Name: Un système de détection de tumeur modèle et tumeur murine Orthotopique vessie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Découvrez une méthode non chirurgicale pour générer des tumeurs vésicales orthotopiques non invasives chez la souris C57BL/6J. Cette technique permet un suivi facile pour évaluer les thérapies intravésicales.

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Ce travail a été financé par une subvention du Conseil national de la recherche médicale de Singapour (NMRC/CIRG/1335/2012) accordée au professeur Kesavan Esuvaranathan.

<ol><li>Gunther, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+%28MB49%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+murine+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of murine bladder cancer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Chade, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+characterization+of+a+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Braz+J+Urol%22%5BJournal%5D)">Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model.</a> Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).</li>
<li>Chan, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+orthotopic+bladder+tumor+implantation+in+a+syngeneic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model.</a> J Urol. 182, 2926-2931 (2009).</li>
<li>Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+bladder+cancer+model+for+gene+delivery+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181(2013).</li>
<li>Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+oligonucleotide+therapy+cures+subcutaneous+and+orthotopic+tumors+and+evokes+protective+immunity+in+murine+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer.</a> J Immunother. 28, 20-27 (2005).</li>
<li>Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+and+Microenvironment+Modification+during+Progression+of+Murine+Orthotopic+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer.</a> Clin Dev Immunol. , 865684(2011).</li>
<li>Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+for+detecting+and+treatment+monitoring+of+orthotopic+murine+bladder+tumor+implants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants.</a> J Urol. 145, 1297-1301 (1991).</li>
<li>Kikuchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitative+analysis+of+early+stage+orthotopic+murine+bladder+tumor+using+in+vivo+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging.</a> J Urol. 170, 1375-1378 (2003).</li>
<li>Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+and+cancer%3A+improving+real-time+monitoring+and+staging+of+bladder+cancer+with+multimodal+mesoporous+silica+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles.</a> Cancer nanotechnology. 7, 3(2016).</li>
<li>Tanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+detection+of+bladder+cancer+in+an+orthotopic+murine+model+with+green+fluorescence+protein+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology.</a> J Urol. 170, 975-978 (2003).</li>
<li>Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+to+monitor+bladder+cancer+cell+adhesion+in+vivo%3A+a+new+approach+to+optimize+a+syngeneic%2C+orthotopic%2C+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model.</a> BJU Int. 101, 120-124 (2008).</li>
<li>Newton, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-interleukin-10R1+monoclonal+antibody+in+combination+with+bacillus+Calmette--Guerin+is+protective+against+bladder+cancer+metastasis+in+a+murine+orthotopic+tumour+model+and+demonstrates+systemic+specific+anti-tumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity.</a> Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).</li>
<li>Patel, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transabdominal+micro-ultrasound+imaging+of+bladder+cancer+in+a+mouse+model%3A+a+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study.</a> Urology. 75, 799-804 (2010).</li>
<li>Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+response+of+orthotopic+bladder+tumors+to+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+therapy+using+the+prostate-specific+antigen+gene+as+a+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter.</a> Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).</li>
<li>Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+prostate+specific+antigen+to+measure+bladder+tumor+growth+in+a+mouse+orthotopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model.</a> J Urol. 172, 2414-2420 (2004).</li>
<li>Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+reporter+green+fluorescent+protein+under+simulated+tumor+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions.</a> Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).</li>
<li>Biot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preexisting+BCG-specific+T+cells+improve+intravesical+immunotherapy+for+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer.</a> Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172(2012).</li>
<li>Swirski, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+near-infrared+cell+tracker+reagent+for+multiscopic+in+vivo+imaging+and+quantification+of+leukocyte+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses.</a> PLoS One. 2, 1075(2007).</li>
<li>Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+cells+in+peripheral+blood+in+relation+to+urinary+bladder+cancer+malignancy+indicators+before+and+after+surgical+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+Ultrasound+Imaging+of+Mouse+Cervical+Lymph+Nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes.</a> J Vis Exp. , e52718(2015).</li>
<li>Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonographic+evaluation+of+orthotopic+bladder+tumors+in+mice+treated+with+TNP-470%2C+an+angiogenic+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+radiology%22%5BJournal%5D)">Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor.</a> Academic radiology. 8, 121-127 (2001).</li>
<li>Folin, O., Morris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+determination+of+creatinine+and+creatine+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22JBC%22%5BJournal%5D)">On the determination of creatinine and creatine in urine.</a> JBC. 17, 469-473 (1914).</li>
<li>Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+assay+based+on+colloidal+gold+conjugates+with+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin.</a> Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).</li>
<li>Shi, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+enhancement+strategy+applied+in+ECL+biosensor+based+on+closed+bipolar+electrodes+for+the+detection+of+PSA%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA.</a> Talanta. 154, 169-174 (2016).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemiluminescent+immunosensing+of+prostate-specific+antigen+based+on+silver+nanoparticles-doped+Pb+%28II%29+metal-organic+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework.</a> Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).</li>
<li>Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+electrochemical+immunosensor+for+PSA+biomarker+detection+in+prostate+cancer+cells+using+gold+nanoparticles%2FPAMAM+dendrimer+loaded+with+enzyme+linked+aptamer+as+integrated+triple+signal+amplification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy.</a> Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+comparison+of+orthologous+gene+expression+in+human+bladder+cancer+and+carcinogen-induced+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models.</a> Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).</li>
<li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+Novel+Bladder+Cancer+Xenograft+Model+in+Humanized+Immunodeficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+physiology+and+biochemistry+%3A+international+journal+of+experimental+cellular+physiology%2C+biochemistry%2C+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice.</a> Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les étapes les plus critiques dans le protocole sont: 1) maintenir avec succès la tumorigénicité de la lignée cellulaire; 2) assurant mesurable PSA sécrétion avant l&#39;implantation des cellules tumorales chez la souris; 3) la génération d&#39;une suspension à cellule unique pour l&#39;implantation de manière à réduire la variation de la taille de la tumeur; et 4) instiller des cellules à une vitesse lente pour éviter reflux vésico-urétéral, ce qui entraîne une tumeur implantation de cellules dans le rein. <p class...

Le but de cette méthode est de générer des tumeurs de la vessie murin orthotopique et de suivre les tumeurs implantées aussi précisément que possible, de sorte que les souris sans implantation de la tumeur ne sont pas pensé pour avoir été durcie à l&#39;analyse du point final. Dans l&#39;ensemble, la méthode indiquée réduira la nécessité d&#39;un grand nombre de souris pour l&#39;analyse expérimentale et assurer une plus grande précision dans la détermination des résultats thérapeutiques. Le développement d&#39;un modèle orthotopique de cancer est important, car les cellules tumorales implantation sous-cutanée ne récapitulent pas l&#39;environnement de la maladie clinique ou permettent le développement de stratégies thérapeutiques. L&#39;architecture de la vessie permet à l&#39;instillation de thérapies contre le cancer de la vessie directement dans la vessie avec des effets systémiques minimales. Ainsi, les modèles animaux qui récapitulent cet environnement, comme un modèle orthotopique, sont importantes pour évaluer de nouvelles thérapies. Les conclusions tirées de tout dispositif expérimental sont dependent sur les limites du modèle. Plusieurs techniques ont été mises au point pour la production de tumeurs de la vessie orthotopique chez la souris. Ceux-ci se fondent sur d&#39;endommager la couche de glycosaminoglycanes de la vessie, permettant aux cellules tumorales à implanter. Les techniques utilisées comprennent électrocoagulation, qui se traduit par un point de dégâts dans la paroi de la vessie unique, conduisant au développement de la tumeur sur un site dans la vessie 1,2. Cependant, le taux d&#39;implantation de la tumeur à l&#39;aide électrocoagulation de réussite est dépendante de l&#39;opérateur variant de 10 - 90% et comprend le danger que la paroi de la vessie est percé, ce qui conduit à développer des tumeurs dans la cavité péritonéale. Cautérisation chimique est effectuée en utilisant du nitrate d&#39; argent, ce qui endommage la paroi de la vessie 3. De même, l&#39; acide a été utilisé pour endommager la paroi de la vessie 4. Trypsine a également été utilisé pour endommager la vessie et 5. Ces procédés peuvent entraîner l&#39;apparition de plus d&#39;une tumeur de la vessie.En outre, il existe un risque de dommages importants à la vessie si les produits chimiques sont laissés en contact avec la paroi de la vessie pendant trop longtemps. La méthode développée par Ninalga et al. utilise la poly-L-lysine chargée positivement (PLL) 6 molécules à recouvrir la paroi de la vessie; ce qui permet les cellules tumorales chargées négativement à coller à la couche de glycosaminoglycanes de la vessie. Ce procédé conduit généralement à plus d&#39;une tumeur en développement dans la vessie, mais l&#39; implantation des tumeurs est à 80 - 100% 4,7. Techniquement, il est aussi la procédure la plus simple à réaliser. Pour garantir que les tumeurs qui se développent sont assez même taille, il est important que les cellules tumorales ne sont pas regroupés dans les grandes touffes avant l&#39;implantation. Afin d&#39;évaluer l&#39;efficacité thérapeutique, il est préférable d&#39;effectuer cette étude sur des souris avec des tumeurs assez de taille similaire. Ainsi, un système de détection qui permet de quantifier la bonne taille de la tumeur rapidement après l&#39;implantation est importante. Plusieurs stratégies ont abeillen utilisé pour évaluer les tumeurs. Ceux - ci comprennent l&#39; imagerie par résonance magnétique (IRM) 8-10, la fluorescence 11, bioluminescence 12,13, ultrasons 14, et le dosage immuno-enzymatique (ELISA) 15,16. Tandis que l&#39;IRM et les ultrasons ne nécessitent pas de modifications des cellules tumorales, il existe un besoin d&#39;un équipement et d&#39;agents de contraste pour l&#39;IRM sensibles. Les dosages par fluorescence, luminescence- et à base d&#39;ELISA nécessitent une modification des cellules tumorales pour exprimer des protéines marqueurs qui peuvent être détectés par ces méthodes. Pour la fluorescence, un substrat est nécessaire pour la détection de l&#39;activité de la luciférase; ainsi, il y a une étape supplémentaire et une augmentation des coûts. Les deux luminescence et fluorescence nécessitent un équipement spécialisé. Pour produire la fluorescence, la protéine fluorescente verte (GFP) de cyclisation qui est catalysée par l&#39;oxygène moléculaire, est nécessaire. Ainsi, l&#39;expression de la GFP peut être variable au sein d&#39;une masse tumorale en fonction de l&#39;accès à l&#39;oxygène, ce qui en fait un marqueur peu fiable <sup&gt; 17. Modification de la lignée de cellules de cancer de la vessie murin MB49 à sécréter de la prostate humaine Specific Antigen (PSA) 15,16 comme un marqueur de substitution est une autre stratégie. Ces marqueurs fournissent également un autre moyen de confirmer la présence d&#39;une tumeur à la fin de l&#39;expérience, ce qui les rend une alternative à immunohistochimie. Cette étude rapporte le procédé PLL implantation de la tumeur orthotopique et présente une comparaison des systèmes de détection d&#39;une tumeur, à savoir la méthode ELISA, la fluorescence, l&#39;imagerie par ultrasons.

<table><tbody><tr><td>Cellules MB49-PSA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>réf (Wu QH, 2004)</td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco</td><td>Biowest</td><td>L0102</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS) Sérum de bovin fœtal d’Amérique du Sud</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr> (<tr><td>FBS) Amérique du Sud, Sérum</td> de veau fœtal Premium <td>Biowest</td><td>S181B</td><td></td></tr><tr><td>(FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30088.03&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Biowest</td><td>X0550</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Free PSA (Human) ELISA</td><td>kit Abnova</td><td>KA0209</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Réactif pour l’extraction de l’ARN&nbsp ;</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse de l’ADNc haute capacité avec inhibiteur de la RNase</td><td>Applied Biosystems</td><td>4374967</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay &ndash ; Mouse Actb</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>Mm00607939_s1</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay &ndash ; Humain KLK3</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182</td><td>souris femelles Hs00426859_g1</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>In Vivos</td><td></td><td>4 - 6 semaines</td></tr><tr><td>Anesthésie (75 mg/kg de kétamine et 1 mg/kg de médétomidine)</td><td>Pharmacie</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>Médicament d’inversion (1 mg/kg Atipamezole)</td><td>Pharmacie</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>Poinçon d’oreille</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72893-01</td><td></td></tr><tr><td>Solution de Hartmann ou Composé lactate de sodium</td><td>B Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique - Duratears Pommade lubrifiante oculaire stérile</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat pack - HotHands chauffe-mains</td><td>Heatmax Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan Certo IV cathéter</td><td>B Braun</td><td>4251300</td><td>24 G x 3/4&Prime ;</td></tr><tr><td>Aquagel Gelée lubrifiante</td><td>Pharmacie locale Solution</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de poly-L-lysine, 0,01 %,</td> <td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, sans EDTA Inhibiteur de protéase Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Quantichrom Kit de dosage de créatinine</td><td>BioAssay Systems</td><td>DICT-50&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Colorant fluorescent - VivoTrack 680</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEV12000&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Solution de transition de tissus congelés RNAlater-ICE</td><td>Ambion</td><td>4427575</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment and Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7500 Système de PCR en temps réel</td><td>appliqué Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7500 Software v2.3</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metabolic Cage</td><td>Tecniplast&nbsp ;</td><td>Rack de type vertical pour système</td> BD FACSCanto I de 12 cages<td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software v7</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS SpectrumCT in vivo système d’imagerie&nbsp ;</td><td>Caliper Life Sciences&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’image vivante v3.1</td><td>Caliper Life Sciences&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie Vevo 2100</td><td>VisualSonics&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un système de détection de tumeur modèle et tumeur murine orthotopique vessie

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Ce protocole décrit la génération de tumeurs de la vessie chez des souris C57BL / 6J femelles en utilisant la lignée cellulaire de cancer de la vessie murin MB49, qui a été modifiée pour secréter de la prostate humain de l&#39;antigène spécifique (PSA) et la procédure pour la confirmation d&#39;implantation de la tumeur. En bref, les souris sont anesthésiés à l&#39;aide de drogues injectables et sont faits pour mettre en position dorsale. L&#39;urine est libérée de la vessie et de 50 pi de poly-L-lysine (PLL) est lentement instillée à un débit de 10 pl / 20 s en utilisant un cathéter 24 G IV. Il est laissé dans la vessie pendant 20 minutes en bouchant le cathéter. Le cathéter est retiré et PLL est libéré par une légère pression sur la vessie. Ceci est suivi par l&#39; instillation de la lignée cellulaire de cancer de la vessie de souris (1 x 10 5 cellules / 50 ul) à un débit de 10 pl / 20 s. Le cathéter est bouché pour empêcher l&#39;évacuation prématurée. Après 1 h, les souris sont ravivées avec un médicament d&#39;inversion, et la vessie est annulée. Le taux d&#39;instillation lente est important,car il réduit reflux vésico-urétéral, ce qui peut provoquer des tumeurs de se produire dans les voies urinaires supérieures et dans les reins. La lignée cellulaire doit être bien remis en suspension pour réduire l&#39;agglutination des cellules, car cela peut conduire à des tailles de tumeur inégale après l&#39;implantation. Cette technique induit des tumeurs avec une grande efficacité. La croissance des tumeurs est contrôlée par la sécrétion urinaire de PSA. la surveillance du marqueur PSA est plus fiable que les ultrasons ou l&#39;imagerie par fluorescence pour la détection de la présence de tumeurs de la vessie. Tumeurs chez les souris atteignent généralement une taille maximale ayant un impact négatif sur la santé d&#39;environ 3 - 4 semaines, si non traitée. En surveillant l&#39;évolution de la tumeur, il est possible de différencier les souris qui ont été guéris de ceux qui ne sont pas implantés avec succès des tumeurs. Avec seulement une analyse du point final, ce dernier peut être à tort, supposé avoir été guéri par thérapie.

PSA sécrétion à partir de cellules MB49 a varié avec le milieu de croissance. MB49-PSA est cultivé dans DMEM médias parce que cela se traduit par une sécrétion accrue de PSA (figure 1A). Afin de déterminer la sensibilité du PSA ELISA et PCR en temps réel, un nombre différent de MB49-PSA sécrétant les cellules ont été mélangées avec des cellules parentales MB49. PSA ELISA détecte un minimum de 1 x 10 5 cellules PSA sécrétant / 1 x 10 6 cellules <stro...

Ce protocole décrit la génération de tumeurs de la vessie orthotopique de souris femelles de souris C57BL / 6J et le contrôle de la croissance tumorale.

Un système de détection de tumeur modèle et tumeur murine Orthotopique vessie

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

L'objectif général de cette méthode non chirurgicale est de produire de manière reproductible des tumeurs vésicales orthotopiques non invasives du muscle chez la souris, pouvant être facilement surveillées pour l'évaluation de thérapies intravésicales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer de la vessie, telles que l'évaluation de nouvelles thérapies intravésicales.Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'implanter facilement des tumeurs chez la souris et de suivre leur croissance, ce qui aide à déterminer précisément les réponses aux traitements. Un jour avant l'implantation, lorsque les cellules atteignent une confluence d'environ 80 %, réalisez un passage des cellules tumorales MB49 PSA dans un milieu DMEM complet avec un fractionnement un pour deux. Le jour de l'intervention, récupérez et comptez les cellules en vous assurant qu'elles sont suffisamment viables.Mélanger un volume égal de suspension cellulaire et de bleu de trypan à 4 %, puis compter les cellules vivantes colorées en bleu à l’aide d’un hémocytomètre. La viabilité cellulaire doit être d’au moins 80 %. Ensuite, resuspendre les cellules à une concentration de deux millions par millilitre dans un tube à centrifuger de 15 millilitres, et les laver trois fois dans du DMEM.Ensuite, les maintenir au frais jusqu’au moment de l’injection. Une fois qu’une souris femelle a été anesthésiée, assurer son hydratation par une injection intrapéritonéale de solution de Hartmann à raison de 1 millilitre par 10 grammes de poids corporel. Répéter cette injection toutes les une ou deux heures pendant l’anesthésie.Ensuite, appliquer une pommade ophtalmique stérile sur les deux yeux et renouveler l'application au besoin. Puis, placer la souris en position dorsale sur des essuie-tout au-dessus d'un tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle. Ensuite, fixer les pattes arrière à l'aide de ruban adhésif.Appliquez maintenant une pression douce sur la région abdominale inférieure et recueillez l'urine dans un tube de 1,5 millilitre afin de mesurer le niveau basal de PSA urinaire. Ensuite, chargez une seringue d'un millilitre avec du PLL stérile et fixez-y un cathéter intraveineux de calibre 24 dont le stylet aiguille a été retiré. Appliquez un lubrifiant sur l'extrémité du cathéter.Ensuite, insérez le cathéter dans l'urètre et, à l'aide de pinces, guidez-le jusqu'à la vessie. Arrêtez lorsque vous rencontrez une résistance. Puis, éjectez lentement 50 microlitres de PLL à un débit de 10 microlitres toutes les 20 secondes afin d'éviter un reflux vésicorétrograde.À présent, laissez le cathéter dans la vessie pendant 20 minutes, en utilisant un bouchon pour empêcher l'écoulement. Après 20 minutes, retirez le cathéter et videz la vessie de son contenu en appuyant doucement sur le bas de l'abdomen. Ensuite, à l'aide d'une seringue d'un millilitre, rincez tout résidu restant dans le cathéter.À présent, mélangez soigneusement les cellules MB49 PSA par pipetage et chargez-les dans une seringue de 1 mL. Fixez le cathéter et lubrifiez-le comme précédemment. Insérez le cathéter dans la vessie comme auparavant.Et commencez par injecter les cellules, en éjectant progressivement 10 microlitres par 20 secondes. Attendez ensuite une heure. Après une heure, retirez le cathéter et videz la vessie de son contenu.Ensuite, relâchez la souris, placez-la sur son côté ventral et ranimez-la par une injection d'atipamézole. Surveillez maintenant la souris jusqu'à ce qu'elle reprenne une position sterno-abdominale, puis remettez-la dans sa cage d'origine. La sécrétion d'APS par les cellules MB49 variait selon le milieu de croissance.Le milieu DMEM est utilisé car il a entraîné la sécrétion la plus élevée de PSA. Afin de déterminer la sensibilité du test ELISA pour le PSA, différents nombres de cellules MB49 sécrétant le PSA ont été mélangés avec des cellules MB49 parentales. Le test a permis de détecter au moins 100 000 cellules sécrétant le PSA par million de cellules.La méthode d'implantation tumorale par PLL entraîne le développement de plusieurs tumeurs dans la vessie. Des collectes d'urine effectuées pendant la nuit à l'aide de cages métaboliques ainsi que des échantillons d'urine ponctuels peuvent être utilisés pour mesurer l'antigène spécifique de la prostate (PSA) par ELISA. Pour toutes les études animales, le poids des souris était enregistré comme indicateur de santé.Et la PSA urinaire est surveillée sur une base hebdomadaire comme indicateur de la croissance tumorale. Différents traitements ont été appliqués à chaque souris, entraînant des tailles de tumeur différentes. Deux semaines après l'implantation, les vessies ont été prélevées et traitées.Les tailles des tumeurs variaient, et les mesures de PSA prévoyaient cela. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire des tumeurs vésicales orthotopiques chez la souris et d'en surveiller la croissance. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures par souris.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien mélanger les cellules avant l'implantation et d'effectuer celle-ci lentement. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'analyse cytométrique en flux de l'Uvm ou le dosage immunoenzymatique (ELISA), peuvent être réalisées afin d'étudier l'activation immunitaire après le traitement.

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