Tumor primario y aislamiento de células MEF para el Estudio de pulmón metástasis

El objetivo de este protocolo es estudiar la tumorigénesis de mama. Con esta técnica, se extirpan los tumores mamarios de ratón y se preparan las células primarias a partir de los tumores. Se incluye un protocolo de extracción pulmonar para el estudio de las metástasis pulmonares. Además, se incluye otro protocolo para analizar fibroblastos embrionarios de ratón a partir del embrión de ratón.

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la agenesia tumoral del cáncer de mama en ratones. En primer lugar, se demuestra la preparación de células primarias a partir de tumores de mama de ratón. A continuación, se presenta cómo extraer el pulmón del ratón para visualizar la metástasis pulmonar.

Finalmente, se muestra la preparación de fibroblastos embrionarios de ratón a partir de embriones de ratón, ya que estos métodos demuestran que los ratones transgénicos para el antígeno T medio del polioma del virus del tumor mamario de ratón se pueden utilizar para investigar la agenesia tumoral del cáncer de mama. Aunque este método puede proporcionar información sobre el cáncer de mama, también se puede aplicar a la investigación de otros tumores sólidos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que es importante aislar solo los tumores y el resto del tejido durante los pasos de irritación del tumor. Comience usando tijeras para abrir la piel desde el orificio uretral hasta el cuello de un ratón.

A continuación, sujeta la piel con alfileres y aísla el tumor mamario de mama. Lave el tumor in situ con PBS frío y coloque el tumor en una placa estéril de cultivo de tejido de 10 centímetros. A continuación, transfiera la placa a una campana de flujo laminar estéril y use una hoja de afeitar estéril y unas tijeras para cortar el tumor en pedazos de un milímetro cúbico.

Incubar las piezas con colagenasa en una mecedora a 37 grados centígrados. Después de dos horas, centrifuga la suspensión de tejido tumoral resultante. Lavar el pellet tres veces más en PBS Resus, suspendiendo el pellet en dos mililitros de tripsin EDTA después del último lavado durante cinco minutos a 37 grados centígrados con mutación.

A continuación, lave las células tres veces más y vuelva a suspenderlas en un medio de crecimiento normal. Finalmente, incubar las células en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros, cambiando el medio todos los días durante los próximos tres días hasta obtener el número de células deseado. Antes de extraer el pulmón, retire el hígado y el diafragma y desaloje las costillas.

Luego abra la parte superior de la tráquea, cerca de la vena yugular y use un catéter para inyectar el agente apropiado a través de la tráquea para llenar los pulmones, extraer los pulmones y luego, si usa Z fix, incrustar el tejido en parafina. Si el uso de tinta china retiene la solución de tejido inec durante cinco minutos, el tejido pulmonar normal aparecerá de color negro mientras que los nódulos tumorales aparecerán. El blanco clasifica los nódulos tumorales visualizados en sitios secundarios con un diámetro mayor o igual a 0,5 milímetros como metástasis para generar fibroblastos embrionarios de ratón.

En primer lugar, se abre la piel de una rata preñada desde el orificio uretral hasta el cuello, como se acaba de demostrar, teniendo cuidado de no alterar los embriones. A continuación, retire los cuernos uterinos y enjuáguelos con PBS estéril. A continuación, separe cuidadosamente los embriones de la placenta y de uno en uno.

Coloque cada embrión en una placa de cultivo de 10 centímetros que contenga PBS helado. Después de extraer la cabeza, el hígado y el intestino, enjuague la porción restante del embrión en un pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos que contiene PBS, corte el cuerpo en trozos de un milímetro cúbico. Transferir a otro pocillo que contenga cinco mililitros de tripina EDTA e incubar el tejido a 37 grados centígrados.

Pasados los cinco minutos, añade un mililitro de FBS para inactivar la digestión. A continuación, gire la suspensión celular resultante y vuelva a suspender el pellet. En un mililitro de DMEM tibio, finalmente transfiera las células a una placa de cultivo de 10 centímetros que contenga 10 mililitros de DMEM suplementado con antibióticos y cultive las células hasta obtener el número de células deseado.

La etapa de progresión tumoral en la que se sacrifica al animal depende del estudio en particular y de las pautas I-A-C-U-C. Por ejemplo, este ratón FVB de 100 días de edad con el virus del tumor mamario de ratón polioma antígeno T medio fue sacrificado a los tres meses después de aislar un tumor, como se acaba de demostrar en la mama de ratón. Se obtuvieron células tumorales primarias.

Dado que muchos genes median la metástasis del cáncer de mama en el pulmón, también se extrajeron los pulmones, como se acaba de demostrar para estudiar el proceso metastásico. A continuación, se inflaron los pulmones con Z fix y se tiñeron con tinta china para visualizar los nódulos tumorales. Aquí, se muestran fibroblastos embrionarios de ratón, aislados de embriones de ratón de la cepa FVB.

Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo aislar células tumorales primarias de ratón y fibroblastos embrionarios de ratón, y extraer el pulmón del ratón. No olvide que trabajar con flúor ISO puede ser extremadamente peligroso bajo las precauciones, como trabajar con un producto químico F Hood siempre debe ser agresivo mientras realiza este procedimiento.