Summary
פרוטוקול שלב אחר שלב זה מנתח התנהגות שלילית geotaxis דרוזופילה באמצעות מערכת אוטומטית צילינדר רב מארח מאות זבובים ומסנכרן פעולתם על ידי מנוע חשמלי. בעת סינכרון, התנהגות לטוס geotaxis שלילי זה לבדיקה, דיגיטלית המוקלט ולאחר שנותחה שימוש בתוכנת RflyDetection בעיצוב עצמי.
Abstract
מחלות ניווניות קשורות לעתים קרובות אובדן הדרגתי של יכולת תנועה מופחתת תוחלת החיים, תלויי-גיל הקשורים ניוון מוחיים. כדי להבין את המנגנון של אלה הסלולר אירועים, ואת יחסיהם סיבתי אחד עם השני, דרוזופילה melanogaster, עם כלים גנטיים מתוחכמים שלה מגוון תכונות התנהגותיות, משמשים כמודלים מחלות להערכת פנוטיפים ניווניות. כאן נתאר שיטת תפוקה גבוהה כדי לנתח את התנהגות דרוזופילה geotaxis שלילי למבוגרים, כאינדיקציה אפשרי פגמים מוטוריים הקשורים הקשורים ניוון מוחיים. מכונה אוטומטית של נועד ופיתח לסינכרון לטוס כונן באמצעות דחף חשמלי הראשונית, מאוחר יותר ומאפשר את ההקלטה של התנהגות שלילית geotaxis במהלך מספר שניות עד דקות. תמונות מתוך הווידאו המוקלט דיגיטלית מעובדים אז עם התוכנה RflyDetection בעיצוב עצמי עבור נתונים סטטיסטיים מניפולציה. שונה וזמינותו geotaxis שלילי מבוקר באופן ידני בהתבסס על זבוב אחד, פרוטוקול זה מדויק, מהיר, תפוקה גבוהה מאפשר רכישת נתונים יותר מאשר מאות זבובים בו זמנית, מספקים גישה יעילה לקידום שלנו להבנת המנגנון הבסיסי של גינקולוגיות הגירעונות הקשורים הקשורים ניוון מוחיים.
Introduction
פותחו מגוון של פרוטוקולים, שיטות לניתוח התנהגות טיפוס למבוגרים דרוזופילה . די מייגעת, הניתוח המסורתי בעיקר כרוך לשים זבוב אחד לתוך המבחנה בודדים ומשתמש כוח ידני כדי הקש על זבובים למטה עבור סינכרון1,2,3,4. זה מייגע, זמן רב, מתאימים ללימודי תפוקה גבוהה גדולים, יש פוטנציאל וריאציות של הכוח ידנית פעם לנצל את הזבובים, כמו גם מגבלות אחרות. לשיפור וזמינותו, פותחה assay מהירה איטרטיבי שלילי Geotaxis (טבעת) אשר מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה זבובים רבים בבית באותו זמן5. עם זאת, וזמינותו מחייבת עדיין כוח ל"שבירת באופן ידני כדי לסנכרן פעולה לעוף. הגרסה שלנו של הטבעת וזמינותו, מתוקן על וזמינותו הקודם, כולל בסיס מתכת אירוח מרובים בקבוקונים המכילים לטוס באופן אוטומטי נשלט על ידי מנוע חשמלי לנהוג סינכרון לטוס6. על הקלטה, הזבוב טיפוס מיד לאחר סינכרון נרשם אז נותחה באמצעות תוכנת בעיצוב עצמי. Assay טבעת האוטומטי שלנו יש חיסלה את תהליך מייגע מהגידולים באיסוף מידע של זבוב אחד, אחד בכל פעם, והוא מופעל תהליך רכישת נתונים כדי להיות יעיל יותר. בנוסף, וזמינותו טבעת אוטומטיות ננקטה מספר מחקרים כדי להבהיר את המנגנון הבסיסי, אלצהיימר, פרקינסון, אימות הגישה עם יעילות גבוהה7,8,9 .
במאמר זה נדגים וזמינותו טבעת אוטומטית באמצעות DDC-Gal4 מונחה זבובים RNAi. DDC-Gal4 הוא קו Gal4 לבטא במפורש דופאמין (DA), הנוירונים תכולה, ובכך מייצג כלי נהדר עבור ניתוח ההשפעות ג'ין היעד המשויך גירעונות גינקולוגיות הנלווים הקשורים ניוון מוחיים10. בנוסף, אנו משלבים את UAS-Dicer2, קו לטוס משפר את יעילות RNAi, כדי ליצור את UAS-Dicer2; DDC-Gal4 כלי הקו. הזבובים RNAi אנו בוחרים להשתמש הוא auxilin (aux) RNAi v16182 (auxR16182), גן כי בעבר זיהינו שהפגינו אפקט על טוס גינקולוגיות פעילות8. auxGFP זבובים מוכנים גם ניתוח השפעות רבות על ביטוי aux . אנחנו נראה כיצד להשתמש וזמינותו טבעת אוטומטית כדי למדוד לטוס geotaxis שלילי, להציג את התוצאות ולדון כל השלכות רכשה את התוצאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-אוסף לטוס
- לשמור על הזבובים על תקן מזון לעוף-25 ° C, 70% לחות ו- h 12 h 12/כהה מחזור.
- לאסוף UAS-Dicer2; DDC-GAL4 virginsunder לעוף פחמן דו-חמצני (CO 2) הרדמה.
- לחצות את בתולות אלה 2 בן יום זבובים זכרים בוגרים נושאת את אחרים הבאים: UAS-mCD8GFP (בקרה), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (aux ביטוי), ו auxR 16182; auxGFP (חילוץ), זכר: נקבה יחס של 1:2.
- בנפרד לאסוף לאחרונה eclosed זכרים ונקבות ב 3 vials כל קבוצה לכל ניסוי, הצבת 10 זבובים כל בקבוקון לטוס רגיל עם אוכל סטנדרטי-25 מעלות צלזיוס
- בהתאם הניסוי, שמור שנאספו טס עד 35 ימים, ולהשתמש בהם לניתוח טבעת אוטומטיות ביום 5, 15, 25, ו- 35-
2. אוטומטית Assay טבעת
- להעביר 10 זבובים שנאספו (יוניסקס) לכל גנוטיפ לתוך כל בקבוקון ולאחר מכן לאבטח את המבחנה עם בורג. לנתח שליטה זבובים וזבובים נושאים אחרים שונים ביחד עבור כל ערכה של ניסויים (עד 10 שבקבוקי בו זמנית, 10 זבובים בכל מבחנה).
- להפעיל את המצלמה הדיגיטלית הניח לפני המנגנון, התחל הקלטה פעם זבובים הם כל טעון ומוכן.
- לאחר מתן אפשרות 1 דקות לזבובים להתיישב בקבוקונים, להפעיל את הבקר שלב השולט הנהג צעד; זה מניע מנוע חשמלי קטן כדי לשלוט את הידית המצורפת כך זה ברצף עולה, ברזי המנגנון 4 פעמים ב 2 s. ראה איור 1.
- לאחר הקשה, שימו לב כי הזבובים מתחילים לעלות על הקיר. להבטיח כי הקלטת ממשיכה.
- חוזר הסינכרון כפי שמתואר בשלב 2.3-ב 60-s מרווח עבור ניסויים ברציפות 3 עד 5.
- חזור על הניסוי עבור 5, 15, 25, ו זבובים בן 35 יום. לערוך ניסויים עצמאית לפחות 3 עבור כל קבוצה, כל ניסוי לפחות 30 שנאספו זבובים (3 מבחנות).
3. ניתוח נתונים
- ייבוא הווידאו המוקלט לתוך המחשב.
- לקחת תמונה של הוידאו-6 s לאחר הקשה, למשפט לכל.
- לייבא את תמונת בזק התוכנה RflyDetection (ראה איור 2), באמצעות ' קובץ ' תפריט.
- להגדיר את תוכניות בסיסיות העליון והתחתון של הבקבוקון בדיוק על ידי שימוש בסמל בסיסית בסרגל הכלים ולאחר מכן באמצעות הסמן כדי לסמן את התוכניות הבסיסיות העליון והתחתון על התמונה.
- קלט את המספר של זבובים לכל מבחנה (למשל, כאן 10) לתוך ' Flys ב מלבני ' שדה וכל המבחנה אורך (למשל, 14 ס מ כאן) ' גובה הצינור ' שדה בתוך הבר הגדרות.
- הערה כי העמדות לטוס בודדים הם זוהה ולא עם נקודות על המסך עבור כל בקבוקון תוויות.
הערה: איור 2 מציינת את העמדות של כל לחיצות כפתור תפריט.
- הערה כי העמדות לטוס בודדים הם זוהה ולא עם נקודות על המסך עבור כל בקבוקון תוויות.
- הערה כי התוכנה באופן אוטומטי קובעת את המרחק טיפוס עבור כל זבוב, מציג את הערכים בממוצע של 10 זבובים בכל מבחנה בטבלה שבלוח הימני. (ראה איור 2)
- לעבד את המספר טיפוס עם תוכנה סטטיסטית (למשל, פריזמה) לצורך ניתוח סטטיסטי נוסף.
- המתנה הנתונים כטקסט מתכוון ± ב- SEM.
- לחשב p-ערכים של מובהקות (מסומן בכוכביות, * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001) באמצעות חד-כיווני אנובה עם Bonferroni מרובים השוואה ילדי
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מאמר זה מדגים את השימוש assay טבעת אוטומטיות בהערכת התנהגות לטוס geotaxis שלילי. בניגוד וזמינותו הטבעת הקודמת, וזמינותו שלנו כולל מכשירים אוטומטיים מספק כוח חשמלי כדי לסנכרן פעולה לטוס ומנתח עד מאות זבובים בו זמנית (איור 1). ניתוח של Dicer2; DDC > auxR16182 זבובים הראה על ירידה תלויי-גיל המרחק טיפוס במסגרת זמן 6-s לזבובים גם זכר וגם נקבה, רומז aux ביטוי בנוירונים דא הוא חיוני לפעילות גינקולוגיות לעוף. טיפוס היכולת לא נראה משפיע על auxGFP ביטוי בנוירונים DA, ביטוי משותף של auxR16182 , auxGFP בנוירונים DA הציל את פנוטיפ RNAi (איור 2 , איור 3). בנוסף אימות וזמינותו טבעת אוטומטיות כמו בגישה תפוקה גבוהה ויעילה להערכת הליקויים המוטוריים הקשורים ניוון נוירון DA, תוצאות אלה גם לציין כי גישה זו אוטומטית הוא שימושי לזיהוי פוטנציאל מחלת פרקינסון סיכונים גורמים ומספק רמז על תפקידם ניווניות.
איור 1. המנגנון האוטומטי טבעת. (A ו- B) חזית ונוף האחורי של המנגנון: שקע (1), מוט אנכי פלדה (2), בורג אבטחת התחתית על מסגרת (3), צלוחיות פלסטיק שקוף (4), קצף בר (5), בסיס מתכת (6), מיקרו-צעד הנהג (7), בקר אלקטרוני (8), הבורר (9) מנוע חשמלי קטן (10), את הידית המצורפת מנוע חשמלי קטן (11). הגודל של המסגרת מתכת מלבני הוא 46 ס"מ × 26 ס"מ × 16 ס מ, מחזיק 10 שקופה מפלסטיק בקבוקונים (2.1 ס מ קוטר, 14.5 ס מ גובה) מאובטח עם ברגים. כדי להפעיל את המנגנון, הלחיצה הראשונה על הבורר (9), המפעיל (8), (7), ו- (10) כתוצאה מכך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. ניתוח של נציג תמונה תמונה על-ידי RflyDetection. תמונת בזק מיובאים לתוך התוכנה RflyDetection ומצוין פעולה עבור כל סמל-הממשק עם טקסט מימין. לאחר הגדרת התוכניות הבסיסיות של העליון והתחתון, התוכנה באופן אוטומטי מזהה, מסמן את מיקום לעוף בתוך המבחנה. המרחק טיפוס (ס מ) 6 s עבור כל זבוב ואת הערכים בממוצע עבור כל בקבוקון מוצגים בטבלה. מספרים אלה מיובאים ואז לתוך התוכנה הסטטיסטית לצורך ניתוח סטטיסטי נוסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. מהגרפים סטטיסטי מראה ירידה תלויי-גיל לעוף יכולת טיפוס כאשר הביטוי aux downregulated בנוירונים דה- וזמינותו טבעת אוטומטיות שימש כדי ניתוח התנהגות שלילית geotaxis זבובים נושאת את אחרים הבאים: auxR16182/ + (לא Gal4), UAS-Dicer2; DDC-Gal4 זבובים עבר w1118 (בקרה) UAS-mCD8GFP (בקרה), auxR16182, auxGFP, auxR16182; auxGFP (חילוץ). שימו לב כי גם זכר וגם נקבה זבובים טיפס לאט יותר באופן משמעותי לאורך זמן כאשר הביטוי aux הוקטן ב DA נוירונים. הגירעונות גינקולוגיות חולצו על reintroducing ביטוי aux . זבובים 5, 15, 25 ו בן 35 יום היו העריכו. זכר (A) וזבובים (B) הנקבה מוצגים בנפרד. אגדות עם תוויות גנוטיפ התואם לצבעי בר שונים מוצגים בצד הימין. הנתונים מוצגים ± ב- SEM. רשע p-ערכים של משמעות (המצוין עם כוכביות, * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, ns: אין כל משמעות בר נמשך מתחת הכוכביות כדי לציין את האובייקטים להשוות) חושבו השוואת mCD8GFP שליטה או aux RNAi באמצעות חד-כיווני אנובה עם Bonferroni מבחן השוואה מרובים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
וזמינותו טבעת אוטומטיות המתוארים כאן מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות לטוס geotaxis שליליות עבור מאות זבובים בו זמנית. בעבר קיימות אסטרטגיות לניתוח טיפוס למבוגרים לערב תצפיות של זבוב אחד ב המבחנה בודדים, עמדה לטוס מזוהה באופן ידני לפי העין. תהליך מייגע למדי זה עלול לעתים לגרום מהבנה שגויה או פירוש מוטעה של הנתונים, כמו גם עבודה שדורשת. Assay טבעת האוטומטי שלנו מתחיל בלחיצה פשוטה, המנגנון מסנכרנת באופן אוטומטי ומודד ביכולת טיפוס של זבובים עד 100. הסינכרון חשמלי מספק אמצעים מדויקים יותר כדי לשלוט זמן ופרמטרים אחרים, אז לכידת הכוללת של טס טיפוס למבוגרים תהליך ניתן למדוד בקפידה.
בשלב הבא, עם התוכנה שלנו בעיצוב עצמי RflyDetection, המיקום המדויק לעוף ניתן לזהות. התוכנה לוקח אל תוך התחשבות 2D הכולל המבחנה באזור (שנקבע על ידי מסגרת מלבנית), וכן תוכניות בסיסיות של העליון והתחתון, לפני רכישת מיקומים עבור כל הזבובים בתוך השטח ומציגה אותם כנקודות. בנוסף, חישוב אוטומטי המרחק טיפוס והערכים בממוצע מאפשר מניפולציה על הנתונים למהיר וקל יותר. ערכות נתונים על קבוצה גדולה של זבובים יכולים להיות יכולים אסף וניתח בתוך מסגרת זמן סביר7,8,9.
למרות תלויי-הגיל הירידה הפעילות טיפוס המשויך הקשורים ניוון מוחיים מתוארת כאן, וזמינותו הזה יעיל באותה מידה בניתוח פעילות גינקולוגיות הרלוונטיים ליקויים התפתחותיים. לשם כך, וזמינותו הטבעת האוטומטית היא גישה שימושי ויעיל לניתוח דרוזופילה geotaxis שליליות בכל שלב למבוגרים, וכן גם המדינה רגיל או פתולוגית של תפקוד המוח. בכל זאת, וזמינותו. הגביל את השימוש בניתוח לחלוטין מכל הזבובים למרות שהתוכנה RflyDetection של היכולת באופן ידני לזהות בטעות uncaptured אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למרכז מניות בלומינגטון ומרכז וינה דרוזופילה RNAi מניות לעוף. המצאתם המנגנון הטבעת שייך מכון מחקר מתקדם של שנגחאי, האקדמיה הסינית למדעים. בקשות בגין התוכנה RflyDetection צריך להיעשות כדי חואנג פו-דה (ראה מחבר הרשימה). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי בסיסי מחקר תוכנית של סין (973 תוכנית 2013CB945602) נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31270825 ו- 31171043). אנו מודים הו חברי המעבדה דיונים והערות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
- Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
- Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
- Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
- Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
