Tumor primario y aislamiento de células MEF para el Estudio de pulmón metástasis
20 de mayo de 2015
El objetivo de este protocolo es estudiar la tumorigénesis de mama. Con esta técnica, se extirpan los tumores mamarios de ratón y se preparan las células primarias a partir de los tumores. Se incluye un protocolo de extracción pulmonar para el estudio de las metástasis pulmonares. Además, se incluye otro protocolo para analizar fibroblastos embrionarios de ratón a partir del embrión de ratón.
El objetivo general de este procedimiento es estudiar la tumorigénesis del cáncer de mama en ratones. Primero, se demuestra la preparación de células primarias a partir de tumores mamarios de ratón. A continuación, se presenta cómo extraer el pulmón del ratón para visualizar metástasis pulmonares.
Finalmente, se muestra la preparación de fibroblastos embrionarios de ratón a partir de embriones de ratón, ya que estos métodos demuestran que los ratones transgénicos para el antígeno T medio del polioma del virus del tumor mamario del ratón pueden utilizarse para investigar la génesis tumoral del cáncer de mama. Aunque este método puede proporcionar información sobre el cáncer de mama, también puede aplicarse al estudio de otros tumores sólidos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que es importante aislar únicamente el tumor y no otro tejido durante los pasos de aislamiento tumoral. Comience utilizando tijeras para abrir la piel desde el orificio uretral hasta el cuello de un ratón transgénico para el antígeno T medio del polioma del virus del tumor mamario del ratón.
Luego fije la piel y aísle el tumor mamario. Lave el tumor in situ con PBS frío y coloque el tumor en una placa estéril de cultivo de tejidos de 10 centímetros. A continuación, transfiera la placa a una cabina de flujo laminar estéril y utilice una cuchilla de afeitar estéril y tijeras para cortar el tumor en trozos de un milímetro cúbico.
Incube los fragmentos con colagenasa en un agitador rotatorio a 37 grados Celsius. Después de dos horas, centrifugue la suspensión resultante de tejido tumoral. Lave el sedimento otras tres veces en PBS Resus, suspendiendo el sedimento en dos mililitros de tripsina-EDTA tras el último lavado durante cinco minutos a 37 grados Celsius con agitación.
Luego lave las células tres veces más y resuspenda en medio de crecimiento normal. Finalmente, incube las células en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros, cambiando el medio cada día durante los próximos tres días hasta obtener el número deseado de células. Antes de extraer el pulmón, retire el hígado y el diafragma y separe las costillas.
Luego, abra la parte superior de la tráquea, cerca de la vena yugular, y use un catéter para inyectar el agente adecuado a través de la tráquea para llenar los pulmones, retire los pulmones y, si utiliza Z fix, incluya el tejido en parafina. Si utiliza tinta de la India, retenga el tejido en la solución inec durante cinco minutos; el tejido pulmonar normal aparecerá de color negro, mientras que los nódulos tumorales aparecerán blancos. Clasifique cualquier nódulo tumoral visualizado en sitios secundarios con un diámetro mayor o igual a 0,5 milímetros como metástasis para generar fibroblastos embrionarios de ratón.
Primero, abra la piel de un ratón preñado desde la abertura uretral hasta el cuello, tal como se acaba de demostrar, teniendo cuidado de no perturbar los embriones. A continuación, retire los cuernos uterinos y enjuáguelos en PBS estéril. Luego, separe cuidadosamente los embriones de la placenta, uno por uno.
Coloque cada embrión en una placa de cultivo de 10 centímetros que contenga PBS frío con hielo. Después de retirar la cabeza, el hígado y el intestino, lave la porción restante del embrión en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos que contenga PBS, y corte el cuerpo en trozos de un milímetro cúbico. Transfiera a otro pocillo que contenga cinco mililitros de tripsina-EDTA e incube el tejido a 37 grados Celsius.
Después de cinco minutos, agregue un mililitro de suero bovino fetal para inactivar la digestión. Luego, centrifugue la suspensión celular resultante y resuspenda el precipitado. En un mililitro de DMEM tibio, finalmente transfiera las células a una placa de cultivo de 10 centímetros que contenga 10 mililitros de DMEM suplementado con antibióticos y cultive las células hasta obtener el número celular deseado.
La etapa de progresión tumoral en la que se sacrifica al animal depende del estudio específico y de las directrices del I-A-C-U-C. Por ejemplo, este ratón FVB de 100 días de edad con el antígeno T medio del virus del tumor mamario murino de poliomavirus fue sacrificado a los tres meses de haber aislado un tumor, tal como se acaba de demostrar en el tejido mamario murino. Se obtuvieron células tumorales primarias.
Dado que muchos genes median la metástasis del cáncer de mama hacia el pulmón, los pulmones también se extrajeron como se acaba de demostrar para estudiar el proceso metastásico. Luego, los pulmones se inflaron con Z fix y se tiñeron con tinta china para visualizar los nódulos tumorales. Aquí se muestran fibroblastos embrionarios de ratón, aislados de embriones de ratón de la cepa FVB.
Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo aislar células tumorales primarias de ratón y fibroblastos embrionarios de ratón, y extraer el pulmón de ratón. No olvide que trabajar con flúor ISO puede ser extremadamente peligroso, por lo que deben tomarse precauciones, como trabajar siempre dentro de una campana química F, durante la realización de este procedimiento.
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Descripción general
Este protocolo describe métodos para estudiar la tumorigénesis mamaria en ratones. Incluye técnicas para preparar células primarias a partir de tumores mamarios de ratón y extraer tejido pulmonar para investigar la metástasis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación sobre el cáncer de mama
- Oncología
- Modelos de ratones transgénicos
Antecedentes
- El cáncer de mama es una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer.
- Comprender la tumorigénesis es fundamental para desarrollar tratamientos eficaces.
- Los modelos de ratón son esenciales para estudiar la biología del cáncer.
- Los ratones transgénicos pueden proporcionar información sobre mecanismos específicos del cáncer.
Objetivo del estudio
- Investigar la tumorigénesis del cáncer de mama utilizando modelos murinos.
- Analizar la metástasis pulmonar asociada con tumores de mama.
- Preparar fibroblastos embrionarios de ratón para investigaciones posteriores.
Métodos Utilizados
- Preparación de células primarias a partir de tumores mamarios de ratón.
- Protocolo de extracción de pulmón para la visualización de metástasis.
- Aislamiento de fibroblastos embrionarios de ratón a partir de embriones.
- Uso de ratones transgénicos que expresan el antígeno T medio del poliomavirus.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de células primarias a partir de tumores mamarios.
- Se demostró una técnica efectiva de extracción pulmonar.
- Se logró la preparación de fibroblastos embrionarios.
- Los métodos pueden aplicarse para estudiar otros tumores sólidos.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona información valiosa sobre la biología del cáncer de mama.
- Los métodos pueden adaptarse para diversas aplicaciones en la investigación del cáncer.
- La demostración visual mejora la comprensión de las técnicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de células tumorales primarias y fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) a partir de modelos de ratón genéticamente modificados permite la interrogación mecanicista de la progresión metastásica, particularmente la colonización pulmonar en el cáncer de mama. Este flujo de trabajo respalda la confianza predictiva en la validación de dianas y el análisis de vías para la metástasis, informando directamente los puntos críticos en la investigación exploratoria y traslacional. El enfoque proporciona una plataforma reutilizable para el perfilado genético y estudios comparativos entre poblaciones celulares tumorales y no tumorales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el análisis funcional de genes que median la metástasis específica de órganos, apoyando la validación de dianas.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos mediante la comparación de perfiles de expresión génica en tumores y tejidos no tumorales.
- Apoya estudios basados en hipótesis sobre la selectividad metastásica y las vías de progresión tumoral.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona poblaciones validadas de células de tumor primario y de MEF para ensayos de perfilado génico posteriores.
- Permite la preparación reproducible de material biológico para análisis cuantitativos y comparativos.
- Facilita la estandarización de ensayos mediante el aislamiento de tipos celulares definidos a partir de modelos genéticamente consistentes.
Investigación Translacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad al estudiar la diseminación metastásica al pulmón.
- Permite la continuidad desde el perfilado génico en fase de descubrimiento hasta la validación preclínica de factores impulsores de metástasis.
- Apoya el avance ajustado al riesgo al aclarar las vías implicadas en la metástasis órgano-específica.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir el aislamiento de células tumorales primarias y células de control para estudios de expresión génica y metástasis.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre mecanismos metastásicos y la función génica in vivo.
- Tamizaje: Proporciona fuentes reproducibles de células para perfiles cuantitativos de genes y ensayos comparativos.
- Análisis: Permite medir las diferencias en la expresión génica entre células tumorales y células MEF, aportando información para el análisis de vías.
- Investigación Traducional: Conecta los resultados del perfilado génico con modelos preclínicos de metástasis pulmonar.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado para el aislamiento de células primarias a partir de modelos de ratón genéticamente modificados.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas metastásicas y en la elucidación de vías.
- Valor operativo: Proporciona protocolos estandarizados y reproducibles de aislamiento celular para permitir la comparabilidad entre estudios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar o descartar al aclarar los mecanismos metastásicos y la función génica.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas y vías metastásicas para su posterior desarrollo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ratones, disección de tejidos y técnicas estériles de cultivo celular.
- Necesita acceso a colonias de ratones transgénicos y a la infraestructura adecuada para cultivo de tejidos y análisis.
- Exige estandarización entre equipos para garantizar la reproducibilidad en el aislamiento celular y los ensayos posteriores.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes modelos de tumores o estudios de metástasis específicos de órganos.
- Las limitaciones prácticas incluyen consideraciones sobre el bienestar animal y la optimización del protocolo para preguntas de investigación específicas.
