Test in vitro à haut débit utilisant des organoïdes tumoraux dérivés du patient

Les organoïdes tumoraux dérivés du patient récapitulent avec précision l’architecture et la fonction du tissu tumoral avec une meilleure reproductibilité de la maladie. Par conséquent, la réponse d’un patient aux médicaments anticancéreux peut être évaluée avec précision à l’aide de ce modèle. Les organoïdes tumoraux ne conviennent pas à un système de dosage in vitro à haut débit ou à une analyse cellulaire en raison de la formation de grands amas en culture.

En utilisant cette technique, un HTS simple et plus précis pour l’évaluation des médicaments moléculaires ciblés a été développé. Étant donné que la culture organoïde est très différente de la culture 2D, on peut se sentir confus au sujet de la culture au début, mais il est important d’observer attentivement les changements morphologiques des organoïdes. Après avoir retiré le vil congelé du stockage d’azote liquide, agitez doucement les organoïdes tumoraux dérivés du patient dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une minute.

Retirez le vile du bain-marie et essuyez avec de l’éthanol à 70%. Placez ensuite le flacon dans l’armoire de biosécurité. Transférer les organoïdes tumoraux dans un tube de 15 millilitres contenant le milieu pour les organoïdes.

Utilisez une pipette de transfert de trois millilitres pour mélanger doucement les organoïdes et le milieu tumoraux en pipetant cinq fois. Pelleter les organoïdes tumoraux par centrifugation. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille organoïde tumorale dans cinq millilitres de milieu frais.

Transférer la suspension organoïde tumorale dans une fiole T25 et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après une semaine du premier passage, transférer la suspension organoïde tumorale de deux flacons T25 dans deux tubes centrifuges et abattre les organoïdes tumoraux par centrifugation. Estimer le volume de pastille organoïde tumorale et remettre en suspension la pastille dans 2,5 millilitres de milieu frais par tube.

Regrouper la suspension organoïde tumorale dans un tube. Transférer la suspension groupée dans une fiole T75 contenant 10 millilitres de milieu frais et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures de changement de milieu, hachez les organoïdes tumoraux à l’aide d’un instrument de fragmentation et de dispersion cellulaire équipé d’un porte-filtre contenant un filtre maillé de 70 micromètres.

Diluer 15 millilitres de suspension organoïde tumorale 10 fois. Utilisez le distributeur de suspension cellulaire pour ensemencer 40 microlitres de suspension organoïde tumorale diluée dans une microplaque sphéroïde ultra faible de 384 puits. Après 24 heures, utilisez un manipulateur de liquide pour ajouter 0,04 microlitre de solutions d’agents d’essai à partir de 10 dilutions en série à des plages de concentration finales de 20 micromolaires à 1,0 nanomolaire dans les puits, et incuber la plaque pendant six jours.

À la fin de l’incubation, ajouter un réactif de mesure intracellulaire de l’ATP dans les puits d’essai. Utilisez un mélangeur pour mélanger le contenu de la plaque et incuber la plaque pendant 10 minutes à environ 25 degrés Celsius. Utilisez un lecteur de plaques pour mesurer la teneur intracellulaire en ATP sous forme de luminescence.

Après 24 heures du troisième passage, placez une microplaque sphéroïde ultra basse de 384 puits avec 40 microlitres de milieu par puits ainsi qu’une plaque de destination sur le système de prélèvement et d’imagerie cellulaire. Construisez la chambre de prélèvement avec six millilitres de milieu de culture et centrifugez à 1 500 fois G pendant deux minutes pour éliminer les bulles d’air. Ajoutez quatre microlitres de suspension organoïde tumorale dans la chambre de prélèvement et placez la chambre de prélèvement sur le système.

Laissez les amas de cellules se déposer au fond de la chambre pendant une minute après la dispersion, puis lancez le balayage de la chambre. Réglez la taille de prélèvement sur 140 à 160 micromètres sur le système pour la sélection automatique des grappes de cellules. Ensuite, vérifiez la qualité des clusters de cellules sélectionnés sur les images numérisées et transférez 10 clusters de cellules par puits à l’aide de conseils de prélèvement dans la plaque de destination.

Dans la présente étude, l’effet des agents anticancéreux sur l’organoïde tumoral dérivé du patient a été évalué. La sensibilité élevée pour tous les agents anticancéreux était indiquée par les valeurs de concentration inhibitrices demi-maximales inférieures à deux micromolaires dans la zone sous les valeurs de courbe inférieures à 282. Pour une évaluation de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps, le pourcentage de cytolyse des organoïdes tumoraux en présence de deux anticorps différents a été mesuré.

Le pourcentage de cytolyse augmentait avec le temps. Sans les anticorps à six heures avec le rapport effecteur/cellule cible de un pour un, la cytolyse a atteint 45%Alors qu’au rapport de deux pour un, la cytolyse a atteint 70%La cytolyse médiée par les cellules tueuses naturelles à l’aide du trastuzumab était d’environ 60% au rapport effecteur/cellule cible de un pour un, et de 80% au rapport de deux à un à six heures. En revanche, le cétuximab a eu un impact dose-dépendant sur la cytolyse médiée par les cellules tueuses naturelles.

À la concentration la plus élevée de cétuximab, une cytolyse de 90 % a été observée au rapport effecteur/cellule cible de un pour un, et une cytolyse de 100 % a été observée dans un rapport de deux pour un, ce qui indique une efficacité élevée du cétuximab. Un système de dosage à haut débit utilisant des organoïdes tumoraux dérivés du patient est supérieur à l’évaluation d’agents anticancéreux potentiels et présente des possibilités d’évaluation des médicaments et de progrès en médecine personnalisée.