Summary
이 보고서에서, 우리는 주요 타고난 및 적응 백혈구 인구를 열거하는 신선한 전체 혈액에서 수행 phenotyping 분석의 착색 및 분석 단계를 보여줍니다. 우리는 multicenter 임상 실험의 맥락에서이 절차를 수행하기위한 고려 사항을 강조.
Abstract
말초 혈 백혈구의 Cryopreservation 널리 임상 실험에 면역 반응 평가를위한 세포를 보존하기 위해 사용하고 면역 평가의 용이성 및 표준화를위한 많은 장점을 제공하지만,이 과정의 해로운 효과는 같은 과립 성 백혈구와 같은 일부 세포 집합, B 세포에 관찰 된 수 있습니다 , 1-3 및 수지상 세포. 신선한 백혈구를 시금하면 세포의 생체 상태에서의보다 정확한 사진을 제공하지만, 종종 큰 임상 시험의 맥락에서 수행 할 수 어렵습니다. 신선한 세포 assays은 시간이 오래 걸릴 경우, 자신의 응용 프로그램으로 인해 실험실 직원의 필요한 노동 시간에 비현실적 일 수 자원 봉사 약속과 시간대에 의존하고. 또한, 재판이 여러 센터에서 실시하는 경우, assays을 수행하기 위해 필요한 자원과 훈련 연구소는 임상 사이트에 충분한 가까이에 위치 할 수 없습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 devel이예와 같은 assays보다 더 강력한 세포 유형 특정 정보를하였으며, 표현형과 말초 혈 내의 주요 백혈구 인구를 열거, Trucount 튜브 (산호세, CA Becton 디킨슨)와 함께 사용할 수있는 11 색 항체 염색법 패널을 oped 완전한 혈액 카운트 (CBC) 또는 몇 세포 유형에 얼룩 Trucount 관을위한 상용 가능한 패널 assays. 착색 절차는 간단합니다, 신선한 전체 혈액의 약 100 μl가 필요하고 가능한 표준 혈액 처리 연구소가 수행 할 수있게 약 45 분 정도 소요됩니다. 그것은 BD Trucount 튜브 기술 데이터 시트 (에서 적응 버전 2,010분의 8 ). 착색 항체 칵테일은 중앙 검정 실험실에서 대량으로 사전에 준비 사이트 처리 실험실로 배송 될 수 있습니다. 스테인드 튜브가 해결 될 수 있습니다및 다색의 유동 세포 계측법 분석을위한 중앙 분석 실험실에 배송을 위해 냉동. 이 착색 패널에서 생성 된 데이터는 개입과 관련하여 시간이 지남에 따라 백혈구 농도의 변화를 추적 할 쉽게 더 관심의 특정 세포 유형의 활성화 상태를 평가하기 위해 개발 될 수 사용할 수 있습니다. 이 보고서에서 우리는 신선한 전체 혈액 및 multicenter 임상 실험을 지원하는 중앙 검정 실험실에서 이러한 스테인드 샘플을 분석하는 단계에 착색을 수행 할 혈액 처리 연구실 기술자가 사용하는 절차를 보여줍니다. 비디오 정보는 HIV 백신 평가판 네트워크 (HVTN)에 임상 시험 혈액 추첨의 컨텍스트에서 수행되기 때문에 절차.
Protocol
참고 : 빛의 형광 - 복합 항체를 보호하기 위해 라이트와 바이오 안전 캐비넷의 모든 단계를 수행합니다.
1. 항체 염색법 패널 준비
- 항체 염색법 패널은 표 1에서 찾을 수 있습니다. 항체 농도는 전체 피와 적정에 의해 정의하고 동일한 유동 세포 계측법 장비와 스테인드 phenotyping 샘플을 취득하는 데 사용됩니다 절차를 사용해야합니다.
- 적절한 착색의 titers가 결정되면 잠금 캡 튜브에서 하나의 혼합으로 모든 항체가 조화를 이루고 있습니다. 100 μl에 총 볼륨을 가져다 흐름 세척 버퍼 (2 % 열 inactivated 태아 소 혈청과 Dulbecco의 PBS)를 추가합니다. 물들되는 샘플 수에 대한 혼합물을 확장. 이 혼합물은 최대 8 주까지에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 더럽히는 것
- 수집 된 혈액은 광고에 다른 목적을 위해 사용하는 경우시간에 민감한 절차 남아있는 혈액 수행하는 동안이 분석에 dition은 따로 나누어지는을 설정할 수 있습니다. 나누어지는이 중요한 세포의 손실없이 venipuncture 후 4 시간 동안 실온에서 최대 저장할 수 있습니다.
- 그대로 비드 펠렛은 Trucount 튜브 및 라벨 샘플 묻은되는 식별 할 수있는 튜브의 하단에 있다는 것을 확인합니다. HVTN 임상 실험에서 실험 데이터 관리 시스템 (프론티어 과학 기술 연구 재단, 애 머스트, NY)은 스테인드 샘플을 라벨 및 추적하는 데 사용됩니다.
- 많은 번호와 모든 시약의 유효 날짜를 기록합니다. 튜브의 가방에있는 제조업체에서 제공 Trucount 관 구슬 카운트 번호를 기록하고, 가방에있는 많은 번호가 튜브에 많은 번호를 일치하는지 확인하십시오.
- 정확하게 단지 금속 리테이너 위에 Trucount 튜브에 전체 혈액의 100 μl를 피펫에 pipetting 반대로 사용합니다. 관의 측면 아래로 번짐의 피를 사용하지 마십시오.
- 어둠 속에서 실내 온도 (15-30 ° C)에서 15 분 동안 Trucount 관을 품다.
- 필요한 경우, diH 2 O.를 사용하여 1X에 10 나누어지는 × FACS Lysing 솔루션을 희석 900 μl 1 × 튜브에 FACS Lysing 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
- 혼합하는 약 15 초에 낮은 속도로 철저하게 관과 소용돌이를 캡. 실험실 필름과 관 및 봉인에 위치를 잠금으로 단단히 뚜껑을 아래로 밀어 넣습니다.
- -65에서 튜브를 저장 ° C -95 ° C의 예제는 중앙 분석 실험실로 배송이나 집에 분석을위한 준비가 될 때까지. 샘플은 적어도 4 주 동안이 단계에서 안정적입니다. imme을 배송 또는 시금 경우diately,이 단계는 생략 할 수 있습니다.
3. 해운
참고 : 다음 지침은 구체적으로 국제 항공 및 운송 협회 (IATA) 규정에 따라 운송 카테고리 B 면제 생물학적 물질을위한 SAF-T-박 주식회사에서 절연 배송 시스템을 사용합니다. 착색이 발생한 같은 위치에 샘플을 분석하는 경우, 섹션 4로 이동합니다.
- 샘플은 즉시 염색 후 배송하거나 일단은 -65에서 얼 ° C -95 ° C 사이 스테인드 표본 상자에 호일과 장소에 완전히 각 관을 넣어. 흡착제로 leakproof 폴리 가방 내부에 스테인드 표본 상자를 놓으십시오.
- 가방에 가능한 한 공기와 같은과 Tyvek 가방과 인감에 leakproof 폴리 가방과 내용을 넣으십시오.
- 내부 갈색 상자 안에 표본 패키지 (보조 포장 내부의 표본) 놓습니다.
- 내부 갈색 B를 배치스티로폼 상자 내부의 소는 변화를 방지하기 위해 들여 쓰기로 확보.
- 드라이 아이스 (약 8kg)와 스티로폼 상자를 작성하고 가슴에 단단히 뚜껑을 놓습니다.
- 안전하게 테이프 배송 상자와 배는 생물 물질로 적절한 드라이 아이스 (UN1845) 표시가있는 카테고리 B은 (UN3373), IATA PI-650 지시 사항을 따르십시오.
- 수령시, 샘플이 -65에 저장됩니다 ° C -95 ° C에 그들이 분석까지.
4. 해동 및 유동 세포 계측법 분석
- 흐름 cytometer에 수집 전에 어둠 속에서 실온에서 해동은 냉장고에서 스테인드 샘플을 제거합니다. 하나 이상의 샘플에 대한 데이터를 수집하면 튜브가 1 시간 이상 각각에 대해 실온에서 앉아하는 일이 없도록 해동 망설으로 모든 튜브에 대한 프로세스를 표준화.
- 샘플은 같은 BD LSR 적절한 필터가 장착 된 네 레이저 흐름 cytometer를 사용하여 취득해야합니다II. 데이터 수집 4 표준 cytometer 보정 및 형광 보상 방법을 사용하십시오.
참고 : 컬렉션 5 중 앞으로 분산 또는 측면 분산 형 임계 값을 설정하지 마십시오. Trucount 비즈는 구슬의 일부는 분석을하는 동안 설명 할 수하지 원인이 이러한 매개 변수에 대한 낮은 임계 값 설정 아래 떨어질 수 있습니다. 임계 값을 설정하려면 악기가 필요한 경우, 가장 낮은가요 시안 채널 임계 값을 설정합니다. 패널 물들 CD45 +의 백혈구는 시안이 긍정적인가되며, Trucount 구슬도 앰 시안 채널에 형광 때문에,이 적절히 수집 할 모든 관련 데이터를 허용해야합니다.
- 흐름 cytometer에로드하기 전에 5 초에 소용돌이 샘플 튜브를. Trucount 구슬은 여러 채널에서 높은 형광. PE Cy5와 APC (두 colo에 대한 높은 더블 긍정적 인 인구를 찾아서 게이트 수집하는 동안 구슬을가장 쉽게 세포에서 구슬을 구분하는 RS)은 장비에 따라 달라질 수 있습니다. 최소한 2 만 구슬이 획득되기 전까지는 중단 게이트로 구슬 문을 선택하고 기록 데이터입니다.
- 이러한 FlowJo (Treestar, 애쉬 랜드, OR)와 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 그림 1은 대표적인 제어 혈액 추첨 다른 백혈구 인구의 분석에 활용 게이팅 구조를 보여줍니다.
5. Trucount 계산
- 각 Trucount 튜브는 형광 구슬의 동결 건조 된 펠렛이 포함되어 있습니다. 관에 액체를 추가하고 vortexing 후, 구슬 동일하게 시료 전체에 분산 될 것입니다. 펠렛의 구슬의 수는 많은 번호로 약간 다르며 튜브의 저장소 가방에서 찾을 수 있습니다.
- 게이트는 Trucount 비즈와 세포 인구 각 인구에 대한 이벤트 카운트를 결정하기 위해 그림 1과 같이. 이벤트의 수를 비교 전N 관 원래 구슬의 총 개수에 구슬 문은 다음 각 인구의 절대 농도 (즉, 세포 / μl)를 결정하는 데 사용할 수있는 샘플 수집의 비율을 결정 할 수 있습니다. 세포 농도 (# 세포 / μl 전체 혈액) = [/ # 인구 이벤트 (# 비드 이벤트 / # 펠렛의 총 구슬)] / 100 μl 다음 방정식이 목적을 위해 사용할 수 있습니다.
6. 대표 결과
그림 1. 게이팅 제도는 건강한 자원 봉사의 대표 데이터를 보여주는 주요 백혈구 인구의 분석에 활용. A) Trucount 비즈는 (i) 출입을 금지하고 세포에서 제외됩니다. 과립 성 백혈구 (II)이 구분되어 있으며 lympohcytes와 단핵 세포는 3 popluations로 구분됩니다 : CD14부정적인 림프구 (3) 모든 CD14 음성 세포 (IV), 비 림프구 (V). B) CD14 부정적인 림프구는 CD4 + T 세포 (바이올렛), CD8 + T 세포 (VII), B 세포 (VIII), CD56 밝은 NK 세포 (IX), CD56 희미 NK 세포 (X) 및 CD56 부정적인 NK 세포를 구별 할 게이트 아르 (사이). C) 모든 CD14 음성 세포는 골수 양 (XII) 및 plasmacytoid (XIII) 수지상 세포를 구별 할 수 출입을 금지합니다. D) 비 lympocytes은 비 고전 (XIV), 중급 (XV), 그리고 클래식 (XVI) 단핵 세포를 구별 할 수 출입을 금지합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 1 (예를 들어, NKT 세포 나 호중구)에 표시되지 않습니다보다 구체적인 셀 집합은 우리가 제시 패널을 사용하여 구별 할 수 있으며, 게이팅 스키마는 확장 또는 특정 학습 요구를 충족하도록 수정할 수 있습니다. 표시 특정 게이팅 단계는이 방법의 특징이다. 특히 메모, 포함 게이트 및제외 게이트는 Trucount 구슬 주위에 그려 서로의 상단에 위치, 계산을위한 게이트 구슬을 한, 하나는 세포 분석 (그림 1A)에서 비즈를 제외 할 수 있습니다. 사람들이 CD45 표현과 사이드 분산은 (그림 1A) 종종 필요가 있습니다를 사용하여 앞으로 분산과 측면 산란, 게이팅 셀에게이 말초 혈 mononuclear 세포에로도, 때문에 림프구, 단핵 세포, 그리고 과립 성 백혈구는 쉽게 전체 혈액에 구별되지 않습니다. CD45과 측면 분산을 사용하여 림프구와 단핵 세포 분리 할 수 없습니다 오염 과립 성 백혈구가 (원) 높은 CD16 표현 (그림 1C와 그림 1D)에 의해 일부 플롯에서 구별됩니다. 오염 과립 성 백혈구의 수는 일반적으로 작고, 그들은 단핵 세포와 NK 세포 게이팅을 방해하지 않습니다.
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Discussion
이 보고서에서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 신선한 전체 혈액의 백혈구 인구를 열거위한 구슬 기반의 방법을 제시하고 중앙 샘플 분석 multicenter 임상 시험에서의 사용에 대한 매개 변수가 필요 다룹니다. 이 방법은 토대로 및 BD Trucount 프로토콜을 최적화 multicenter 임상 실험 환경에서의 신뢰성 사용할 수 있습니다. 착색 분석은 간단하다하고 가능한 혈액 처리 연구실 기술자가 수행 할 및 분석을위한 중앙 검정 실험실에 샘플을 동결하고 배송하기 위해 만들어 수행 할 수있는 약 45 분 정도 소요됩니다. 분석은 시간과 비용이 많이 PBMC 처리의 필요성을 제거하고 표준 phenotyping의 assays보다 훨씬 적은 양을 사용하여 전체 혈액의 약 100 μl가 필요합니다. 또한, 신선한 전체 혈액을 사용하여,이 분석은보다 정확하게 세포의 생체 상태를 묘사 및 일부 세포 유형에 관찰 cryopreservation의 해로운 효과를 제거S 1-3. 이 염색 방법은 세포 농도의 정확한 측정을 생산하지만, CBC 등의 계산 방법보다 훨씬 더 많은 세포 유형을 구별의 추가 혜택과 함께. 정확하고 일관된 결과를 얻기에 열쇠는 신중하게 프로토콜의 중요한 단계를 표준화하고 발견 된 모든 이상이 오류의 소스로 추적 할 수 있도록 모든 단계를 추적 문서 시스템을 활용하는 것입니다.
이 분석에서 얻은 데이터의 품질에 영향을 미치는 과정에서 여러 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 그것은이 물들어있는 시간 그려진 시간의 치료 및 혈액의 처리의 표준화는 이전에 PBMC 처리 6보고 된 내용과 유사한 것이 중요합니다. 우리는 피가 주위 온도에 임상 사이트에서 수집 튜브에 저장 및 처리 실험실로 이송되어 일관된 데이터를 얻을, 착색은혈액 그리기 4 시간 이내에 수행하고, 스테인드 샘플은 다음 중앙 검정 연구실에 드라이 아이스에 배송됩니다. 또한, 중앙 연구소에서 항체 칵테일을하고 사이트 처리 실험실에 보내, 우리는 사이트 간의 일관성을 보장하고이 시험 샘플을 얼룩하는 데 사용되기 전에 제어 혈액 추첨에 각 칵테일을 테스트 할 수 있습니다. 그것은 중앙 검정 실험실이 과정을 표준화하는 것이 중요합니다. 그러므로 우리는 일단 구성 항체가 긍정적이고 부정적인 인구 7 사이의 분리를 최적화 할 수 titrated하는 것이 좋습니다 항체 같은 많은 각 마커에 대한 일관된 착색 수준을 유지하기 위해 임상 시험에서 모든 샘플의 착색을 위해 사용될 수 없습니다. 이 (예를 들어, 항체 제조업체의 가용성의 부족) 할 수없는 경우 항체의 각 새로운 많은 적절하게 유동 세포 계측법 데이터 이전을 많이 사용하여 수득에 필적 될 수 있도록 titrated해야합니다. 중앙 연구소와사이트 처리 연구실은 특히 협동 염료 8-9으로 배송하고 저장 항체 칵테일을 4 ° C에서와 발생할 수 있습니다 저하를 최소화하기 위해 빛 노출을 피하기 위해 큰주의를 기울여야합니다.
이 검정으로 취득한 데이터의 정확성은 흐름 cytometer에 착색 절차 및 샘플 수집하는 동안 몇 가지 중요한 단계에 따라 달라집니다. 특히 노트 중, Trucount 튜브에 혈액의 pipetting 정확한 역이 필수적이며 혈액 볼륨의 작은 차이는 세포 하위 집합의 계산 된 농도에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 항체 칵테일을 추가 한 후 낮은 속도로 Vortexing와 BD의 FACS 철저하게 시약을 혼합하는 lyse 것도 중요합니다. 마찬가지로, 인수는 정확한 계산이 10 필수입니다 전에 샘플에 걸쳐 균등하게 구슬을 투여하기 위하여 철저하게 vortexing. 흐름 cytometer에 대한 분석 설정에서 약간의 변화도 획득 데이터에 큰 영향을 미칠 있으므로 수 있습니다 CAreful 관심은 교정과 매일 사용하는 4 cytometer의 설정에 지불해야합니다.
이 예비 데이터는 스테인드 샘플을 동결하면 (데이터가 게재되지 않음) 얻은 세포 농도에 영향을 나타나지 않는 것을 제안하면서,이 철저하게 테스트 아직 가지고도 주목해야한다. 이 잠재적 인 문제이지만, 모든 샘플이 일관된 방식으로 처리하기 때문에, 샘플 사이의 비교는 여전히 긴과 같은 자신있게 만들 수 있습니다.
착색 및 분석에 걸쳐 조심스럽게 샘플 추적 샘플 수백은 임상 실험의 맥락에서 처리 특히 특히 중요합니다. 데이터가 취득과 분석이 시작되면, 분석의 성곽에게 가능한 샘플 사이를 표준화하는 것이 중요합니다. 특정 인구의 형광의 일부 변화는 특히 서로 다른 자원 봉사자 사이에 발생할 수 있지만, 표준 게이트 위치는 appli 아르 그 설정해야합니다케이블 가능한 많은 샘플로합니다. 표준 위치에서 문을 이동하는이 문서와 셀 개수의 변화는 샘플 사이에 발생하는 경우를 결정할 때 고려되어야한다.
이 염색 방법은 한 항체 염색법 패널을 사용하여 주요 백혈구의 하위 집합을 열거하도록 최적화되었지만, 절차와 패널을 쉽게 특정 연구의 요구를 충족하도록 수정 될 수 있습니다. 혈액의 50 μl를 사용하여 제안 Trucount 기술 데이터 시트 절차, 반대로 우리가 제시하는 방법은 100 μl를 사용합니다. 이러한 수지상 세포 등 말초 혈에서 상대적으로 낮은 농도와 세포 인구를 공부하면 더 큰 혈액 볼륨을 사용하면 더 많은 이벤트가 유용 분석, 동안 취득 할 수 있습니다. 이전 연구 Trucount 50 μl를 사용하여 100 μl 혈액 볼륨을 11-12 통해 수지상 세포 인구를 열거했지만, 보고서는 합리적인 정확도가 적어도 400 positiv를 인수에 따라 달라집니다 것을 나타냅니다전자 인구 이벤트, 혈액 13 50 μl를 사용하는 경우이 종종 수지상 세포와 어려울 수 있습니다. 사용 혈액 볼륨이 더 특정 세포 유형 또는 착색 패널에 대한 분석 요구 사항을 충족 조정할 수 있습니다. 마찬가지로, 착색 패널 따라서 현재 (예를 들어, 추가 NK 세포 하위 집합 또는 규제 T 세포)의 경우, 여기에 표시된 패널에 의해 구별하지보다 구체적인 세포 하위 집합의 열거를 허용, 특정 세포 유형에 초점을 수정이 될 수 있습니다. 단일 패널의 사용은 얼룩 프로토콜을 단순화하고 스테인드 샘플 mislabeling 등 여러 패널과 관련된 오류를 줄일 수 있습니다. 여러 패널의 사용 오류에 대한 비용과 잠재력을 증가하지만, 특정 세포 유형에 맞는 별도의 패널은 더 자세한 phenotyping 및 / 또는 활성화 마커를 포함 할 수 있도록, 그들의 사용은 쉽게 multicenter 임상 실험에서 구현 될 수 고려 이전에 고려 디스크ussed.
| 마커 | 형광 | 회사 | 복제 |
| CD45 | 오전 청록색 | BD Biosciences | 2D1 |
| 3 번 CD | FITC | BD Biosciences | SK7 |
| CD8 | PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | SK1 |
| CD4 | Ax700 | BD Biosciences | RPA-T4 |
| HLA-DR | ECD | Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 | Immu-357 |
| CD14 | v450 | BD Biosciences | MφP9 |
| CD19 | PE | <TD> BD BiosciencesHIB19 | |
| CD16 | APC-H7 | BD Biosciences | 3G8 |
| CD56 | PE Cy7 | BD Biosciences | NCAM16.2 |
| CD11c | APC | BD Biosciences | B-ly6 |
| CD123 | PE Cy5 | BD Biosciences | 9F5 |
표 1. 모든 주요 말초 혈 백혈구의 인구를 결정하는 항체 염색법 패널.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는이 방법, 원고 및 비디오의 개발에서의 도움을 제시카 존스, 에리카 클락, 콘 스턴스 Ducar, 도나 스미스, 로이 루이스, 릴리 Apedaile, 조앤 Wiesner, 데빈 아담스, 코리 McBain와 스티븐 Voght 감사드립니다.
이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 CAVD 보조금 38,645 (MJM)와 건강 교부금의 국립 연구소 UM1 AI068618 및 AI069481 U01 (MJM)에 의해 지원되었다. EA-N. NIH 그랜트 T32 AI007140에서 지원됩니다. 우리는 그들의 관대 한 장비 기증을 위해 제임스 B. 펜들턴 자선 신탁 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
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