Summary
本稿では、大規模な自然免疫と適応白血球集団を列挙するために新鮮な全血で行わ表現型アッセイの染色と分析の手順を紹介します。我々は、多施設臨床試験のコンテキストでこれらの手順を実行する際の考慮事項を強調している。
Abstract
末梢血白血球の凍結保存は、広く臨床試験において免疫応答評価のための細胞を保持するために使用され、免疫学的な評価のしやすさと標準化のための多くの利点を提供していますが、このプロセスの有害な影響は、顆粒球、B細胞などの一部の細胞サブセットで観察されているされている、および樹状細胞1-3。新鮮な白血球をアッセイする細胞の in vivo の状態でのより正確な画像が得られますが、大規模臨床試験のコンテキストで実行することはしばしば困難である。新鮮な細胞アッセイは、時間がかかる場合には、それらのアプリケーションが原因で検査室の職員に求められる労働時間に非現実的なことができ、ボランティアのコミットメントと時間枠に依存していると。また、治験が複数の施設で実施された場合、アッセイを行うために必要なリソースと訓練研究所は臨床現場に十分に近接して配置されていない可能性があります。これらの問題に対処するために、我々は持っている開発表現型と末梢血内に主要な白血球集団を列挙するなど、アッセイよりも堅牢な細胞型に特異的な情報を得る工程; Trucountチューブ（サンノゼ、カリフォルニア州Becton Dickinson）を用いて使用することができる11色の抗体染色パネルをOPED全血球算定（CBC）または少数の細胞型のため染色Trucountチューブ用に設計された市販のパネルとアッセイ。染色手順は簡単ですが、新鮮な全血のみを100μlを必要とし、約45分かかり、それが実現可能な標準的な血液処理ラボが行うようにすること。それは、BD Trucount管技術データシート（から適合さバージョン2010分の8 ）。染色抗体カクテルは、中央アッセイ研究室で一括して事前に準備し、現場での加工ラボに出荷することができます。ステンドチューブを固定することができと多色フローサイトメトリー分析のための中央検査所への出荷のために凍結した。この染色パネルから生成されたデータは、介入との関係で時間をかけて白血球濃度の変化を追跡するために使用することができ、簡単にさらに関心のある特定の種類の細胞の活性化状態を評価するために開発される可能性がある。本稿では、新鮮な全血と多施設臨床試験を支える中心的なアッセイ研究室でこれらの染色されたサンプルを分析するための手順に染色を実行するために血液処理ラボの技術者が使用するプロシージャを示しています。それがHIVワクチン治験ネットワーク（HVTN）における臨床試験採血のコンテキストで実行されるビデオの詳細手順。
Protocol
注：光から蛍光色素標識抗体を保護するために、光をオフにしてバイオ安全キャビネット内のすべての手順を実行します。
1。抗体染色パネルの準備
- 抗体染色パネルが表1に記載されています。抗体濃度は全血で滴定することにより定義され、染色された表現型のサンプルを取得するために使用されるのと同じフローサイトメトリー機器および手順を使用する必要があります。
- 適切な染色力価が決定されると、ロックキャップチューブ内の単一の混合物の中にすべての抗体を結合します。 100μlに総量をもたらすために、フローの洗浄バッファー（2％熱不活性化ウシ胎児血清を含むダルベッコPBS）を追加します。染色されたサンプル数の混合物を拡大縮小します。この混合物を、最大8週間まで4℃で保存することができます。
2。染色
- 採取した血液は、広告内に他の目的に使用する場合もっと時間に敏感な手続きが残っている血液に行っている間、このアッセイにditionはさておき、アリコートを設定します。アリコートは有意な細胞を損失することなく静脈穿刺後4時間まで室温で保存することができます。
- 無傷ビーズTrucountチューブの底にペレットとラベルが染色されたサンプルを識別するためのチューブがあることを確認します。 HVTN臨床試験では、実験室データマネジメントシステム（フロンティア科学技術研究財団、アマースト、ニューヨーク州）は、染色したサンプルにラベルを付けて追跡するために使用されます。
- すべての試薬のロット番号と有効期限を記録します。チューブの袋の上にメーカーから提供されTrucountチューブビーズカウント数を記録し、袋の上にロット番号がチューブにロット番号と一致していることを確認してください。
- 正確にちょうど金属リテーナの上、Trucount管に全血100μlをピペットにピペット逆に使用します。チューブの側面に塗沫血を避けてください。
- 暗所で室温（15-30℃）で15分間Trucountチューブをインキュベートする。
- 必要に応じて、DIH 2 Oを用いて1Xに10のアリコート×FACS溶解溶液を希釈900μlの1×チューブにFACS溶解溶液を追加します。
- 混ぜて約15秒間低速で徹底的に管と渦をキャップ。実験室でのフィルムでチューブおよびシールの位置をロックにしっかりとキャップを押し下げます。
- -65℃チューブを-95℃で保存°Cのサンプルは、中央分析室への出荷のためか、家の中で分析のための準備が整うまで。サンプルは、少なくとも4週間は、この段階では安定しています。直ちにを出荷またはアッセイする場合diately、この工程を省略することができる。
3。出荷
注：以下の手順は、特に国際航空及び運送協会（IATA）の規則に従って船積みカテゴリB免除生物学的物質用に設計されたSAF-T-Pakは、（株）から絶縁された出荷システムを利用しています。染色が発生した場所と同じ場所にサンプルを分析する場合は、セクション4に進みます。
- サンプルは直ちに染色後出荷することができるか、一度それらが-65℃に凍結さ℃〜-95℃まで染色標本ボックスに箔と場所で完全に各チューブを巻き付けます。吸収物質で漏れ防止ポリ袋の中に染色標本ボックスを配置します。
- 袋の中でできるだけ少ない空気のようにタイベックの袋とシールに漏れ防止ポリ袋と中身を置きます。
- 内側の茶色のボックス内の標本パッケージ（二次包装内部の標本）を配置します。
- インナーブラウンBを配置シフトを防ぐために、インデントにそれを固定している発泡スチロールの胸部内の牛、。
- ドライアイス（約8キロ）で発泡スチロールの箱を記入し、胸にしっかりと蓋を置く。
- 適切なドライアイス（UN1845）のマーキングとしっかりとテープ生物由来物質として梱包箱や船、カテゴリBを（UN3373）のIATA PI-650の指示に従ってください。
- 受信すると、サンプルは-65℃で保存するC -95°Cまで、彼らが分析されるまで。
4。解凍およびフローサイトメトリー分析
- フローサイトメーターで収集する前に、暗闇の中で、室温で解凍し、冷凍庫から染色されたサンプルを削除します。複数のサンプルについてのデータを収集する場合は、チューブが1時間以上各室温で座ってされないように解凍ずらすことによって、すべてのチューブのためのプロセスを標準化しています。
- サンプルは、例えばBD LSRとして適切なフィルターを装備して4つのレーザーフローサイトメーターを用いて取得しておく必要がありますⅡ。データ収集のための標準的な4メーターのキャリブレーションおよび蛍光補正メソッドを使用します。
注意：コレクション5時に前方散乱または側方散乱のしきい値を設定しないでください。 Trucountビーズは、分析中に計上されないように、ビーズのサブセットを引き起こし、これらのパラメータの可能な限り低いしきい値の設定値を下回ることができます。しきい値を設定する機器によって必要な場合は、可能な限り低いアムシアンチャネルのしきい値を設定します。パネルで染色し、CD45 +白血球もアムシアンチャンネルで蛍光を発するアムシアン陽性、Trucountビーズとなりますので、これは適切に収集することができるため、関連するすべてのデータを考慮するべきです。
- フローサイトメーター上でロードする前に、5秒間ボルテックスサンプルチューブを。 Trucountビーズは多くのチャンネルで高い蛍光を発する。ゲートPE Cy5およびAPC（2 coloのために非常に重陽性である人口を見つけることによって、収集時にビーズ最も容易に細胞からビーズを区別するRS）は、インスツルメンテーションによって異なります。少なくとも20,000ビーズが取得されるまで、停止ゲートとしてビーズゲートを選択し、レコードデータ。
- そのようなFlowJo（Treestar;オレゴン州アッシュランド）のような適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。 図1は代表的な制御採血異なる白血球集団の分析のために利用ゲーティング方式を示しています。
5。 Trucount計算
- 各Trucount管は蛍光ビーズの凍結乾燥ペレットを含んでいます。チューブに液を添加し、ボルテックスした後、ビーズが均等にサンプル全体に分散になる必要があります。ペレットのビーズの数はロット番号により若干異なりますが、チューブ用の収納袋で見つけることができます。
- ゲートTrucountビーズと細胞集団を各集団のイベントカウントを決定するために、図1に示すように。イベントiの数を比較するn個のチューブ内に元々ビーズの総数にビーズゲートでは、各人口の絶対濃度（ すなわち 、細胞/μl）を決定するために使用できるサンプル回収し、の比率を決定することができます。細胞濃度（＃細胞/μlの全血）= [/＃人口イベント（＃ビーズイベント/＃ペレットの総ビーズ）] /100μlの次の式は、この目的のために使用することができます。
6。代表的な結果
図1ゲーティング方式は、健康なボランティアからの代表的なデータを示す主要な白血球集団の分析のために利用した。 A）はTrucountビーズは、（i）gatedおよび細胞から排除されています。顆粒球（ii）が線引きされており、lympohcytesと単球は3 popluationsに分かれています：CD14負のリンパ球（iii）では、すべてのCD14陰性細胞（IV）、および非リンパ球（v）である。 B）は、CD14陰性のリンパ球は、CD4 + T細胞（VI）、CD8 + T細胞（VII）、B細胞（ⅷ）、CD56明るいNK細胞（IX）、CD56薄暗いNK細胞（x）、およびCD56陰性NK細胞を区別するためにゲートさ（XI）。 c）すべてのCD14陰性細胞は、骨髄（XII）と形質（XIII）樹状細胞を区別するゲートさ。 d）非lympocytesは非古典（XIV）、中間（XV）、古典（XVI）の単球を区別するためにゲートされる。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
（ 例えば 、NKT細胞または好中球）、図1に示されていない、より具体的な細胞サブセットはまた、我々が提示するパネルを使用して区別することができ、かつゲーティング方式は展開したり、特定の研究ニーズに合わせて変更することができます。示される特定のゲーティングの手順では、このメソッドに固有のものです。特に注目すべきは、インクルージョンのゲートと除外ゲートがTrucountビーズの周りに描かれ、互いに、カウントするためのゲートビーズを1つ、および細胞分析（ 図1A）からビーズを除外する1つの上に置かれています。また、（ 図1A）CD45発現および側方散乱を用いて、これらの細胞はしばしば必要であるゲー、彼らは前方散乱および側方散乱による末梢血単核細胞にあるようにリンパ球、単球、顆粒球は、同じように簡単に全血中で区別されていないためです。 CD45および側方散乱を用いたリンパ球と単球から分離することができませんでした汚染顆粒球（円内）が高いCD16発現（ 図1Cおよび図1D）によっていくつかのプロットで区別することができる。汚染顆粒球の数は通常小さく、それらは単球とNK細胞ゲーティングを妨げることはありません。
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Discussion
本稿では、フローサイトメトリーによって新鮮全血中の白血球集団を列挙するためのビーズをベースにした方法を提示し、一元的なサンプル分析による多施設臨床試験での使用に必要なパラメータをカバーしています。この方法は、上に構築し、BD Trucountプロトコルを最適化し、多施設臨床試験の設定で、その信頼性の高い使用を可能にします。染色アッセイはシンプルであり、それは血液処理検査技師のための実現可能なことを実行するために、分析のために中央のアッセイラボにサンプルを凍結し、出荷すること、実行するために約45分かかります。アッセイは、時間とコストのかかる処理PBMCの必要性を排除し、標準的な表現型アッセイよりもはるかに少ない量を使用した全血の唯一の100μlを、必要とします。また、新鮮な全血を使用することによって、このアッセイは、より正確に細胞の in vivo の状態で描いていると、いくつかの細胞型で観察された凍結保存の有害な影響を排除の1-3。この染色法では、細胞濃度の正確な測定値を生成しますが、CBCと他のカウントの方法よりもはるかに多くの種類の細胞を区別する利点と。正確で一貫性のある結果を得るための鍵は慎重にプロトコルの重要なステップを標準化するために、発見されているすべての異常がエラーの原因にさかのぼることができるようにするために、すべてのステップを追跡ドキュメントシステムを利用することである。
このアッセイから得られたデータの質に影響を与えるプロセス全体の複数の重要なステップがあります。まず最初に、それは、それが染色されている時間に引かれた時点から、治療や血液の取り扱いの標準化は、以前に処理PBMCを6で報告されているものと同様に重要である。血液は臨床現場でのコレクションチューブに格納されており、周囲温度で処理ラボに運ばれたときに我々は、一貫性のあるデータを得るため、染色がある採血後4時間以内に行われ、染色されたサンプルは、中央アッセイラボにドライアイス上で出荷されています。加えて、中央研究所で抗体カクテルを作り、現場での加工ラボに送信することによって、我々は、サイト間の一貫性を確保し、それが試験サンプルを染色するために使用される前に制御採血上の各カクテルをテストすることができます。それは中央アッセイラボは、このプロセスを標準化することが重要です。そこで我々はかつて成分抗体が陽性および陰性集団7との間の距離を最適化するために滴定されることをお勧めし、抗体の同一ロットは各マーカーの一貫した染色レベルを維持するために、臨床試験のすべてのサンプルの染色に使用される。これが不可能な場合（ 例えば 、抗体の製造業者からの利用可能性の欠如）、抗体の各々の新しいロットが適切にフローサイトメトリーデータは、以前のロットを使用して得られたものに匹敵するであろうことを保証するために滴定されるべきである。中央研究所と現場での加工の研究室では、特にタンデム色素8月9日で、出荷及び保管抗体カクテルを4℃と発生する可能性がある劣化を最小限にするために、光の露出を避けるために細心の注意を払う必要があります。
このアッセイで得られたデータの精度は、フローサイトメーター上の染色手順とサンプル収集中に、いくつかの重要なステップに依存します。特に注目すべきなのは、Trucount管への血液のピペッティング正確な逆が不可欠であり、血液量の小さな違いが細胞サブセットの計算された濃度に大きな影響を及ぼす可能性があります。抗体カクテルを追加した後、低速でボルテックスし、BD FACS徹底的に試薬を混ぜて溶解させることも重要です。同様に、買収は正確なカウント10ために不可欠である前に、サンプル全体に均等にビーズを分配するために徹底的にボルテックス。フローサイトメーターで解析設定のわずかな変化でも、取得したデータに大きな影響を持っているので、可能なCAreful注意が日常的に使用する4でメーターのキャリブレーションおよびセットアップを払うべきである。
これは予備的なデータは、染色したサンプルを凍結する（データは示さず）得られた細胞濃度に影響を与えるように見えないことを示唆しながら、これは徹底的にテストされてまだ持っていることにも留意すべきである。これは潜在的な懸念事項であるが、サンプル間の比較は、依然としてすべてのサンプルが一貫した方法で処理されている限り、自信を持って行うことができます。
染色と分析を通して注意深い追跡サンプルはサンプルの数は、臨床試験のコンテキストで処理されている場合は特に、特に重要である。データを取得し、分析が開始されると、それはサンプル間で可能な限り解析ゲートを標準化することが重要です。特定の集団の蛍光の一部のばらつきが特に異なるボランティアの間、発生することがありますが、標準的なゲートの場所がアプリであることを設定する必要がありますできるだけ多くのサンプルに接続します。標準の位置からゲートのシフトいずれも文書化され、細胞数の変化が検体間で発生するかどうかを判断する際に考慮すべきである。
この染色法は、1つの抗体染色パネルを使用して、主要な白血球サブセットを列挙するために最適化されましたが、手順とパネルは簡単に特定の研究ニーズに合わせて変更することができます。血液50μlを使用することを提案Trucount技術データシートの手順に反して、我々は本発明の方法は、100μlを使用しています。樹状細胞などの末梢血中の比較的低濃度で細胞集団を研究すると、大きな血液量を使用することにより、複数のイベントが有用で分析中に取得することができます。以前の研究では、Trucountが50μlを用いて、100μlの血液量11から12を介して、樹状細胞集団を列挙しているが、報告書は、合理的な精度が少なくとも400 positivを取得するに依存していることを示し電子の集団イベント、および血13の50μlを使用しているとき、これは頻繁に樹状細胞では困難な場合があります。使用される血液量は、さらに、特定の細胞型または染色パネルの分析要件を満たすように調整することができます。同様に、染色パネルは、このように、現在、ここに示されているパネル（ 例えば 、追加のNK細胞サブセットまたは調節性T細胞）によって区別されない、より具体的な細胞サブセットの列挙を可能にする、特定の種類の細胞に焦点を当てるように変更される可能性があります。単一のパネルを使用すると、染色プロトコルを簡素化し、このような染色サンプルの偽装など、複数のパネルに関連するエラーを低減します。複数のパネルを使用すると、エラーのコストと可能性を増大させるが、特定の細胞型に合わせた別のパネルには、より詳細な表現型解析および/または活性化マーカーを含めることができるよう、そして、彼らの使用は簡単に多施設臨床試験で実装することができました、考慮に入れて以前に考慮ディスクussed。
| マーカー | フルオロフォア | 会社 | クローン |
| CD45 | アムシアン | BD Biosciences社 | 2D1 |
| CD3 | FITC | BD Biosciences社 | SK7 |
| CD8 | PerCP Cy5.5 | BD Biosciences社 | SK1 |
| CD4 | AX700 | BD Biosciences社 | RPA-T4 |
| HLA-DR | ECD | ベックマン·コールター | IMMU-357 |
| CD14 | V450 | BD Biosciences社 | MφP9 |
| CD19 | PE | <TD> BD Biosciences社HIB19 | |
| CD16 | APC-H7 | BD Biosciences社 | 3G8 |
| CD56 | PE Cy7 | BD Biosciences社 | NCAM16.2 |
| CD11cは | APC | BD Biosciences社 | B-ly6 |
| CD123 | PEはCy5で | BD Biosciences社 | 9F5 |
表1主要なすべての末梢血白血球集団を決定するために、抗体染色パネル。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、この方法では、原稿やビデオの開発における彼らの支援のためのジェシカ·ジョーンズ、エリカ·クラーク、コンスタンスDucar、ドナ·スミス、ロイ·ルイス、リリーApedaile、ジョアンウィーズナー、デヴィン·アダムス、コーリー·マクベインとスティーブンVoghtに感謝します。
この作品は、ビル·アンド·メリンダ·ゲイツ財団の助成金CAVD 38645（MJM）と健康の補助金の国立研究所UM1 AI068618とAI069481 U01（MJM）によってサポートされていました。 EA-N。 NIHグラントT32 AI007140によってサポートされています。我々は彼らの寛大な機器の寄付のためにジェームズ·B·ペンドルトン公益信託に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
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