Summary
इस रिपोर्ट में, हम एक phenotyping परख प्रमुख जन्मजात और अनुकूली ल्युकोसैट आबादी की गणना के लिए नए सिरे से पूरे रक्त पर प्रदर्शन करने के धुंधला हो जाना और विश्लेषण कदम को प्रदर्शित करता है. हम एक multicenter चिकित्सीय परीक्षण के संदर्भ में इन प्रक्रियाओं के प्रदर्शन के लिए विचार पर जोर.
Protocol
नोट: प्रकाश से fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी की रक्षा करने के लिए, प्रकाश बंद के साथ एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी चरणों का प्रदर्शन.
1. एंटीबॉडी धुंधला पैनल तैयारी
- एंटीबॉडी धुंधला हो जाना पैनल तालिका 1 में पाया जा सकता है. एंटीबॉडी एकाग्रता पूरे रक्त के साथ अनुमापन द्वारा परिभाषित किया जाना चाहिए और एक ही प्रवाह cytometry उपकरण और प्रक्रियाओं के है कि दाग phenotyping नमूने प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- एक बार उपयुक्त धुंधला हो titers निर्धारित कर रहे हैं, एक ही मिश्रण में एक ताला टोपी ट्यूब में सभी एंटीबॉडी गठबंधन. 100 μl कुल मात्रा लाने प्रवाह धोने बफर (है Dulbecco 2% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पीबीएस) जोड़ें. किया जा रहा दाग नमूनों की संख्या के लिए इस मिश्रण को मापें. इस मिश्रण को आठ सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
2. धुंधला हो जाना
- यदि एकत्र रक्त अन्य प्रयोजनों के लिए विज्ञापन में इस्तेमाल किया जा रहा हैइस परख के लिए प्रत्यर्पण, एक अशेष भाजक अलग सेट करते समय अधिक समय के प्रति संवेदनशील प्रक्रियाओं शेष रक्त पर प्रदर्शन कर रहे हैं. अशेष भाजक के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है महत्वपूर्ण कोशिका क्षति के बिना venipuncture के बाद 4 घंटे के लिए.
- सत्यापित करें कि Trucount ट्यूब और लेबल नमूना दाग जा रहा है की पहचान करने के लिए ट्यूब के तल पर एक बरकरार मनका गोली. HVTN नैदानिक परीक्षणों में, प्रयोगशाला डेटा प्रबंधन प्रणाली (फ्रंटियर विज्ञान और प्रौद्योगिकी रिसर्च फाउंडेशन, एमहर्स्ट, NY) के लिए लेबल और दाग नमूनों को ट्रैक करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- बहुत संख्या और सभी अभिकर्मकों की समाप्ति की तारीख रिकॉर्ड. Trucount ट्यूब मनका गिनती ट्यूबों के बैग पर निर्माता द्वारा प्रदान की संख्या रिकार्ड, यह सुनिश्चित करें कि बैग पर बहुत संख्या ट्यूब पर बहुत संख्या मैच.
- को सही Trucount ट्यूब में धातु सेवक के ऊपर सिर्फ पूरे रक्त की 100 μl विंदुक pipetting रिवर्स का उपयोग करें. Smearing रक्त ट्यूब की ओर नीचे से बचें.
- अंधेरे में कमरे के तापमान (15-30 डिग्री सेल्सियस) पर 15 मिनट के लिए Trucount ट्यूब सेते हैं.
- यदि आवश्यक हो, 1X से 10 के एक अशेष भाजक × FACS lysing समाधान पतला Dih 2 ओ का उपयोग 900 1 μl × FACS lysing ट्यूब का हल जोड़ें.
- ट्यूब और भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए लगभग 15 सेकंड के लिए कम गति पर टोपी. टोपी नीचे पुश ट्यूब और प्रयोगशाला फिल्म के साथ सील पर ताला लगा स्थिति में मजबूती.
- -65 पर स्टोर ट्यूब ° सी -95 ° C जब तक नमूना केंद्रीय विश्लेषण प्रयोगशाला में लदान के लिए या घर में विश्लेषण के लिए तैयार है. नमूने इस स्तर पर कम से कम चार सप्ताह के लिए स्थिर रहे हैं. अगर शिपिंग या परख करने की क्रिया immediately, इस कदम से हटाया जा सकता है.
3. शिपिंग
नोट: निम्न निर्देश एक अछूता एसएएफ - टी - पाक इंक से शिपिंग प्रणाली का उपयोग विशेष रूप से इंटरनेशनल एयर ट्रांसपोर्ट एसोसिएशन (आईएटीए) विनियमों के अनुसार शिपिंग श्रेणी बी छूट दी गई है जैविक पदार्थों के लिए तैयार है. यदि एक ही स्थान में नमूनों का विश्लेषण करने के रूप में धुंधला हो जाना हुआ, 4 अनुभाग के लिए जाना है.
- नमूने धुंधला हो जाना के बाद तुरंत भेज दिया जा सकता है या एक बार वे -65 में जमे हुए हैं ° सी -95 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक ट्यूब पूरी तरह से और दाग नमूना बॉक्स में पन्नी और जगह में लपेटें. शोषक सामग्री के साथ दाग नमूना बॉक्स एक leakproof पाली बैग के अंदर रखें.
- एक Tyvek बैग और सील में थैले में संभव के रूप में कम हवा के रूप में साथ leakproof पाली बैग और सामग्री रखें.
- भीतरी भूरे रंग के बॉक्स के अंदर नमूना पैकेज (माध्यमिक पैकेजिंग के अंदर नमूना) रखें.
- भीतरी भूरे रंग ख जगहस्टायरोफोम छाती के अंदर बैल, यह करने के लिए स्थानांतरण को रोकने के खरोज में हासिल.
- स्टायरोफोम छाती सूखी बर्फ (लगभग 8 किलो) के साथ भरें और ढक्कन कसकर छाती पर जगह.
- टेप को सुरक्षित रूप शिपिंग बॉक्स और जहाज जैविक पदार्थ के रूप में, श्रेणी उचित सूखी (UN1845) बर्फ के निशान के साथ (UN3373 बी), IATA PI 650 निर्देश का पालन करें.
- प्राप्त होने पर नमूने -65 पर जमा हो जाती ° C -95 डिग्री सेल्सियस जब तक वे विश्लेषण कर रहे हैं.
4. विगलन और प्रवाह cytometry विश्लेषण
- फ्रीजर से सना हुआ नमूना निकालें अंधेरे में प्रवाह cytometer पर इकट्ठा करने से पहले कमरे के तापमान पर पिघलना. यदि एक से अधिक नमूना पर डेटा एकत्रित सभी ट्यूबों के लिए इतना है कि ट्यूब से अधिक 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर नहीं बैठे हैं विगलन लड़खड़ाहट प्रक्रिया मानकीकृत.
- नमूने एक चार लेजर प्रवाह cytometer BD LSR के रूप में उपयुक्त फिल्टर के साथ सुसज्जित का उपयोग कर प्राप्त किया जाना चाहिएद्वितीय. 4 डेटा संग्रह के लिए मानक cytometer अंशांकन और प्रतिदीप्ति मुआवजा तरीकों का उपयोग.
नोट: 5 संग्रह के दौरान सेट नहीं तितर बितर या पक्ष तितर बितर थ्रेसहोल्ड आगे. Trucount मोती इन मोतियों की एक सबसेट विश्लेषण के दौरान के लिए जिम्मेदार नहीं किया जा पैदा करने के लिए मापदंडों के लिए कम से कम संभव दहलीज सेटिंग नीचे गिर सकता है. यदि साधन द्वारा आवश्यक करने के लिए एक सीमा निर्धारित करने के लिए, कम से कम संभव सियान चैनल सीमा निर्धारित है. क्योंकि CD45 + पैनल के साथ दाग leukocytes सियान सकारात्मक हूँ जाएगा, और Trucount मोती भी हूँ सियान चैनल में प्रतिदीप्ति, यह सभी प्रासंगिक उचित एकत्र किया जा डेटा के लिए अनुमति चाहिए.
- 5 सेकंड के लिए प्रवाह cytometer पर लोड करने से पहले नमूना ट्यूब भंवर. कई चैनलों में Trucount मोती अत्यधिक प्रतिदीप्ति. आबादी है कि Cy5 पीई और APC (दो colo के लिए अत्यधिक डबल सकारात्मक है खोजने के द्वारा संग्रह दौरान मोती गेटरुपये है कि सबसे बड़ी आसानी कोशिकाओं से मोती भेद इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर करते हुए भिन्न - भिन्न हो सकता है). अपने को रोकने के द्वार के रूप में मोती गेट का चयन करें, और रिकॉर्ड डेटा जब तक कम से कम 20,000 मोती का अधिग्रहण कर रहे हैं.
- उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर FlowJo (Treestar, Ashland, OR) के रूप में इस तरह के डेटा का विश्लेषण चित्रा 1 gating एक प्रतिनिधि नियंत्रण रक्त आकर्षित से अलग ल्युकोसैट आबादी के विश्लेषण के लिए उपयोग की योजना से पता चलता है.
5. Trucount गणना
- प्रत्येक Trucount ट्यूब फ्लोरोसेंट मोतियों की एक lyophilized गोली शामिल हैं. ट्यूब को तरल जोड़ने और vortexing के बाद, मोती नमूना भर में समान रूप से वितरित हो जाना चाहिए. गोली में मोतियों की संख्या बहुत संख्या से थोड़ा भिन्न होता है और ट्यूब के लिए भंडारण बैग पर पाया जा सकता है.
- गेट Trucount मोती और सेल आबादी के रूप में चित्र 1 में दिखाया प्रत्येक जनसंख्या के लिए घटना मायने रखता निर्धारित है. मैं घटनाओं की संख्या की तुलनाn मोतियों की कुल ट्यूब में मूल संख्या मनका गेट आप नमूने एकत्र के अनुपात, जो तब के लिए प्रत्येक की आबादी के लिए पूर्ण एकाग्रता (यानी, कोशिकाओं / μl) का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है निर्धारित करने की अनुमति देगा. सेल (# कोशिकाओं / μl पूरे रक्त) एकाग्रता = [# आबादी / घटनाओं (# मनका घटनाओं / गोली में कुल मोती)] / 100 μl: निम्न समीकरण इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा Gating 1. योजना प्रमुख ल्युकोसैट एक स्वस्थ स्वयंसेवक से प्रतिनिधि डेटा दिखा आबादी के विश्लेषण के लिए उपयोग किया. ए) Trucount मनकों (i) gated और कोशिकाओं से बाहर रखा जाता है. Granulocytes (ii) और चित्रित हैं lympohcytes और monocytes 3 popluations में विभाजित हैं: CD14नकारात्मक लिम्फोसाइटों (iii), सभी CD14 नकारात्मक कोशिकाओं (iv), और गैर लिम्फोसाइटों (v). बी) CD14 नकारात्मक लिम्फोसाइटों सीडी 4 + टी कोशिकाओं (vi), CD8 + टी (vii) कोशिकाओं, बी कोशिकाओं (viii), CD56 उज्ज्वल एन.के. कोशिकाओं (ix), CD56 मंद एन.के. कोशिकाओं (x), और CD56 नकारात्मक एन.के. कोशिकाओं भेद gated हैं (xi). सी) सभी CD14 नकारात्मक कोशिकाओं (xii) माइलॉयड और plasmacytoid (xiii) वृक्ष के समान कोशिकाओं भेद gated हैं. डी) गैर lympocytes गैर शास्त्रीय (xiv), (xv), मध्यवर्ती, और शास्त्रीय monocytes (xvi) भेद gated हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
अधिक विशिष्ट सेल सबसेट कि चित्रा 1 (जैसे, NKT कोशिकाओं या neutrophils) में नहीं दिखाए जाते हैं भी पैनल हम वर्तमान का उपयोग प्रतिष्ठित किया जा सकता है, और gating योजना या विस्तारित विशिष्ट अध्ययन की जरूरतों को पूरा करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. कुछ gating दिखाया कदम इस विधि के लिए अद्वितीय हैं. विशेष ध्यान दें, एक शामिल किए जाने के गेट औरअपवर्जन गेट Trucount मोती के आसपास तैयार कर रहे हैं और एक दूसरे के शीर्ष पर रखा है, मोती गेट गिनती के लिए एक, और एक सेलुलर विश्लेषण (चित्रा 1 ए) से मोती को बाहर करने के लिए. इसके अलावा, क्योंकि लिम्फोसाइटों, monocytes, और granulocytes के रूप में आसानी से पूरे रक्त में प्रतिष्ठित नहीं कर रहे हैं के रूप में वे आगे तितर बितर और पक्ष तितर बितर, gating इन कोशिकाओं CD45 अभिव्यक्ति और तितर बितर पक्ष अक्सर आवश्यक है (चित्रा 1 ए) का उपयोग कर से परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं में हैं. Contaminating (परिक्रमा) granulocytes कि lymphocytes और monocytes CD45 पक्ष और तितर बितर का उपयोग कर से अलग नहीं किया जा सकता है उनके उच्च CD16 अभिव्यक्ति (चित्रा 1C और चित्रा 1D) द्वारा कुछ भूखंडों में अलग पहचाना जा रहे हैं. contaminating granulocytes की संख्या आम तौर पर छोटा है, और वे monocyte और एन.के. सेल gating साथ हस्तक्षेप नहीं करते.
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Discussion
इस रिपोर्ट में, हम प्रवाह cytometry द्वारा ताजा पूरे रक्त में ल्युकोसैट आबादी enumerating के लिए एक विधि मनका आधारित प्रस्तुत और मापदंडों केंद्रीकृत नमूना विश्लेषण के साथ अपने एक multicenter चिकित्सीय परीक्षण में उपयोग करने के लिए आवश्यक को कवर. इस विधि पर बनाता और BD Trucount प्रोटोकॉल अनुकूलन और एक multicenter चिकित्सीय परीक्षण की स्थापना में अपनी विश्वसनीय उपयोग में सक्षम बनाता है. धुंधला हो परख सरल है और प्रदर्शन करने के लिए लगभग 45 मिनट लगते हैं, यह संभव रक्त प्रसंस्करण प्रयोगशाला तकनीशियनों यह प्रदर्शन और स्थिर और विश्लेषण के लिए एक केंद्रीय परख प्रयोगशाला नमूनों जहाज के लिए कर रही है. परख पूरे खून है, जो समय और लागत गहन PBMC प्रसंस्करण के लिए जरूरत eliminates और मानक phenotyping assays की तुलना में कहीं कम मात्रा का उपयोग करता है की केवल 100 μl की आवश्यकता है. इसके अलावा, ताजा पूरे रक्त का उपयोग करके, इस परख अधिक सही कोशिकाओं के vivo राज्य में दर्शाया गया है और कुछ सेल प्रकार पर मनाया cryopreservation के हानिकारक प्रभाव समाप्तएस 1-3. यह धुंधला विधि सेल सांद्रता का सही माप का उत्पादन करता है, लेकिन सीबीसी और अन्य गिनती तरीकों की तुलना में काफी अधिक सेल प्रकार भेद का जोड़ा लाभ के साथ. सटीक और लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण ध्यान प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम मानकीकरण और एक दस्तावेज प्रणाली है कि सभी चरणों के ट्रैक रखता है कि ऐसा कोई भी विसंगतियों की खोज कर रहे हैं कि त्रुटि का स्रोत का पता लगाया जा सकता है का उपयोग करने के लिए है.
इस प्रक्रिया के दौरान कई महत्वपूर्ण कदम है कि इस परख से प्राप्त आंकड़ों की गुणवत्ता को प्रभावित कर रहे हैं. सबसे पहले, और यह समय यह दाग है करने के लिए तैयार है समय से रक्त की हैंडलिंग उपचार के मानकीकरण महत्वपूर्ण है, क्या पहले किया गया है PBMC 6 प्रसंस्करण के लिए रिपोर्ट करने के लिए समान है. हम लगातार डेटा जब रक्त संग्रह ट्यूबों में नैदानिक साइट पर संग्रहीत किया जाता है और परिवेश के तापमान पर प्रसंस्करण प्रयोगशालाओं के लिए ले जाया प्राप्त करने के लिए, धुंधला हैरक्त ड्रॉ के 4 घंटे के भीतर प्रदर्शन किया, और दाग नमूने तो केंद्रीय परख प्रयोगशाला के लिए सूखी बर्फ पर भेज दिया हैं. इसके अलावा, केंद्रीय प्रयोगशाला में एंटीबॉडी कॉकटेल बना रही है और यह साइट प्रसंस्करण प्रयोगशालाओं के लिए भेजने के द्वारा, हम साइट के बीच में निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए और एक नियंत्रण रक्त आकर्षित पर प्रत्येक कॉकटेल का परीक्षण कर सकते हैं, इससे पहले कि यह करने के लिए परीक्षण के नमूने दाग प्रयोग किया जाता है. यह महत्वपूर्ण है कि केंद्रीय परख प्रयोगशाला इस प्रक्रिया मानकीकृत है. इसलिए हम सलाह देते हैं कि एक बार घटक एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक और नकारात्मक 7 आबादी के बीच अलगाव का अनुकूलन titrated कर रहे हैं, सभी नमूनों के धुंधला के लिए एंटीबॉडी के एक ही बहुत कुछ एक चिकित्सीय परीक्षण में इस्तेमाल किया जा प्रत्येक मार्कर के लिए लगातार धुंधला हो जाना के स्तर को बनाए रखने के लिए. यदि यह संभव नहीं है (उदाहरण के लिए, एक एंटीबॉडी निर्माता से उपलब्धता की कमी), एंटीबॉडी के प्रत्येक नए बहुत उचित सुनिश्चित करने के लिए कि प्रवाह cytometry डेटा कि पिछले बहुत का उपयोग प्राप्त करने के लिए तुलनीय होगा titrated चाहिए. केंद्रीय प्रयोगशाला औरसाइट प्रसंस्करण प्रयोगशाला महान देखभाल करने के लिए जहाज और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिरक्षी कॉकटेल दुकान और गिरावट हो सकता है कि कम से कम प्रकाश जोखिम से बचने के लिए मिलकर 8-9 रंगों के साथ विशेष रूप से करना चाहिए.
इस परख के साथ प्राप्त आंकड़ों की सटीकता धुंधला हो जाना और प्रवाह cytometer पर नमूना अधिग्रहण की प्रक्रिया के दौरान कई महत्वपूर्ण कदम पर निर्भर करता है. विशेष ध्यान दें, सही Trucount ट्यूब में रक्त के pipetting रिवर्स आवश्यक है, रक्त की मात्रा में एक छोटा सा फर्क सेल सबसेट की गणना सांद्रता पर एक बड़ा प्रभाव हो सकता है. एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ने के बाद कम गति पर Vortexing और बी.डी. FACS अच्छी तरह अभिकर्मकों मिश्रण lyse भी महत्वपूर्ण है. इसी तरह, अच्छी तरह से vortexing को मोती नमूना भर में समान रूप से बांटना पहले अधिग्रहण सही 10 गिनती के लिए आवश्यक है. प्रवाह cytometer पर विश्लेषण सेटिंग में मामूली बदलाव भी प्राप्त आंकड़ों पर एक बड़ा प्रभाव हो सकते हैं, इसलिए caअंशांकन और दैनिक उपयोग के साथ 4 cytometer की स्थापना के लिए reful ध्यान दिया जाना चाहिए.
यह भी कहा कि जबकि प्रारंभिक आंकड़ों से पता चलता है कि दाग नमूने ठंड सेल (नहीं दिखाया डेटा) प्राप्त सांद्रता को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है, यह अभी तक अच्छी तरह से परीक्षण किया जाना जाना चाहिए. हालांकि यह एक संभावित चिंता का विषय है, नमूने के बीच तुलना को अभी भी लंबे समय के रूप में विश्वास के साथ किया जा सकता है के रूप में सभी नमूने एक सुसंगत तरीके से नियंत्रित किया जाता है.
धुंधला हो जाना और विश्लेषण भर सावधानी से नमूना ट्रैकिंग विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, खासकर जब नमूने के सैकड़ों एक चिकित्सीय परीक्षण के संदर्भ में कार्रवाई कर रहे हैं. एक बार डेटा हासिल कर ली है और विश्लेषण शुरू कर दिया है, यह विश्लेषण द्वार के रूप में नमूने के बीच जितना संभव प्रमाण के अनुसार करना महत्वपूर्ण है. कुछ आबादी की प्रतिदीप्ति में कुछ परिवर्तनशीलता विभिन्न स्वयंसेवकों के बीच विशेष रूप से पाए जाते हैं, लेकिन हो सकता है मानक गेट स्थानों सेट किया जाना चाहिए कि appliकेबल के लिए संभव के रूप में कई नमूने के रूप में. मानक स्थान से फाटक के स्थानांतरण किसी भी और प्रलेखित किया जाना चाहिए खाते में ले लिया जब निर्धारण अगर सेल गिनती में परिवर्तन नमूने के बीच होते हैं.
यह धुंधला विधि प्रमुख ल्युकोसैट सबसेट एक एंटीबॉडी धुंधला हो जाना पैनल का उपयोग कर की गणना के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन प्रक्रिया और पैनल को आसानी से विशिष्ट अध्ययन जरूरतों को पूरा करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. Trucount तकनीकी डाटा शीट प्रक्रिया है, जो रक्त के 50 μl का उपयोग कर पता चलता है के विपरीत, विधि हम वर्तमान 100 μl का उपयोग करता है. एक बड़ा रक्त की मात्रा का उपयोग करके अधिक घटनाओं के विश्लेषण, जो उपयोगी है के दौरान हासिल किया जा सकता है जब परिधीय रक्त में ऐसे वृक्ष के समान कोशिकाओं के रूप में अपेक्षाकृत कम सांद्रता के साथ सेल आबादी का अध्ययन. हालांकि पिछले अध्ययनों Trucount 50 μl का उपयोग कर और 100 μl रक्त 11-12 संस्करणों के माध्यम से वृक्ष के समान सेल आबादी enumerated है, रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि उचित परिशुद्धता कम से कम 400 positiv प्राप्त करने पर निर्भर हैई जनसंख्या घटनाओं, और इस बार वृक्ष के समान कोशिकाओं के साथ मुश्किल हो सकता है जब 13 रक्त की केवल 50 μl का उपयोग कर सकते हैं. खून का इस्तेमाल किया मात्रा आगे विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं या धुंधला पैनलों के लिए विश्लेषण आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए समायोजित कर सकते हैं. इसी तरह, धुंधला पैनल के कुछ सेल प्रकार पर ध्यान केंद्रित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, इस प्रकार अधिक विशेष सेल यहाँ दिखाया गया है (उदाहरण के लिए, अतिरिक्त एन.के. सेल सबसेट या विनियामक टी कोशिकाओं) पैनल द्वारा वर्तमान में प्रतिष्ठित नहीं सबसेट की गणना के लिए अनुमति देता है. एक पैनल के उपयोग धुंधला हो जाना प्रोटोकॉल सरल और दाग नमूनों की mislabeling के रूप में ऐसे कई पैनलों के साथ जुड़े त्रुटियों को कम कर देता है. हालांकि कई पैनल के प्रयोग और त्रुटि के लिए लागत की क्षमता बढ़ जाती है, अलग विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के अनुरूप पैनल अधिक विस्तृत phenotyping और / या सक्रियण मार्करों के शामिल किए जाने के लिए अनुमति देते हैं, और उनके उपयोग multicenter चिकित्सीय परीक्षण में आसानी से लागू किया जा सकता है, खाते में ले जा रही है पहले विचार डिस्कussed.
| मार्कर | Fluorophore | कंपनी | क्लोन |
| CD45 | Am सियान | बी.डी. बायोसाइंसेज | 2D1 |
| CD3 | FITC | बी.डी. बायोसाइंसेज | SK7 |
| CD8 | Cy5.5 PerCP | बी.डी. बायोसाइंसेज | SK1 |
| CD4 | Ax700 | बी.डी. बायोसाइंसेज | RPA-T4 |
| एचएलए DR | ECD | Beckman कल्टर | Immu-357 |
| CD14 | v450 | बी.डी. बायोसाइंसेज | MφP9 |
| CD19 | पीई | <td> बी.डी. बायोसाइंसेजHIB19 | |
| CD16 | APC-H7 | बी.डी. बायोसाइंसेज | 3G8 |
| CD56 | पीई Cy7 | बी.डी. बायोसाइंसेज | NCAM16.2 |
| CD11c | APC | बी.डी. बायोसाइंसेज | बी ly6 |
| CD123 | Cy5 पीई | बी.डी. बायोसाइंसेज | 9F5 |
तालिका 1 एंटीबॉडी धुंधला हो जाना पैनल के सभी प्रमुख परिधीय रक्त ल्युकोसैट आबादी का निर्धारण.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम इस विधि पांडुलिपि, और वीडियो के विकास में उनकी सहायता के लिए जेसिका जोन्स, एरिका क्लार्क, Constance Ducar, डोना स्मिथ, रॉय लुईस, लिली Apedaile, Joanne Wiesner, Devin एडम्स, कोरी McBain और स्टीफन Voght धन्यवाद.
इस काम के बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन CAVD अनुदान 38645 (MJM) और अनुदान स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान AI068618 UM1 और AI069481 U01 (MJM) द्वारा समर्थित किया गया. EA-N. NIH अनुदान T32 AI007140 द्वारा समर्थित है. हम उनके उदार उपकरण दान के लिए जेम्स बी Pendleton चैरिटेबल ट्रस्ट धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
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