp av ImageJ, vilket indikeras av prickade vita kanter i figur 3B. Ratiometrisk analys av AAA-behandlade celler visar en 10% ökning av omättad lipid / mättad lipid och en 50% ökning av Flavin / Flavin + NADH (Figur 3E, F). I mitokondriernas elektrontransportkedja kan ROS genereras genom överföring av elektroner från NADH och FADH2 till molekylära syrearter. Ansamlingen av ROS i många cancerceller resulterar i en oxidativ obalans som oxiderar omättade fettsyror, främjar mättad fettsyrasyntes och utarmar NADH-autofluorescenssignaler. Därför är den observerade ökningen av Flavin / Flavin + NADH en indikator på ackumulerad ROS som minskar NADH autofluorescenssignaler. Som svar på oxidativ obalans kan HeLa-celler uppreglera sin omättade lipidsyntes för att ersätta de oxiderade. Detta svar observeras inte i andra cancercellinjer29, vilket betyder den metaboliska heterogeniteten hos cancerceller under ett överskott av AAA-diet30.
Förutom multimodal avbildning kan SRS rekonstruera etikettfria 3D-bilder av LDs i kontroll och AAA-behandlade HeLa-celler. I korthet genererar mikroskopi en uppsättning tvärsnittsbilder i ett valt område av intresse. I denna studie justerades den stimulerade Raman-förlusten (SRL) till 2 845 cm-1 och skannades från det översta lagret till det undre lagret med en stegstorlek på 1 μm (figur 4A). Kvantitativa analyser av 3D-lipiddroppar visar att LDs minskade i storlek men ökade i antal i AAA-behandlade celler jämfört med kontrollen (Figur 4B, C). Den ökade närvaron av skrymmande hydrofoba aminosyror, såsom Tryp och Phe, kan försämra funktionen hos LD-beläggningsproteiner. Detta minskar slutligen lipolys, vilket ackumulerar många små LD. De etikettfria 3D SRS-volymetriska bildresultaten från denna studie bekräftar tidigare studier genom att visualisera att överskott av AAA-behandlade celler uppvisar många mindre LDs31,32.
Figur 1: En illustration av bildinsamling och analys med DO-SRS och 2PEF. (A) En 3D-bildrekonstruktion och analys för att erhålla lipiddroppantal, volym och sfärisk poäng. (B) Hyperspektral avbildning och analys av deuteriummärkt lipid (CDL; 2,145 cm-1), lipid (2,845 cm-1), deuteriummärkt protein (CDP; 2,175 cm-1), protein (2,940 cm-1), omättad lipid (3,011cm-1), mättad lipid (2,880 cm-1), NADH och Flavin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Fysisk uppsättning av spontan Ramanspektroskopi och stimulerad Ramanspridningsmikroskopi . (A) Spontan Raman-spektroskopi som används för denna studie. (B) Exempel spontana Raman-spektra för CD-etikett (röd), utan CD-etikett (svart), kontrollgrupp (blå, heldragen linje), 15x Phe-behandlad grupp (röd, prickad linje) och 15x Tryp-behandlad grupp (rosa, prickad linje). (C) Schematiskt diagram över den stimulerade Raman-spridningsmikroskopiuppsättningen som används för denna undersökning. (D) Stimulerad Raman-spridningsmikroskopiinställning som används som DO-SRS- och 2PEF-plattform. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Visualisering av metabolisk dynamik i HeLa-celler med DO-SRS och 2PEF-mikroskopi. (A) Deuteriummärkt lipid (2 145 cm-1), lipid (2 845 cm-1), deuteriummärkt protein (2 175 cm-1), protein (2 940 cm-1) visualiserat i HeLa-celler under kontroll (Ctrl), 15x fenylalanin (15x Phe) och 15x tryptofan (15x Tryp) med DO-SRS-plattformen. Lipidomsättningshastighet och proteinomsättningshastighet beräknades som 
och 
. Råbilder subtraherades först av PBS-signalen för att ta bort bakgrundsintensitet och maskerades för att ta bort intensiteten utanför cellerna med ImageJ. Pixelvis uppdelning utfördes för den ratiometriska analysen. (B) NADH- och Flavin-kanaler visualiserade med 2PEF-mikroskopi och omättad lipid (3 011 cm-1) och mättad lipid (2 880 cm-1) visualiserad med etikettfri SRS-mikroskopi. Optiskt redoxförhållande och mättnadsförhållande beräknades med 
och 
. (C-F) Kvantifiering av ratiometriska intensiteter för varje HeLa-cell under kontroll, 15x Phe och 15x Tryp-förhållanden. Den statistiska skillnaden användes för att jämföra överskott av AAA-förhållanden med kontrollförhållandena. p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05 beräknades från ett tvåvägs ANOVA-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Visualisering av 3D-lipiddroppfördelning av en enda HeLa-cell med hjälp av ett etikettfritt SRS-mikroskop. (A) SRS 3D-lipiddroppvolymprojektion i HeLa-celler under kontroll och överskott av AAA-förhållanden. Tröskelvärdet definierades före analysen och avslöjade lipiddroppsignalfördelning. (B,C) Kvantifiering av lipiddroppvolym och antal inom enskilda HeLa-celler under kontrollgrupp och överskott av AAA-förhållanden med användning av tvåvägs ANOVA-testet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DO-SRS och 2PEF-avbildning har tillämpats för att undersöka metabolisk dynamik i olika ex vivo-modeller, inklusive Drosophila och humana vävnader 21,22,23,24,26,27,33. Bildmodaliteten som används i denna studie integrerar DO-SRS- och 2PEF-mikroskopi, vilket kan överträffa andra molekylspecifika avbildningsmetoder genom att eliminera behovet av molekylextraktion eller märkning med cytotoxiska reagens och kräva minimal provberedning. Specifikt gör DO-SRS-mikroskopi det möjligt för oss att undersöka de novo lipogenes och proteinsyntes i djur och celler och visualisera deras metaboliska dynamik in situ23,27,34. 2PEF fångar autofluorescenssignalerna från naturligt förekommande biomolekyler, såsom Flavin och NADH, i biologiska prover35,36. Bildpenetrationsdjupet för SRS kan uppnå upp till 200-500 μm i mindre spridningsprover37. Med vävnadsrensningsmetoder som urea kan penetrationsdjupet öka mer än tiofaldigt37. Kopplingen av SRS med 2PEF gör det möjligt för oss att avbilda endogena fluoroforer som Flavin och NADH i biologiska prover, vilket ytterligare eliminerar behovet av exogena biomarkörer för detektion. 2PEF kan uppnå ett penetrationsdjup på 500 μm38. Jämfört med andra multiplexa avbildningsmetoder, såsom flerfärgad enfotonkonfokal fluorescensmikroskopi, kan både DO-SRS och 2PEF uppnå ett betydligt större penetrationsdjup utan cytotoxiska exogena biomarkörer.
För att öka den rumsliga upplösningen av DO-SRS och 2PEF utvecklade vi ett adaptivt momentuppskattningsverktyg (Adam)-baserat pointillism deconvolution (A-PoD) bildbehandlingsverktyg34. A-PoD kan konvertera diffraktionsbegränsade DO-SRS- och 2PEF-bilder till superupplösta utan behov av några hårdvaruförbättringar. Dessutom innehåller Raman-spektrumet många specifika kemiska vibrationslägen som kan utnyttjas för att öka antalet detekterbara molekyler. Med denna fördel har vårt laboratorium vidare genererat en straffad referensmatchningsmetod (PRF) för att skilja flera lipidarter i cell- och vävnadsmodeller36. Dessa två tekniska utvecklingar öppnar nya vägar för att studera biologiska processer mer detaljerat på cellulär och subcellulär nivå, som har använts för att karakterisera metaboliska förändringar i hjärna, cancer och åldringsprocesser26,27,35.
En huvudbegränsning av detta protokoll är koncentrationen och tidsinkubationen av cellulära prover medD2Oför att producera distinkta, kvantifierbara C-D Raman-band. Mer robusta, metaboliskt aktiva cellinjer, såsom HeLa-celler, kan införliva deuteriumatomer i nyligen syntetiserade makromolekyler i snabbare takt än icke-sjuka däggdjurscellinjer, såsom humana embryonala njurceller (HEK), vilket leder till olika C-D-intensiteter observerade för samma koncentration och tidsinkubation medD2Oi två olika cellinjer21. Vidare kan administrering av D2Oi en koncentration på 80% eller högre under 48 timmar medföra toxicitet för cellulära prover. Ett optimeringsexperiment för att identifiera den optimalaD2O-koncentrationenoch tidsinkubationen är nödvändig för att uppnå önskvärda resultat.
En kritisk aspekt av protokollet är integrationen av DO-SRS och 2PEF-avbildning. Vanligtvis delar DO-SRS- och 2PEF-modaliteter samma pikosekundexcitationslaser, eftersom dess smala bandbredd kan optimeras med SRS- och 2PEF-signaler. Även om vår teknik är hembyggd är denna plattform kommersiellt tillgänglig39. Ytterligare utrustning, såsom två synkroniserade laserpulser med en modulator, fotodioddetektor, en lock-in-förstärkare och ett skanningsmikroskops gemensamma ansträngningar krävs för att detektera Raman-signalen. D2O kan lätt köpas från bioteknikleverantörer. Därför kan forskare få tillgång till denna teknik mycket enkelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Yajuan Li och Anthony Fung för deras tekniska support och Fraley-labbet för cellinjen. Vi erkänner startfonderna från UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 och Hellman Fellow Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
References
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P.
- Parthasarathy, A., et al. A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29 (2018).
- Wang, H., et al. l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells. The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
- Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).
- Kimura, T., Watanabe, Y. Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction. Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).
- Ma, Q., et al. Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice. Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).
- Cheng, C., et al. Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).
- Lubes, G., Goodarzi, M. GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).
- Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R.
- Bowman, A. P., et al. Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).
- Pirman, D. A., et al. Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), e61379 (2013).
- Li, Z., et al. Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 2869 (2021).
- Miyagi, M., Kasumov, T. Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378 (2016).
- Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy. Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).
- Fung, A. A., Shi, L. Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501 (2020).
- Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).
- Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
- Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
- Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702 (2021).
- Li, Y., et al. Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy. Frontiers in Aging. 2, 819903 (2022).
- Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila. Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Fung, A. A., et al. Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism. Frontiers in Oncology. 12, 858017 (2022).
- Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes. Aging Cell. 21 (4), e13586 (2022).
- Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547 (2022).
- Rysman, E., et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).
- Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia. BMC Cancer. 19 (1), 501 (2019).
- Thiam, A. R., Dugail, I. Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function. Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).
- Schott, M. B., et al. Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes. The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).
- Hoang, K., et al. Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis. Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).
- Jang, H., et al. Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD. bioRxiv. , (2022).
- Li, Y., et al. Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, W., et al.
- Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
- Chang, T., et al. Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy. Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).
- Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/ (2023).
